豬流感病毒h3n2和h1n1亞型ha1蛋白重組豬痘病毒及其製備方法

2023-05-01 13:58:11

專利名稱：豬流感病毒h3n2和h1n1亞型ha1蛋白重組豬痘病毒及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒及其製備方法。
背景技術：
痘病毒基因組結構龐大，大的基因組為很多外來基因的插入提供了空間，作為載體能夠接納大量的外源基因，並使其有效表達(Barbara Ε. Straw, Jeffery J. Zimmerman, Sylvie DjAllairejDavid J. Taylor.. DISEASES OF SWINE. 9TH EDITION. [M])。痘病毒還有良好的免疫原性，能激發宿主產生有效的免疫反應。豬痘病毒不感染其他動物，只感染豬， 在豬體只產生溫和性反應，使用比較安全。因此，豬痘病毒是給豬傳遞免疫原的一種較為理想的載體。重組豬痘病毒疫苗具有弱毒疫苗的抗原增殖能力，使用方便，成本低廉。所以，豬痘病毒是豬專有的基因工程活載體疫苗頗具魅力的候選載體。豬流感(Swine influenza, Si)是由A型流感病毒引起的一種豬的急性呼吸道傳染病。雖然單純的豬流感病毒感染表現為發病率高(100% )，死亡率低(約5% )，但豬流感病毒在體內可以感染肺泡巨噬細胞(Jung Τ, Chol C, Chae C. Localization ofSwine Influenza Virus in Naturally Infected Pigs [J], Vet Pathol，2002，39 :10-16.)。肺泡巨噬細胞受損嚴重影響肺部免疫防禦機制，容易引起其它病原菌和病毒的繼發感染。另外，由於豬呼吸道上皮細胞既有禽流感病毒又有哺乳動物及人流感病毒的受體，豬成為流感病毒基因發生重組的關鍵場所(Scholtissek C. Pigs as the "mixing vessel「 for the creation of new pandemic influenzaA viruses [J]. Med Princ Pract，1990，2 :65-71)，在流感病毒的生態學和流行病學中佔據重要的地位。目前歐美市場豬流感疫苗是全病毒滅活疫苗，對預防豬流感發揮了重要的作用。但滅活疫苗誘導細胞免疫的能力弱，對異源和異型病毒感染不能提供有效保護，很難有效控制抗原多變的豬流感病毒在豬群中的感染與傳播。口蹄疫病毒的非結構蛋白2A具有自身裂解作用，這就保證了位於其兩側的蛋白各自獨立發揮其生物學功能。目前，2A蛋白的該特性已被廣泛應用於基因工程疫苗、HIV和腫瘤等方面的研究(劉慧娟，金寧一，馬鳴瀟等.共表達0型口蹄疫病毒3C、P1-2A基因和豬白細胞介素18基因的重組雞痘病毒免疫原性研究.中國生物工程雜誌，2007，27 (8) :25 28)豬流感病毒H3N2 (A/swine/Guangxi/1/2004 (H3N2))毒株(GenBank 收錄號為 FJ157986)和豬流感病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (Hmi))毒株(GenBank 收錄號為 EU502884)均是我國豬群中流行的優勢毒株(祁賢.我國部分地區豬流感病毒分子流行病學及致病性研究，南京農業大學博士論文.2006. 6,88-130)，HAl蛋白是豬流感病毒的主要表面抗原，可誘導機體產生保護性中和抗體，可用來抵禦豬流感病毒的感染。目前還沒有構建成共表達豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒的報導。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl基因的轉移載體pUSZll/H3-2A-Hl。本發明的另一目的是提供豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒。本發明的又一目的是提供該重組豬痘病毒的製備方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現一種豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl基因的轉移載體pUSZll/H3-2A_Hl，該轉移載體是將序列為SEQ ID NO. 1所示的由豬流感病毒H3N2毒株HAl基因序列、口蹄疫病毒的2A基因序列和豬流感病毒Hmi毒株HAl基因序列串聯組成的H3-2A-H1基因插入豬痘病毒載體pUSZll的B amHI酶切位點所得。一種豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒，是由豬痘病毒和所述的轉移載體PUSZ11/H3-2A-H1感染、轉染PK15細胞，進行同源重組獲得的陽性克隆。