用於治療和/或預防腦梗塞的含有重組人胰激肽原酶的藥物的製作方法
2023-05-01 05:47:41
專利名稱:用於治療和/或預防腦梗塞的含有重組人胰激肽原酶的藥物的製作方法
技術領域:
本發明涉及一種重組人胰激肽原酶藥物、其製備方法及在製藥中的用途。更具體 地說,本發明涉及利用分子生物學技術結合大規模細胞培養方法製備重組人胰激肽原酶, 本發明還涉及含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物。本發明進一步涉及重組人胰激肽原酶 在製備治療和預防腦梗塞的藥物中的用途。
背景技術:
人胰激肽原酶能作用於激肽原底物,使之釋放出具有血管活性的激肽,激肽與靶 器官上特定受體結合能產生一系列生物效應,如擴張血管增加血流量、改善血液循環的作 用,並且還有增加紅細胞的變形性和抑制血小板聚集、延長再鈣化時間改善血液粘稠的作用。目前已上市的人尿來源的激肽原酶產品,即人尿激肽原酶,是從人尿中提取的糖 蛋白。其胺基酸組成與人胰激肽原酶的胺基酸序列相同,但是,從人尿中提取的激肽原酶蛋 白的162位點上存在Glu/Lys兩種胺基酸,這種胺基酸的多態性對酶活性的影響未知。臨 床上使用人尿激肽原酶發現靜脈滴注過快會導致患者血壓急劇下降等不良副作用,給病人 帶來了一定風險。另外,人尿收集困難,人尿蛋白資源十分有限。其來源範圍越廣,成分越 複雜,可能含有病毒等成分。同時歐美等高端市場普遍不接受人尿來源產品。分子生物學技術的發展使得利用宿主細胞表達並大規模生產重組蛋白成為可 能,目前利用基因表達方法生產重組蛋白已代替了傳統的從自然資源中提取天然蛋白方 法。對於糖蛋白,一般是將編碼糖蛋白的基因轉入哺乳動物細胞,特別是中國倉鼠卵巢細胞 (Chinese Hamster Ovary,CH0)細胞,以生產與天然蛋白接近並具有生物活性的重組蛋白。KLKl基因位於染色體19ql3. 4,其大小為6. 55kb,編碼區為874bp。KLKl全長基 因編碼262個胺基酸組成的激肽酶原(即前體蛋白),包括17個胺基酸信號蛋白,7個氨基 酸酶原片段和238個胺基酸成熟蛋白。激肽酶原在體內進一步被蛋白酶切割和加工成為具 有生物活性的成熟人胰激肽原酶。KLKl基因在胰腺、腎臟和唾液腺表達最高。人胰激肽原酶是一種糖蛋白,分子中含有14. 4%的糖,其結構中包括三個N糖基 化位點,分別位於Asn78,Asn84及Asnl41。研究表明,人胰激肽原酶在CHO細胞中表達時, CHO大規模培養條件影響其糖基化程度,進而也影響到其體內的活性。因此,選擇適當的 CHO培養條件,製備活性相似、副作用小的重組人胰激肽原酶成為科研者的最新攻克難題。
發明內容
本發明通過分子生物學技術克隆KLKl基因,將該基因轉入宿主細胞進行表達,並 用細胞培養或發酵方法大量生產含有重組蛋白的細胞,從細胞或胞外分泌液中提取重組人 胰激肽原酶。優選,利用大規模培養CHO細胞製備重組人胰激肽原酶。進而製備由這種重 組人胰激肽原酶為活性成分的藥物組合物。該重組人胰激肽原酶在臨床上有多種用途,與人尿來源的激肽原酶相比活性相似、副作用小,尤其是對血壓下降影響更小的特點。本發明 製備的含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物可有效用於治療和/或預防腦梗塞。本發明是通過細胞培養或發酵方法獲得一種重組人胰激肽原酶。具體說,本發明 是利用分子生物學技術克隆KLKl基因並獲得表達重組人胰激肽原酶的宿主細胞;利用大 規模細胞培養或發酵方法進行表達重組人胰激肽原酶的宿主細胞的大量生產,採用親和層 析方法純化獲得重組人胰激肽原酶。優選,表達重組人胰激肽原酶的宿主細胞是哺乳動物細胞,特別是CHO細胞,該宿 主細胞的大規模培養採用灌注反應器進行灌注培養。通過優化培養條件提高了細胞生長密 度和表達產物的糖基化程度。本發明的目的是提供一種含有重組人胰激肽原酶的藥物。本發明的另一目的是含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物用於製備治療和/或 預防腦梗塞的藥物的用途。本發明的目的是通過以下技術方案實現一種含有重組人胰激肽原酶的藥物,其含有治療有效量的作為活性成分的重組人 胰激肽原酶和可藥用輔料,活性成分與藥用輔料重量比例為1 1 1 15000。其中所述重組人胰激肽原酶是由238個胺基酸殘基組成一條單 鏈,N-末端和C-末端胺基酸殘基分別為異亮氨酸和絲氨酸,分子中含有5對 S-S鍵,通過SDS-PAGE電泳測定,其分子量為35. 0-44. OKDa,其一級結構為
組人胰激肽原酶分子中含有5對S-S鍵,分別為Cys7_Cysl50,Cys26_Cys42,Cys29_Cysl96, Cysl61-Cysl75以及Cysl86-Cys211,等電點約為4· 0,分子中含有14. 4%的糖,結合位點分 別位於 Asn78、Asn84 及 Asnl41。該重組人胰激肽原酶是一種糖蛋白,糖基化結合位點分別位於Asn78、Asn84及 Asnl410該重組人胰激肽原酶一級結構中的粗體字母(Glu)表示162位點上的胺基酸。本發明的重組人胰激肽原酶的糖基化程度主要取決於糖鏈中唾液酸的水平。通過 SDS-PAGE電泳測定,現有的人尿激肽原酶分子量為39. 0-43. OKDa,本發明的重組人胰激肽 原酶為35. 0-44. OKDa,重組人胰激肽原酶的電泳帶區域比現有的人尿激肽原酶寬,說明重 組人胰激肽原酶由於其糖基化程度的不同,尤其是唾液酸化程度的不同,即重組人胰激肽 原酶比現有的人尿激肽原酶具有更複雜的糖基化組成。另外,本發明製備的重組人胰激肽 原酶是由單一肽鏈組成的蛋白,其162位點上只表達Glu—種胺基酸;而現有的人尿激肽原 酶蛋白是由兩條肽鏈組成的蛋白混合物,其162位點上存在Glu/Lys兩種胺基酸,這種氨基 酸的多態性對酶活性的影響尚在研究中。本發明的重組人胰激肽原酶製備包括利用基因重組技術克隆KLK1DNA、構建含有編碼該基因DNA序列的表達質粒、大規模細胞培養或發酵方法生產表達重組蛋白的宿主細 胞和重組蛋白的純化。本發明重組人胰激肽原酶的製備方法如下1.根據KLKl的DNA序列設計引物,採用RT-PCR方法從人胰腺擴增KLK1DNA序列, 該DNA序列包括cDNA(序列表中序列1,GenBank NM_002257)、基因組DNA(序列表中序列 2)和人工合成的DNA。2.將KLK1DNA克隆到表達載體,構建含有KLK1DNA的表達質粒。表達載體包括原 核表達載體(如pET-32a)、酵母表達載體(如pPIC9)或真核表達載體(如pcDNA3. 1)。對 於真核表達載體的情況,為了提高重組人胰激肽原酶的穩定性和延長其半衰期,在真核表 達載體插入了人IgGl Fc片段,構建含有KLKl和Fc片段的真核表達質粒。3.將含有KLK1DNA表達質粒轉入宿主細胞,宿主細胞包括原核細胞(如大腸杆 菌)、酵母(如畢赤酵母)或哺乳細胞(如CH0,NS0細胞)。優選,將真核表達質粒轉染CHO 細胞,篩選穩定轉染的細胞株4.用發酵方法或大規模細胞培養方法大量生產表達重組人胰激肽原酶的宿主細 胞;優選,通過生物反應器大規模培養表達重組人胰激肽原酶的CHO細胞,其步驟如下a)將含有表達重組蛋白的細胞株用含有5-10%胎牛血清的DMEM培養基(pH7. 20) 進行培養,然後在無血清培養基中採用常規的方法進行傳代適應後,小規模懸浮批次培 養,置溫度37°C、5% C02培養箱內孵育生長。接種於細胞培養罐中進行細胞連續培養, 接種密度為 1.0X105/ml-5. 0X105/ml,優選,3. 0X105/ml。培養溫度 37°C、pH7. 