其中，所述的豬痘病毒優選ATCC保藏號為ATee numberVR-363TM的野生型豬痘病毒WtSPV0所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒rSPV/H3-2A_Hl 於2011年1月6日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:V201102。該重組豬痘病毒rSPV/H3-2A-Hl在分類上屬於痘病毒科(Poxviridae)，豬痘病毒屬 (Suipoxvirus)，豬痘病毒(Swinepox virus)。豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒的製備方法，包括如下步驟(1)根據 GenBank 收錄號為 FJ157986 的豬流感病毒 H3N2 (A/swine/ Guangxi/1/2004(H3N2))毒株HAl的基因序列、GenBank收錄號為HQ412603 口蹄疫病毒 2A 基因和豬流感病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (Hmi))毒株(GenBank 收錄號為 EU502884)HA1的基因序列，自行設計併合成序列為SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因；(2)將所述的序列為SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因插入豬痘病毒載體pUSZll 中，然後通過酶切、測序鑑定和測定正反向，獲得所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl 基因的轉移載體PUSZ11/H3-2A-H1 ；(3)將豬痘病毒和所述的H3-2A-H1基因的轉移載體pUSZll/H3-2A_Hl感染、轉染 PK15細胞，進行同源重組獲得所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒。步驟(2)所述的將H3-2A-H1基因插入豬痘病毒載體pUSZll的具體方法為利用 BamHI分別對步驟(1)所述的序列為SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因和豬痘病毒載體 pUSZll進行單酶切，回收大小為2084bp的H3-2A-H1基因目標片段和大小為8391bp的豬痘病毒載體pUSZll線性大片段，連接兩片段，得到重組質粒。經酶切、測序和測定正反向，將測序結果符合目的片段且方向為正向的質粒定名為pUSZl 1/H3-2A-H1。所述的製備方法還包括所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒的蝕斑純化步驟。所述的製備方法還包括利用IFA和Western-blot技術對所述的豬流感病毒H3N2 和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒進行表達鑑定的步驟。所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒在製備預防和/或治療豬流感病毒H3N2和Hmi亞型感染的藥物中的應用。
有益效果本發明首次同時將豬流感病毒H3N2和Hmi的HAl基因插入到豬痘病毒載體 PUSZll中獲得重組載體PUSZ11/H3-2A-H1，該質粒篩選標誌LacZ基因前帶有痘苗病毒啟動子P11，進行同源重組後藍斑非常明顯，利於篩選和純化。本發明首次提出了用豬痘病毒載體構建豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒。試驗證明，本發明構建的豬流感病毒(H3N2和H1N1)重組豬痘病毒能夠穩定表達外源蛋白，而且其效價穩定，種毒的毒價穩定在107TCID5Q/mL。通過動物試驗證明rSPV/ H3-2A-H1能誘導小鼠產生顯著的體液免疫和細胞免疫反應，能保護豚鼠和豬抵禦豬流感病毒H3N2和Hmi的攻擊。重組豬痘病毒不感染其他動物，只感染豬，在豬體只產生溫和性反應，使用比較安全。重組豬痘病毒疫苗具有弱毒疫苗的抗原增殖能力，使用方便，成本低廉。所以，豬流感重組豬痘病毒rSPV/H3-2A-Hl在豬流感(H3N2和Hmi亞型)的防制方面具有廣闊的應用前景。生物材料保藏信息豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒rSPV/H3-2A_Hl於2011年1 月6日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏號為CCTCC NO V201102。


圖l、pSPl質粒圖譜。圖2、豬痘病毒轉移載體pUSZll/H3-2A-Hl的構建示意圖。圖3、合成的H3-2A-H1基因BamHI酶切電泳圖，M =Marker, 1 :Η3-2Α_Η1 基因 BamHI 酶切產物。圖4、豬痘病毒載體pUSZIlBamHI酶切電泳圖，M =Marker, 1 豬痘病毒載體pUSZll BamHI酶切產物。圖5、重組質粒的酶切鑑定電泳圖，M =Marker, 1 重組質粒BamHI酶切產物。圖6、重組豬痘病毒rSPV/H3-2A_Hl的藍斑篩選、純化照片。圖7、IFA鑑定圖片，A、C、E為用H3N2陽性血清作一抗；B、D、F為用Hmi陽性血清作一抗；A、B 感染重組豬痘病毒rSPV/H3-2A-Hl的H(15細胞，有明顯的螢光；C、D 感染野生型豬痘病毒的H(15 細胞，沒有螢光；E、F 未接種病毒的H(15細胞，沒有螢光。圖8、Western-blot鑑定(用H3N2陽性血清作一抗)圖片；1 =Marker, 2 感染重組豬痘病毒的H(15細胞，3 感染野生型豬痘病毒的H(15細胞。圖9、Western-blot鑑定(用Hmi陽性血清作一抗)圖片；1 =Marker, 2 感染重組豬痘病毒的H(15細胞，3 感染野生型豬痘病毒的H(15細胞。圖10、免疫後小鼠血清豬流感病毒(H3N2)中和抗體變化。
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圖11、免疫後小鼠血清豬流感病毒(HlNl)中和抗體變化。圖12、免疫後小鼠豬流感病毒(H3N2)特異的淋巴細胞增殖檢測結果。圖13、免疫後小鼠豬流感病毒(Himi)特異的淋巴細胞增殖檢測結果。圖14、豬流感病毒(H3N2)刺激小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子檢測結果。圖15、豬流感病毒(HlNl)刺激小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子檢測結果。圖16、豬流感病毒(H3N2)刺激豚鼠外周血淋巴細胞分泌細胞因子檢測結果。圖17、豬流感病毒(HlNl)刺激豚鼠外周血淋巴細胞分泌細胞因子檢測結果。圖18、豚鼠肺臟組織病理變化；A :rSPV/H3 免疫，H3N2 攻毒；B :rSPV/H3 免疫，HlNl 攻毒；C :wtSPV 免疫，H3N2 攻毒；D =WtSPV免疫，HlNl攻毒；E :PK15免疫，Η3Ν2攻毒；F :ΡΚ15免疫，HlNl攻毒。圖19、豬攻毒(Η3Ν2)後鼻腔排毒情況檢測結果。圖20、豬攻毒(HlNl)後鼻腔排毒情況檢測結果。圖21、豬流感病毒(Η3Ν2)刺激豬外周血淋巴細胞分泌細胞因子檢測結果。圖22、豬流感病毒(HlNl)刺激豬外周血淋巴細胞分泌細胞因子檢測結果。圖23、豬肺臟組織病理變化，A :rSPV/H3 免疫，H3N2 攻毒；B :rSPV/H3 免疫，HlNl 攻毒；C :wtSPV 免疫，H3N2 攻毒；D =WtSPV免疫，HlNl攻毒；E :PK15免疫，Η3Ν2攻毒；F :ΡΚ15免疫，HlNl攻毒。
具體實施例方式實施例1豬痘病毒轉移載體PUSZ11/H3-2A-H1的構建1. 1豬痘病毒載體pUSZll的構建pUSZll質粒(黃冬豔構建)圖譜如圖2所示，全長為8391bp ；pUSZll質粒中的LF 為左邊的豬痘病毒同源重組臂，和豬痘病毒Kasza株的12121-13268bp處同源。以野生型豬痘病毒wtSPV(購自ATCC，保藏號為ATGG numberVR-363TM，下同)基因組DNA為模板， 以一對引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3進行PCR，然後用EcoR I和Kpn I酶切擴增產物， 把LF(SEQ ID NO. 4，1148bp)克隆到pUC19中；pUSZll質粒中的RF為右邊的豬痘病毒同源重組臂，和豬痘病毒Kasza株的13457-14831bp處同源。同樣以wtSPV基因組DNA為模板， 用引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6進行PCR，然後用SalI和Hind III酶切擴增產物把 RF(SEQ ID N0. 7,1375bp)克隆進上述的pUC19中，形成pUSOl質粒。以pSPl (圖1)質粒 (Junghyun Hahn, Se-Hoon Park, Jae-Young Song, et al. Construction of recombinant swinepoxviruses and expression of the classical swine fever virus E2 protein Journal ot Virological Methods 93 (2001) 49-56)為模板，用引物對PllZS :SEQ ID NO. 8 和P11ZX:SEQ ID NO. 9 (其中帶有痘苗病毒的啟動子Pll)，把LacZ基因克隆到載體pUSOl 的BamHI和SalI位點間，其餘序列為pUC19框架序列。由此形成豬痘病毒載體pUSZll (圖 2)。1. 