2、轉速 50-120rpm/min,優選90rpm/min,溶解氧50%空氣飽和度和通氣量0. ILpm0b)在無血清培養基中培養24-72小時後,優選,在無血清培養基中培養48小時後, 將無血清培養基灌注進入生物反應器進行灌注培養。灌注速度需根據培養基中的殘糖量 進行調節。保持殘糖量在0.8-1. 2g/L;抽取罐內少量培養液,檢測和跟蹤其體外活性。培 養時間為28天,從第6天起開始收液,最高細胞密度可達0. 8X 107/ml-2X 107/ml,優選, lX107/ml。c)收集含有表達重組人胰激肽原酶的培養基,過濾去除細胞碎片。上清液用於重 組蛋白的純化。5.從大量培養的表達重組人胰激肽原酶的細胞中純化重組蛋白。優選,從CHO細 胞表達重組人胰激肽原酶,該蛋白的純化包括以下步驟a)將含有重組人胰激肽原酶的培養基超濾濃縮後,上擴張床強陰離子交換柱 (Streamline Q XL, GE Healthcare 公司),衝洗柱子至 OD28tl < 0. 2 ;用含 0. 3M NaCl 及 0. 02mol/L Tris緩衝洗脫柱子。b)在上述洗脫收集液加入(NH4) 2S04,用HCl調整pH 7. 0 士0. 1上苯基交聯瓊脂糖 快速流凝膠(phenyl Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare 公司)。洗脫液用 10000MWC0 膜超濾至3L。加入90g檸檬酸鈉,用HCl調pH值至7. 0士0. 2,然後60°C恆溫加熱10小時。 加熱後將溶液調PH8. 0 士0. 1,上苯扎嘧啶交聯瓊脂糖凝膠柱(Benzamidine Sepharose6B), 衝洗,洗脫。c)調節上述洗脫收集液pH4. 0 士 0. 1,上SP瓊脂糖凝膠FF柱(SpS印harose Fast Flow,GE Healthcare公司),衝洗至流出液0D280 0. 1的洗脫流出液。將洗脫收集液調PH7. 0,用10000MWC0膜進行超濾濃縮,得到純化的重組人胰激肽 原酶蛋白。用酯酶法測定純化蛋白的酶活性。用上述方法進行大規模培養細胞並結合基於親和層析技術製備的重組人胰激 肽原酶具有下列特徵通過SDS-PAGE電泳方法測定,重組人胰激肽原酶的電泳帶區域 比現有人尿激肽原酶寬(重組人胰激肽原酶為38. 0-43. OKDa,人尿激肽原酶分子量為 40. 0-43. OKDa);說明重組人胰激肽原酶由於其糖基化程度的不同,比現有人尿激肽原酶具 有更複雜的組成。通過酯酶法測定酶活性的結果表明重組人胰激肽原酶和現有人尿激肽原 酶活性相近。本發明由於採用了特定的大規模培養條件和發酵方法,從而使得到的重組人胰激 肽原酶的糖基化程度與現有的人尿激肽原酶有所不同,在臨床應用上副作用明顯減小,尤 其是對體內血壓下降較為緩和。雖然導致重組人胰激肽原酶副作用小的機理並不很清楚, 但我們推斷可能是由於糖鏈結構有所不同,導致在體內的發揮了更優異的效能。本發明的重組人胰激肽原酶一般以藥物組合物的形式使用,這種組合物含有治療 有效量的作為活性成分的重組人胰激肽原酶和可藥用輔料,活性成分與藥用輔料重量比例 為1 1 1 15000,其中優選比例為1 1 1 2500。這種藥物組合物優選以靜脈 注射途徑給藥,主要劑型包括凍乾粉針劑和注射液劑。經靜脈注射給藥的重組人胰激肽原酶組合物,一般是固體的滅菌組合物形式,即 凍乾粉針劑。這些組合物還可以含有藥用輔料,特別是甘露醇、右旋糖苷、水解明膠、檸檬酸 鈉、甘氨酸或聚乙二醇等中的一種或其任意混合物,在使用時可以溶解於滅菌注射用水或 各種其它注射用滅菌介質中。經靜脈注射給藥的重組人胰激肽原酶組合物也可以是水溶液形式,即注射液劑、 輸液劑。組合物還可以含有藥用輔料,特別是甘露醇、氯化鈉、葡萄糖或聚乙二醇等中的一 種或其任意混合物。重組人胰激肽原酶凍乾粉針的製備方法取過濾滅菌的重組人胰激肽原酶 150PNA單位,加15克甘露醇、2克右旋糖酐40和5克檸檬酸鈉(枸櫞酸鈉)溶解,調節PH 至中性,加注射用水至500毫升,無菌過濾,分裝1000個安瓿中,無菌條件下冷凍乾燥,即得。重組人胰激肽原酶注射液的製備方法取過濾滅菌重組人胰激肽原酶水溶 150PNA單位,調節PH至中性,加注射用水至500毫升,加氯化鈉調節等滲,無菌過濾,分裝 1000個安瓿中,即得。應用重組人胰激肽原酶組合物治療腦梗塞的劑量根據病情的嚴重程度、治療時間 而定,一般靜脈注射給藥量是每天給藥1-3次,每次0. 005-2. 5PNA單位。優選,藥物的給藥 量是每天1次,每次0. 1-0. 2PNA單位。PNA的定義為在37°C、pH8. 0條件下,1分鐘水解底物Val-Leu-Arg-PNA釋放 Iumol游離PNA,即為IPNA單位。對本發明所進行的試驗研究表明,含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物對腦梗塞 患者的療效顯著,副作用極小。
圖1本發明的重組人胰激肽原酶和現有人尿激肽原酶的SDS-PAGE電泳圖。1,重 組人胰激肽原酶;2,人尿激肽原酶;3,蛋白標準分子量對照。圖2各組大鼠腦血栓24h後腦梗塞面積的變化1為對照組,2為重組人胰激肽原酶17. 5X10_3PNA/kg組,3為重組人胰激肽 原酶3. 50X10-3PNA/kg組,4為人尿激肽原酶17. 5X 10_3PNA/kg組,5為人尿激肽原酶 3. 50X10-3PNA/kg組。表示與對照組比較,ρ < 0. 001。圖3各組大鼠腦血栓24h後神經症狀評分結果1為對照組,2為重組人胰激肽原酶17. 5X10_3PNA/kg組,3為重組人胰激肽 原酶3. 50X10-3PNA/kg組,4為人尿激肽原酶17. 5X 10_3PNA/kg組,5為人尿激肽原酶 3. 50X10-3PNA/kg組。***和*分別表示與對照組比較,ρ < 0. 001和ρ < 0. 05。
具體實施例方式實施例1 人胰激肽原酶基因(KLK1基因)的克隆材料和方法以人腎總RNA為模板,先通過反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公 司)獲得KLK的全長cDNA。然後以該cDNA為模板,首先分別擴增KLK的l_496bp (以ATG 為1)和476-789bp兩個片段,然後用5』和3』端引物通過重疊延伸PCR技術將兩個片段拼 接成完整的KLK基因。擴增KLK片段的PCR反應條件94°C 3min變性;94°C 30s ;62°C 30s ; 72°C 30s ;擴增34個循環;72°C延伸5min後結束反應。擴增KLK的1-496所用引物為上遊引物5,GCCTCGCCCTGTCCCTGGGGGGGACTGGTGCTGCGCCCCCGATTCAGTCCCGGATTGTGG3,下遊引物5,AATTCTCTGGTTCGATGCTGC3,PCR擴增476_789bp片段所用引物為上遊引物5,GCAGCATCGAACCAGAGAATTTCTCATTTCCAGATGATCTC3,下遊引物5,GACACCATAGCGGAGAACTCCTGA3,PCR拼接兩個片段所用引物上遊引物5,GCCTCGCCCTGTCCCTGGGGGGGACTGGTGCTGCGCCCCCGATTCAGTCCCGGATTGTGG3,下遊引物5,GACACCATAGCGGAGAACTCCTGA3,結果經過上述方法克隆到的KLKl基因全長序列見序列表中序列1,序列1中標有下劃 線的鹼基為兩個多態性位點,GenBank中相應位置分別是T和G。與GenBank發表的人KLKl 基因對比,克隆的KLKl基因在第405和433位處存在兩個突變,這兩處突變是文獻中已報 道的多態性位點。根據基因組序列設計對應的引物,用RT-PCR方法獲得了 KLKl的基因組DNA,見序 列表中序列2,大寫字母部分代表基因組DNA序列外顯子部分,小寫字母部分代表基因組 DNA序列非編碼區及內含子部分。實施例2 含有重組KLKl基因表達質粒的構建將全長KLKl基因插入含有CMV強啟動子的載體pcDNA3. 1/myc-His㈠A的Xho I 和EcoR I位點,構建了 pcDNA3. I-KLKl真核表達質粒。