2H3-2A-H1基因的合成、克隆和豬痘病毒轉移載體pUSZll/H3-2A_Hl的構建根據豬流感病毒H3N2 (A/swine/Guangxi/1/2004 (H3N2))毒株 HAl 的基因序列(GenBank收錄號為FJ157986)、GenBank收錄號為HQ412603的口蹄疫病毒(0/ΥΜ/ YN/2000) 2A 基因和豬流感病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (HlNl))毒株(GenBank 收錄號為EU502884) HAl的基因序列，自行設計併合成序列為SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因(前加BamHI酶切位點、痘苗病毒Pl 1啟動子序列、啟始密碼子和將654位A替換成T (破壞BamHI位點)的H3N2的HAl基因、口蹄疫病毒的2A基因和將534位由A替換成T (破壞 EcoRI位點)的Hmi的HAl基因，後加終止子TAATAA和BamHI酶切位點)，該H3-2A-H1基因片段長度為2090bp，委託上海Invitrogen公司合成，並將其插入pUC19的BamHI酶切位點ο將含H3-2A-H1合成基因的pUC19載體和豬痘病毒載體pUSZll分別用BamHI單酶切。酶切體系如下10 μ L BamHLlOyL IOXK Buffer，50 μ L質粒，30 μ L無菌雙蒸水，共 100 μ L0 30°C作用 4h。酶切完畢後，用的瓊脂糖凝膠電泳，H3-2A-H1片段大小為2084bp (圖3)、 PUSZll片段大小為8391bp (圖4)，然後用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒對酶切後的產物進行回收。方法按試劑盒說明。再用連接酶連接，將其插入豬痘病毒載體pUSZll(圖2)中。連接體系如下10. O μ LH3-2A-H1酶切回收產物，1. O μ L載體pUSZll酶切回收產物，1. O μ L 10XT4DNALigase,2. Ομ L IOXDNALigase Buffer，用無菌雙蒸水補足總體積 20. O μ L。混勻後16°C連接16h。同時設定載體自身連接對照。1. 2. 1大腸桿菌DH5 α感受態細胞的轉化和重組質粒的小量提取取連接產物按常規方法轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞(購自TIANGEN BIOTECH, 下同)，然後塗布於100 μ g/mL氨苄青黴素抗性平板上，37°C培養約24h。挑取外源基因與載體連接產物轉化所塗布抗性平板上的單個菌落，接種於3. OmL的含50 μ g/mL氨苄青黴素的 LB 培養基中，180rpm 過夜振蕩培養。根據 Geneaid Biotech 的 High-Speed Plasmid Mini Kit小量提取重組質粒，保存於_20°C。1. 2. 2重組質粒的鑑定酶切鑑定採用單酶切的方法進行鑑定。酶切反應體系為20 μ L =IyLBamHIJyL IOXK Buffer，10 μ L質粒，7 μ L無菌雙蒸水。30°C水浴4h。產物用的瓊脂糖凝膠電泳分析(圖5)。的瓊脂糖凝膠電泳證明酶切片段大小與預期結果一致。測序鑑定將酶切鑑定為陽性的重組質粒送Invitrogen公司雙向測序，並用NCBI BLAST將所測得的序列及其推導的胺基酸序列與GenBank資料庫中的豬流感病毒(H3N2和 H1N1)HA1基因以及口蹄疫病毒的2A基因的核苷酸和蛋白質進行同源性比較，再用Vector NTI和DNAstar軟體進行基因的限制性內切酶和閱讀框分析，證明我們所克隆入的基因與目的基因的同源性為100%，而且克隆入的基因完全符合載體閱讀框要求。將測序結果符合目的片段且方向為正向的質粒定名為PUSZ11/H3-2A-H1 (圖2)。實施例2豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒的構建與鑑定2. 1感染與轉染 在6孔板中用無抗生素MEM(購自TIANGEN BIOTECH，下同)營養液培養PK15細胞 (購自ATCC，ATCC Number:CCL-33TM，下同)至形成單層，棄營養液；以0. 02M0I的野生型豬痘病毒wtSPV感染，37°C作用2h，其間搖動3次，棄感染液，用洗液洗1次，每孔加入2mL 無抗生素維持液。取10 μ L脂質體(Invitrogen公司產品)加入至250 μ L無血清MEM中， 輕輕混勻，置室溫5min將4 μ g鑑定好的質粒pUSZl 1/H3-2A-H1加入至250 μ L無血清ΜΕΜ，輕輕混勻。將兩管混勻，置室溫下作用20min，將複合物加到6孔板中，來回搖晃混勻。37°C 作用他後棄轉染液，加入2. 5mL/孔無抗生素維持液，37°C培養至出現明顯的細胞病變，收毒用於篩選。2. 2豬流感重組豬痘病毒rSPV/H3-2A_Hl的篩選、純化與表達鑑定重組病毒的藍斑篩選上述培養物反覆凍融3次，IO1UO2UO^ ΙΟ4、105、IO6倍稀釋後接種單層PK15。