構建pcDNA3. I-KLKl 所用引物上遊引物5,GTGACTCGAGACCATGGGGTTCCTGGTTCTGTGC3,(下劃線為 Xho I 酶切 位點)下遊引物5,ATCTGAATTCTCAGGAGTTCTCCGCTATGGTGTC3,(下劃線為 EcoR I 酶切 位點)O另外,為了構建含有人胰激肽原酶和human IgGl Fc片段以便表達在體內更為穩 定的融合蛋白,在pcDNA3. I-KLKl的EcoR I和BamH I位點處插入了 human IgGlFc片段, 構建了 pcDNA3. I-KLKl-Fc真核表達質粒。Fc片段位於KLKl基因的C端,通過EcoR I限制 性酶切位點連接。實施例3 重組人胰激肽原酶在真核細胞中的表達及其製備方法1.KLK1基因在CHO細胞中的表達CHO細胞在含有10 %胎牛血清的DMEM培養基中培養,於5 % CO2、37 °C孵育。用陽離 子脂質體(LipofectAMINE 2000, Invitrogen公司)將上述實施例2製備的pcDNA3. I-KLK 真核表達質粒轉染CHO細胞,以G418篩選轉染細胞;進而通過酶活性測定和Western Blot 鑑定G418篩選後的單克隆穩定細胞株。2.大規模培養表達重組人胰激肽原酶的宿主細胞a)將含有表達重組蛋白的細胞株用含有5%胎牛血清的DMEM培養基(pH7. 20) 進行培養,在無血清培養基中採用常規的方法進行傳代適應後,小規模懸浮批次培養,置溫 度37°C、5% C02培養箱內孵育生長。接種於5L細胞培養罐(New Brunswick Scientific Co. USA)中進行細胞連續培養,接種密度為3. OX 105/ml。培養溫度37°C、pH7. 2、轉速 90rpm/min,溶解氧50%空氣飽和度和通氣量0. ILpm0b)在無血清培養基中培養48小時後,將無血清灌注培養基以0. 6V/V/day的灌 注速率灌注進入生物反應器進行灌注培養。隨著新鮮培養基的連續灌注,細胞數目逐漸 增加,灌注速度需根據培養基中的殘糖量進行調節。當每天灌注> 5L時,保持殘糖量在 0. 8-1. 2g/L;抽取罐內少量培養液,檢測和跟蹤其體外活性.。培養時間為28天,從第6天 起開始收液,最高細胞密度可達1. lX107/ml。c)收集含有表達重組人胰激肽原酶的培養基,過濾去除細胞碎片。上清液用於重 組蛋白的純化。3.重組蛋白的純化包括以下步驟a)收集IOL含有重組人胰激肽原酶的無血清培養基,超濾濃縮後,上擴張床強 陰離子交換(Streamline Q XL, GE Healthcare公司)離子交換柱,用含0. 15M NaCl及 0. 02mol/L Tris 緩衝衝洗柱子至 0D280 < 0. 2 ;用含 0. 3M NaCl 及 0. 02mol/L Tris 緩衝洗 脫柱子。b)在上述20L洗脫收集液加入1800g(NH4)2S04,用HCl調整pH 7.0 士 0.1,上 苯基交聯瓊脂糖快速流凝膠(phenyl Sepharose 6Fast Flow, GEHealthcare公司)。用 0. 7M(NH4) 2S04緩衝液衝洗柱子。用0. 4M(NH4) 2S04緩衝液進行洗脫柱子,洗脫液用10000 膜超濾至3L。加入90g檸檬酸鈉,用HCl調pH值至7. 0士0. 2,然後60°C恆溫加熱10小時。 加熱後將溶液調PH8.0 士0. 1,上苯扎嘧啶交聯瓊脂糖凝膠柱(Benzamidine Sepharose 6B,GE Healthcare 公司),用含 0. IM NaCl 及 0. 02mol/L Tris 緩衝進行衝洗,用含 0. 4M NaCl 及0. 02mol/L Tris緩衝進行洗脫。c)調節上述洗脫收集液pH4. 0 士 0. 1,上SP瓊脂糖凝膠FF柱(SpS印haroseTM Fast Flow, GE Healthcare公司),用0. IM NaAc-HAc緩衝液進行衝洗至流出液0D280 0. 1的洗脫流出液。將 洗脫收集液調PH7. 0,用1萬超濾膜進行超濾濃縮。4.活性測定方法分別配置含有等量活性的人尿激肽原酶和重組人胰激肽原酶的樣品溶液,在樣品 溶液中加入底物S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-PNA · 2HC1),置37士0. 5°C水浴中準確反應15 分鐘,在405nm波長處測定測定各樣品的吸收值A,A值控制在0. 1 0. 2之間。將A值代 入下式計算活性單位PNA 單位 /ml = 173. 6XAXΤ/1000注式中173. 6為反應常數;T為稀釋倍數;1000為單位/L與單位/ml的單位換
算值活性單位定義為在37°C pH8. 0的條件下,1分鐘水解1 μ molVal-Leu-Arg-PNA的 酶量稱為IPNA單位。結果在CMV強啟動子調控下將KLKl基因轉染到CHO細胞,通過酶活性測定和Western Blot分析篩選酶活性高的單克隆穩定細胞株,通過生物反應器灌注法進行大規模細胞培 養,收集含有重組人胰激肽原酶的無血清培養基,進行純化,獲得純化的重組人胰激肽原 酶。通過酯酶法測定酶活性的結果表明重組人胰激肽原酶和人尿激肽原酶活性相近,分別 為 7. 1 和 6. 8PNA/mg 蛋白。灌注培養一方面連續向反應器中注入新鮮的培養基,同時又連續不斷地取出等量 的培養液,但是過程中不取出細胞,細胞仍留在反應器內,使細胞處於一種營養不斷的狀 態。優化培養條件後細胞密度達到107ml,高密度培養動物細胞時,必須確保補充給細胞以 足夠的營養以及除去有素毒的代謝物。灌注培養時用新鮮的培養液進行灌注,可以確保上 述目的的實現。通過調節灌注速度,可以把培養過程保持在穩定的、廢代謝物低於抑制水平 的狀態下。採用灌注培養的優越性在於大大提高了細胞生長密度,同時有助於產物的表達 和純化。已有報導表明蛋白質糖基化的程度受多種因素的影響,如大規模培養條件和發酵 方法等。純化的重組人胰激肽原酶和現有的人尿激肽原酶分子量通過SDS-PAGE電泳測定, 結果如附圖1所示。從附圖1中可以看出,現有的人尿激肽原酶分子量為39. 0-43. OKDa,本 發明的重組人胰激肽原酶為35. 0-44. OKDa,重組人胰激肽原酶的電泳帶區域比人尿激肽原 酶寬,說明重組人胰激肽原酶由於其糖基化程度的不同,尤其是唾液酸化程度的不同,即重 組人胰激肽原酶比人尿激肽原酶具有更複雜的糖基化組成。實施例4製備重組人胰激肽原酶乾粉針取實施例3製備的過濾滅菌的重組人胰激肽原酶150PNA單位,加15克甘露醇、2 克右旋糖酐40和5克檸檬酸鈉(枸櫞酸鈉)溶解,調節PH至中性,加注射用水至500毫升, 無菌過濾,分裝1000個安瓿中,無菌條件下冷凍乾燥,即得。
實施例5製備重組人胰激肽原酶注射液取實施例3製備的過濾滅菌重組人胰激肽原酶水溶150PNA單位,調節PH至中性, 加注射用水至500毫升,加氯化鈉調節等滲,無菌過濾,分裝1000個安瓿中,即得。實施例6重組人胰激肽原酶對大鼠腦梗塞的實驗研究動物和分組=Wistar雄性大鼠,體重280 320g,分別採用重組人胰激肽原酶和人 尿激肽原酶為治療劑,並將動物隨機分為3組,每組12隻①對照組腦梗塞後僅用生理鹽水處理;②重組人胰激肽原酶組腦梗塞後30min經舌下靜脈注射重組人組織激肽原酶 (分為17. 5X 10_3、3· 50 XlO^3PNAAg兩個劑量組,每組6隻);③人尿激肽原酶組腦梗塞後30min經舌下靜脈注射人尿激肽原酶(分為 17. 