16h後用含200 μ g/mL X-gal (購自TIANGEN BIOTECH)、1 %低熔點瓊脂糖 (購自TIANGEN BIOTECH)的營養瓊脂取代無血清培養基，繼續培養3 5d，出現的藍色蝕斑即為豬流感重組豬痘病毒，命名為rSPV/H3-2A-Hl。重組病毒的蝕斑克隆單個藍色蝕斑以102、103、104、105、106倍稀釋後接種單層 PK15細胞，IMi後以含200 μ g/mL X_gal、1 %低熔點瓊脂糖的營養瓊脂取代無血清培養基， 繼續培養3 5d，挑取單個蝕斑(圖6)。重複5次。豬流感重組豬痘病毒rSPV/H3-2A_Hl表達鑑定IFA鑑定待接種rSPV/H3-2A-Hl和wtSPV的H(15細胞出現明顯CPE (4 5d)後， 傾去維持液，PBS洗滌2次後，用4°C冷無水乙醇固定30-45min，棄固定液，將96孔細胞板自然晾乾。在接毒細胞孔和未接毒細胞孔中分別加入50 μ L 1 50稀釋的豬流感Η3Ν2、Η1Ν1 陽性血清(用北京愛德士元亨生物科技有限公司豬流感試劑盒檢測的臨床血清，下同)，置 37°C溼盒中作用45min，PBS洗滌3次，每次5min ；加入50 μ L SPA-FITC標記物(用0. OlMpH 7. 4PBS稀釋100倍)，37°C溼盒作用45min，PBS洗滌3次，置倒置螢光顯微鏡下觀察結果。 rSPV/H3-2A-Hl感染且加豬流感H3N2 (A)和HlNl (B)陽性血清的細胞孔觀察到陽性細胞有典型的特異性亮綠色螢光，而wtSPV感染孔(C、D)和對照的細胞孔(E、F)內無特異性綠色螢光(圖7)，可見重組病毒rSPV/H3-2A-Hl能同時表達H3N2、Hmi的HAl蛋白。Western-blot鑑定取感染後收集、保存的含有重組豬痘病毒的上清接種 PK-15細胞，培養7 後收集感染重組豬痘病毒的細胞，加入1. 5mL的離心管中，2000rpm, 離心5min，棄上清，用PBS洗滌2次，棄上清，加入細胞裂解液100 μ L，冰浴30min，加入2 X 上樣緩衝液IOOyL,煮沸;3min，離心5min，取上清0份)電泳分析。用同樣的方法處理用wtSPV感染的H(15細胞作為陰性對照。細胞煮沸裂解後用12%聚丙烯醯胺凝膠進行 SDS-PAGE 電泳。電泳結束後，按文獻(杜以軍.豬α幹擾素和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子對口蹄疫病毒VPl抗原的免疫增強作用研究.南京農業大學博士論文，2008. 6，38)方法轉印。 將轉印後的PVDF膜0份)轉移至封閉液(含5%脫脂乳的PBST)中，室溫輕搖3 證後 4°C封閉過夜；傾去封閉液，用洗滌液PBST洗膜3次，每次lOmin，然後兩張膜一張加入以封閉液1 1000稀釋的兔Hl亞型SIV多抗血清(用豬流感病毒Hmi按常規方法免疫兔子所得)的一抗溶液，另一張加入以封閉液1 1000稀釋的兔H3亞型SIV多抗血清(用豬流感病毒H3N2按常規方法免疫兔子所得)的一抗溶液，室溫下振蕩1. 5 池；再用PBST洗膜3次，每次lOmin，然後加入以封閉液1 30000稀釋的羊抗兔IgG-HRP標記物，室溫振蕩 1. 5 ；再用PBST洗膜3次，每次lOmin。最後用HRP-DAB底物顯色試劑盒進行顯色。具體步驟為轉印結束前在顯色盒中依次加入IxHRP反應緩衝液lmL、試劑A 50 μ L、試劑B 50 μ L,混勻，避光保存，30min內使用。轉印結束後將PVDF膜取下，放入顯色盒內預先混勻的顯色液中，待觀察到明顯的目的條帶後停止顯色。將PVDF膜晾乾，觀察。結果顯示，兩張膜中感染重組豬痘病毒的細胞都有預期的目的條帶，而WtSPV感染的H(15細胞無目的條帶出現(圖8、圖9)，可見重組病毒 rSPV/H3-2A-Hl能同時表達H3N2、HlNl的HAl蛋白，並且部分H3-2A-H1蛋白在2A的作用下發生了裂解。將經鑑定的重組病毒rSPV/H3-2A_Hl保藏於中國典型培養物保藏中心，簡稱 CCTCC，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏號為CCTCC NO :V201102，保藏日為2011年1月6曰。2. 3豬流感重組豬痘病毒rSPV/H3-2A_Hl的滴度測定將H(15細胞種植於96孔板，待長成單層，將重組豬痘病毒rSPV/H3-2A_Hl (CCTCC NO :V201102)凍融3次，用維持液將病毒作10倍比稀釋；棄去長滿單層H(15細胞的96孔板中的營養液，接種稀釋好的病毒液，每個稀釋度4個孔，100 μ L/孔；37°C、5% CO2飽和溼度下培養5d，觀察CPE，積累每個稀釋度的CPE孔數，按Reed-Muench法計算病毒的TCID5(1。 重組豬痘病毒 rSPV/H3-2A-Hl (CCTCC NO :V201102)的 TCID50 為 107_7mL。2. 4豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒rSPV/H3-2A_Hl穩定性試驗把重組豬痘病毒rSPV/H3-2A-Hl(CCTCC NO :V201102)在H(15細胞上連續傳代30代，每5代分別檢測rSPV/H3-2A-Hl中H3N2、HlNl的HAl蛋白的轉錄與表達，同時測定其組織細胞半數感染量。結果表明，H3N2、HlNl的HAl蛋白在重組豬痘病毒rSPV/ H3-2A-H1 (CCTCC NO :V201102)連續傳代過程中表達穩定，其組織細胞半數感染量也未發生變化。接毒後細胞病變出現規律，種毒的毒價穩定在107TCID5Q/mL。實施例3小鼠的免疫學試驗取6-8周齡雌性BALB/c小鼠45隻，隨機分為3組，每組15隻。第1組每隻肌肉免疫 rSPV/H3-2A-Hl (CCTCC NO :V201102)，劑量為 0. 2X IO7'0TCID50 ；第 2 組每隻肌肉注射 wtSPV 0. 2X IO7 ciTCID5tl，第3組每隻肌肉注射H(15細胞裂解上清0. 2mL。21d、35d後分別以相同的劑量加強免疫2次。分別於首次免疫後21、35、42d採血測定中和抗體；在首次免疫後21、35、42d取脾臟，分離淋巴細胞，測定淋巴細胞增殖反應(5隻/組/次)；首次免疫後 35d取脾臟，分離淋巴細胞，分別用豬流感病毒H3N2和Hmi刺激，測定培養上清中IFN- γ 和IL-4的量。3. 1中和抗體變化病毒中和試驗-固定病毒稀釋血清法。首先參照動物病毒學(第二版)，測定豬流感病毒Η3Ν2和HlNl的TCID50。在病毒中和試驗前3 將MDCK細胞(購自上海坤肯生物化工有限公司，下同) 種植於96孔細胞板。待檢血清56°C滅活30min，12000rpm離心5min除菌後，小心吸出上清，用維持液(含2% FCS的DMEM(購自TIANGENBIOTECH))分別將血清按1 4、1 8、 1 16、1 32，……，作2的連續倍比稀釋；將病毒Hmi和H3N2用維持液分別稀釋至含 200TCID50/100 μ L，然後將稀釋的血清與等體積的病毒液(含200TCID5(1/100 μ L)混合，於 37°C水浴作用lh。棄去已長滿單層MDCK細胞的96孔培養板中的營養液，將血清病毒混合液加入到細胞孔中，100 μ L/孔，每個血清稀釋度作4的復孔，37°C培養2 3d。同時設定以下對照(1)豬流感H3N2陰性血清對照；( 豬流感Hmi陰性血清對照；( 豬流感病毒H3N2 一豬流感H3N2陰性血清對照；(4)豬流感病毒Hmi —豬流感Hmi陰性血清對照；(5) 豬流感病毒H3N2 —豬流感H3N2陽性血清(中和抗體效價為1 32)作為陽性對照；(6)豬流感病毒Hmi —豬流感Hmi陽性血清(中和抗體效價為1 32)作為陽性對照；(7)空白對照。結果判定，當⑶、⑷對照孔出現CPE，而⑴、⑵、(5)、(6)和(7)對照孔均未出現CPE時記錄每個血清稀釋度的CPE孔數。以能夠完全抑制CPE的血清最大稀釋度作為待檢血清的中和效價。血清中和試驗結果顯示(圖10、11)兩個對照組小鼠血清沒有豬流感病毒(swine influenzavirus, SIV) (H3N2.H1N1)中和活性；rSPV/H3-2A_Hl 免疫組小鼠血清具有 SIV 中和活性，且二免後呈明顯上升趨勢。血清中H3N2和Hmi的中和抗體變化趨勢相似，兩者之間無明顯差異。3. 2SIV(H3N2,H1N1)特異的淋巴細胞增殖檢測3. 2. 1小鼠脾淋巴細胞的製備 參照文獻(杜以軍.豬α幹擾素和粒細胞_巨噬細胞集落刺激因子對口蹄疫病毒VPl抗原的免疫增強作用研究.南京農業大學博士論文，2008. 6，66-67)進行。淋巴細胞製備好後進行細胞計數，用RPMI-1640(購自TIANGEN BIOTECH)完全培養基調節細胞密度至5X IO6個/mL ；鋪板，將細胞懸液加到96孔細胞板中，100 μ 1/孔。3. 2. 2淋巴細胞增殖試驗在種植好淋巴細胞的孔中，分別加入20 μ g/ml的SIV (Hmi)、SIV (H3N2)抗原作為刺激原100 μ 1，對照孔加入100 μ 1 RPMI-1640完全培養基，各作3個重複孔。37°C 5% C02 溫箱中培養66h，吸出上清，加入160μ 1新鮮的培養基，同時每孔再加入40 μ 1 MTT (5mg/ ml)，37°C下繼續培養4h。吸棄培養液，每孔加入100μ 1 DMS0，振蕩融解結晶，測定OD57tlnm 的值。計算刺激指數刺激指數SI =刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值檢測結果(圖12、13)顯示重組豬痘病毒免疫組小鼠脾淋巴細胞經SIV (Η3Ν2)和 SIV(HlNl)刺激後出現特異的細胞活化增殖。組間比較免疫後21d、35d和42d，重組豬痘病毒免疫組與兩個對照組淋巴細胞增殖差異顯著(P < 0. 05)。3. 3SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子檢測分別用SIV(H3N2)和SIV(HlNl)作為刺激抗原(終濃10 μ g/mL)刺激分離的淋巴細胞，37°C下培養66h。用 ELISA試劑盒(購自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate) 來測定培養上清中細胞因子IFN-Y和IL-4的量，按說明書來操作。一免後35d，小鼠脾淋巴細胞經SIV刺激，培養上清中IFN- γ和IL_4含量檢測結果顯示(圖14、15)各組小鼠脾淋巴細胞培養上清中都有細胞因子分泌。組間比較rSPV/ H3-2A-H1免疫組小鼠脾淋巴細胞培養上清中IFN-Y和IL-4含量顯著高於其它兩個對照組(P < 0. 05)，而用H3N2和Hmi的刺激的細胞因子濃度變化趨勢相似，兩者之間無明顯差異。實施例4豚鼠的免疫學試驗及攻毒保護試驗取200-300克雌性Hartly豚鼠36隻，隨機分為6組，每組6隻。第1、2組每隻免疫rSPV/H3-2A-Hl，劑量為0. 4X IO7.0TCID50 ；第3、4組每隻免疫wtSPV,劑量為 0. 4X IO7 0TCID50 ；第5、6組每隻注射PK15細胞裂解上清0. 4mL。免疫方式為兩後腿脛骨上方肌肉注射。21d分別以相同的劑量加強免疫1次。首次免疫後28d採血，分離淋巴細胞， 用SIVH3N2和Hmi刺激，測定培養上清中IFN- γ和IL-4的量。35d採血測定中和抗體滴度。第35d攻毒，第1、3、5組用ImL無針頭注射器每隻鼻腔注射0.2X IO5 tlTCID5ci的H3N2; 2、4、6組每隻鼻腔注射0. 2 X IO5 0TCID50的HlNl0攻毒後觀察7d。臨床表現記錄每天餵食時，記錄觀察項目的出現情況，最後根據7天記錄結果，進行平均，具體方法參考文獻(王興龍，豬繁殖與呼吸症候群病毒流行毒株NSP2基因遺傳變異及GM-CSF對GP3/GP5的免疫增強作用研究，南京農業大學博士論文，2010. 6，61)進行。觀察項目有精神沉鬱、食慾下降、 眼瞼水腫、咳嗽、呼吸困難和流鼻涕6項指標，根據嚴重程度每項0-3分；肺大體病變的評分參照文獻(Wesley RD, Tang Μ, Lager K Μ. Protection of Weaned Pigs by Vaccination with Human Adenovirus 5Recombinant Viruses Expressing the Hemagglutin in and the Nucleoprotein of H3N2 SwineInfluenza Virus[J]. Vaccine,2004,22(25/26) 3427-3434.)進行。42d將全部豚鼠安樂死，取肺組織處理、接種雞胚(盲傳2代)，HA、HI 試驗檢測流感病毒，同時取肺樣本用甲醛固定做病理切片，觀察病理變化。4. ISIV (H3N2)和SIV(HlNl)刺激豚鼠外周血淋巴細胞分泌細胞因子檢測無菌取豚鼠的外周血，用肝素抗凝，用生理鹽水稀釋1倍，輕輕加於4mL的淋巴細胞分離液面上，2000r/min，離心20min ；取界面淋巴細胞層，用PBS洗3次，懸於RPMI 1640 培養液，計算並調整細胞濃度至2 X 106/ml。將細胞懸液加到96孔板中，每孔100 μ 1。在種植好淋巴細胞的孔中，分別加入20ug/ml的SIV(H3N2)和SIV(HlNl)抗原作為刺激原100 μ 1，對照孔加入100 μ 1 RPMI-1640完全培養基，各作3個重複孔。37°C 5% CO2溫箱中培養66h，吸出上清。細胞因子的檢測方法同前。一免後觀山豚鼠外周血淋巴細胞經SIV刺激，培養上清中IFN- γ和IL-4含量檢測結果顯示(圖16、17)各組豚鼠外周血淋巴細胞培養上清中都有細胞因子分泌。組間比較rSPV/H3-2A-Hl免疫組IFN- γ和IL-4含量顯著高於其它兩個對照組(P < 0. 05)，而用 SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激的細胞因子濃度變化趨勢相似，兩者之間無明顯差異。4. 2豚鼠肺臟組織病理變化觀察進行肺臟組織病理變化觀察，病理組織切片的製備過程參照文獻(王興龍.豬繁殖與呼吸症候群病毒流行毒株NSP2基因遺傳變異及GM-CSF對GP3/GP5的免疫增強作用研究.南京農業大學博士論文，2010. 6，62-63)進行。攻毒後7d，第1組(A)和第2組(B)豚鼠肺組織無變化，而對照組均發生了明顯的病理變化，表現為嚴重的間質增生，有的充血、淋巴細胞浸潤和肺泡壁破壞(圖18)。4. 3豚鼠免疫保護試驗(表1)血清中和試驗結果顯示，免疫後35d，rSPV/H3-2A-Hl免疫組豚鼠血清中檢測到 SIV(H3N2)和SIV(HlNl)特異的中和抗體，但不同豚鼠之間抗體滴度低的為1 8，高的可達到1 32。wtSPV、PK15免疫組血清對SIV(H3N2)和SIV(HlNl)均沒有中和活性。—免後35d攻毒，免疫rSPV/H3-2A_Hl的豚鼠無流感症狀出現。而對照組表現為體溫升高、精神沉鬱、食慾下降、流鼻涕、呼吸困難、咳嗽，尤其是流鼻涕很明顯，而其他症狀輕微。rSPV/H3-2A-Hl免疫組中無肉眼可見病理變化，而所有對照組豚鼠肺部都有範圍大小不等的紫色、肉變區出現。從免疫rSPV/H3-2A-Hl的豚鼠未分離到SIV，而對照組全都分離到SIV。實施例5豬體攻毒保護試驗