5X 1(Γ3、3· 50 XlO^3PNAAg 兩個劑量組,每組 6 只)。動物模型的製作腹腔注射水合三氯乙醛350mg/kg麻醉,右側位固定。手術暴露 顴弓,用咬骨鉗咬去顴弓,剪斷筋膜,暴露聶前窩,用小牽張器將磷狀骨和下頜骨間距撐開, 於顱骨底開一 2cmX2cm顱窗,撕開硬腦膜,暴露大腦中動脈,用高頻電刀燒斷,以阻斷血 流,造成局部腦缺血,逐層縫合切口。30分鐘後進行舌下靜脈給藥,回籠飼養。室溫嚴格控 制在24 25°C。治療組在手術30min後由舌下靜脈給藥(用藥量lml/kg),對照組僅注射 同等體積的生理鹽水。檢測指標和方法腦梗塞面積測定將剝離完整的大腦放入4°C冰箱內盛有生理鹽水的小杯中,10 分鐘後去嗅球、小腦及低位腦幹,沿冠狀面切為五片,立即放入紅四氮唑(TTC)染色液中, 避光在37°C水浴中溫孵30分鐘。取出腦片放入10%福馬林中固定。正常組織為玫瑰紅 色;缺血組織呈白色。用重量求積法測量缺血面積,計算缺血區域佔全腦面積的百分比。神經症狀評分判斷方法和標準(1)提起鼠尾,正常鼠兩前肢向前伸直並且對稱。手術鼠,缺血腦半球對側的前肢 肩內旋和內收,觀察其程度不同評為0 4分。(2)牽拉兩肢,正常大鼠肌力對稱,手術後腦缺血半球的對側前肢肌無力,觀察其 程度不同評為0 3分。(3)推兩肩,正常大鼠雙側肩阻力對稱,手術後腦缺血半球的對側肩阻力下降;觀 察其程度不同評為0 3分。按以上標準,滿分為10分。分數越高,說明腦功能障礙越嚴重。結果各組大鼠腦梗塞面積和神經症狀評分的檢測結果見附圖2和附圖3 從圖2可以看出,重組人胰激肽原酶組和人尿激肽原酶組可劑量依賴地縮小大鼠 腦栓塞24h後的腦梗塞面積。與對照組相比,大劑量(17.5Xl(T3PNA/kg)重組人胰激肽原 酶組和人尿激肽原酶組的腦梗面積明顯縮小(P 0. 05)。各組大鼠神經症狀評分結果表明,對照組大鼠麻醉清醒後即有偏癱樣症狀出現, 主要表現為手術對側前肢內收、肩內旋、前肢肌張力下降,向手術對側推動時抵抗阻力下 降。從圖3可以看出,重組人胰激肽原酶和人尿激肽原酶均可劑量依賴地改善神經症狀,兩組與對照組相比有顯著性差異,但兩組之間相比無顯著性差異(P > 0. 05)。
本實驗結果表明,腦梗塞大鼠在腦血栓30min靜脈注射重組人胰激肽原酶,能明 顯縮小腦梗塞24h後的腦梗塞範圍、改善行為障礙,並有劑量依賴關係。說明重組人胰激肽 原酶可抑制腦血栓的形成,對腦梗塞大鼠具有很好的治療作用。
權利要求
一種含有重組人胰激肽原酶的藥物,其含有治療有效量的作為活性成分的重組人胰激肽原酶和可藥用輔料,活性成分與藥用輔料重量比例為1∶1~1∶15000,其中所述重組人胰激肽原酶是由238個胺基酸殘基組成一條單鏈,N 末端和C 末端胺基酸殘基分別為異亮氨酸和絲氨酸,分子中含有5對S S鍵,通過SDS PAGE電泳測定,其分子量為35.0 44.0KDa,其一級結構為FSA00000133788200011.tif
2.根據權利要求1所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物,所述的重組人胰激肽原酶分 子中含有 5 對 S-S 鍵,分別為 Cys7_Cysl50,Cys26_Cys42,Cys29_Cysl96,Cysl61_Cysl75 以及Cysl86-Cys211,等電點約為4. 0,分子中含有14. 4%的糖,結合位點分別位於Asn78、 AsnSUAsnHl0
3.根據權利要求2所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物,其中所述的重組人胰激肽原 酶是由以下步驟製備得到1)根據KLKl的DNA序列設計引物,採用RT-PCR方法從人胰腺擴增KLKlDNA序列;2)將KLKlDNA克隆到表達載體,構建含有KLKl DNA的表達質粒;3)將含有KLKlDNA表達質粒轉入宿主細胞;4)用發酵方法或大規模細胞培養方法大量生產表達重組人胰激肽原酶的宿主細胞,其 步驟如下a)將含有表達重組蛋白的細胞株用含有5-10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養,然 後在無血清培養基中採用常規的方法進行傳代適應後,小規模懸浮批次培養,置溫度37°C、 5% CO2培養箱內孵育生長,接種於細胞培養罐中進行細胞連續培養,接種密度為1.0X105/ ml-5. 0 XlO5Ail,培養溫度37°C、pH7. 2、轉速50-120rpm/min,溶解氧50%空氣飽和度和通 氣量 0. ILpm ;b)在無血清培養基中培養24-72小時後,將無血清培養基灌注進入生物反應器進行灌 注培養,保持殘糖量在0. 8-1. 2g/L ;c)收集含有表達重組人胰激肽原酶的培養基,過濾去除細胞碎片,上清液用於重組蛋 白的純化;5)從大量培養的表達重組人胰激肽原酶的細胞中純化重組蛋白,該蛋白的純化包括以 下步驟a)將含有重組人胰激肽原酶的培養基超濾濃縮後,上擴張床強陰離子交換柱,衝洗柱 子至OD280 < 0. 2 ;用含0. 3M NaCl及0. 02mol/L Tris緩衝洗脫柱子;b)在上述洗脫收集液加入(NH4)2SO4,用HCl調整pH7. 0 士0. 1上苯基交聯瓊脂糖快速 流凝膠,洗脫液用10000MWC0膜超濾至3L,加入90g檸檬酸鈉,用HCl調pH值至7. 0士0. 2, 然後60°C恆溫加熱10小時,加熱後將溶液調pH8. 0士0. 1,上苯扎嘧啶交聯瓊脂糖凝膠柱, 衝洗,洗脫。c)調節上述洗脫收集液pH4.0士0. 1,上SP瓊脂糖凝膠FF柱,衝洗至流出液0D280 0. 1的洗脫流出液,將洗脫收集液調pH7. 0,用10000MWC0膜進 行超濾濃縮,得到純化的重組人胰激肽原酶蛋白。
4.根據權利要求3所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物,其中重組人胰激肽原酶和可 藥用輔料的重量比例為1 1 1 2500。
5.根據權利要求4所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物,其為凍乾粉針劑,可藥用輔 料為甘露醇、右旋糖苷、水解明膠、檸檬酸鈉、甘氨酸或聚乙二醇等中的一種或其任意混合 物。
6.根據權利要求4所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物,其為注射液劑,可藥用輔料 為甘露醇、氯化鈉、葡萄糖或聚乙二醇中的一種或其任意混合物。
7.根據權利要求5-6任意一項權利要求所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物,所述藥 物的規格為0. 1 0. 2PNA單位/支或瓶。
8.根據權利要求7所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物,其是由重組人胰激肽原酶 150PNA單位,加15克甘露醇、2克右旋糖酐40和5克檸檬酸鈉(枸櫞酸鈉)溶解,調節PH 至中性,加注射用水至500毫升,無菌過濾,分裝1000個安瓿中,無菌條件下冷凍乾燥,即 得。
全文摘要
本發明涉及重組人胰激肽原酶組合物在製備治療和/或預防腦梗塞的藥物中的用途。本發明的重組人胰激肽原酶利用分子生物學技術結合表達該重組蛋白的宿主細胞生產製備,對腦梗塞有明顯的治療和/或預防作用。本發明的重組人胰激肽原酶通常以藥物組合物如凍乾粉針劑或注射液劑的形式使用。
文檔編號A61K38/48GK101897959SQ201010193240
公開日2010年12月1日 申請日期2007年7月2日 優先權日2007年7月2日
發明者侯永敏, 傅和亮, 吳蓉蓉, 王曉巖 申請人:廣東天普生化醫藥股份有限公司