本部分試驗在江蘇省農業科學院完成。所有的豬均在無SIV的環境設施中飼養。30頭6周齡的大長二元豬(SIV、PRRSV、 PCV、SPV陰性)，隨機分為6組，每組5頭，每一組在單獨的圈舍飼養。第1組和第2組免疫rSPV/H3-2A-Hl，劑量均為1 X 107TCID50/lmL/頭；第3、4組注射wtSPV，劑量均為 1 X IO7TCID5tZlmL/頭；第5、6組每頭注射PK15細胞裂解上清lmL。免疫方式為肌肉注射。 在免疫後21d，前腔靜脈採血檢測針對SIV的特異性中和抗體；同時分離外周血淋巴細胞， 分別用SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激，測定培養上清中細胞因子IFN-γ和IL-4的量。在免疫後21d，所有豬攻毒，攻毒方式為鼻腔注入(拔取注射器針頭)。第1、3、5組每隻鼻腔注入 IX 105·ciTCID5tl 的 SIV(H3N2) ；2、4、6 組每隻鼻腔注入 1 X 105_tlTCID50 的 SIV(HlNl)。攻毒後連續5d，觀察臨床表現，測體溫，採鼻拭子檢查鼻腔排毒情況，攻毒後第5d，豬進行安樂死處理，觀察肺臟病理變化。鼻拭子中流感病毒含量檢測和肺大體病變的評分參照文獻進行(Wesley R D, Tang Μ, Lager K Μ. Protection of Weaned Pigs by Vaccination with HumanAdenovirus 5 Recombinant Viruses Expressing the Hemagglutin in and the Nucleoprotein of H3N2Swine Influenza Virus[J]. Vaccine,2004,22 (25/26) 3427-3434.)。取肺組織處理、接種10日齡SPF雞胚(盲傳2代)，HA、HI試驗檢測SIV ；同時取肺組織甲醛固定，做病理切片觀察。臨床表現記錄每天給動物餵食時(早、中、晚3次)，觀察動物，記錄觀察項目的出現情況，最後根據5天記錄結果，進行平均，獲得動物臨床表現打分值，具體方法參考文獻(王興龍，豬繁殖與呼吸症候群病毒流行毒株NSP2基因遺傳變異及GM-CSF對GP3/GP5 的免疫增強作用研究，南京農業大學博士論文，2010. 6，61)進行。臨床表現記錄包括精神沉鬱、食慾下降、眼瞼水腫、流鼻涕、呼吸困難、咳嗽、皮膚發紅和糞便幹硬8項指標，每項有 1分，無O分。5. 1攻毒後體溫測量結果攻毒後第一天3、4、5、6組豬的直腸溫度都有不同程度的升高，但上升的幅度有限，一般為40°C，1天後體溫回復正常。1、2組豬的直腸溫度在攻毒後一直保持在正常範圍。5. 2攻毒後鼻腔排毒情況測量結果從攻毒前開始採集每頭豬的鼻拭子，一直到試驗結束。按Wesley (Wesley R D， Tang Μ,Lager K Μ. Protection of Weaned Pigs by Vaccination with Human Adenovirus 5RecombinantViruses Expressing the Hemagglutin in and the Nucleoprotein of H3N2 Swine Influenza Virus [J]. Vaccine, 2004, 22 (25/26) :3427_3434.)檢測鼻拭子中 SIV 量，結果如圖19、20。攻毒後，PK15和wtSPV組豬的鼻腔中都有SIV分泌，而重組毒免疫組未檢測到病毒。5. 3SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激豬外周血淋巴細胞分泌細胞因子檢測豬外周血中淋巴細胞經SIV刺激特異的細胞因子含量檢測結果顯示(圖21、22) 在免疫後21d，各組豬外周血淋巴細胞培養上清中都有細胞因子分泌。組間比較rSPV/ H3-2A-H1免疫組豬外周血淋巴細胞培養上清中IFN- γ和IL-4含量顯著高於其它兩個對照組(P < 0. 05)。用SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激的細胞因子濃度變化趨勢相似，兩者之間無明顯差異。5. 4豬肺組織病理變化觀察(圖23)攻毒後第1組㈧和第2組⑶仔豬肺臟無病理變化，而其他組發生了明顯的病理變化，主要是肺泡內淋巴細胞浸潤、肺泡壁破壞、上皮細胞脫落，支氣管腔內充滿淋巴細胞。5. 5豬體攻毒保護試驗(表2)血清中和試驗結果顯示，免疫後21d，rSPV/H3-2A-Hl免疫組豬血清中均能夠檢測到SIV特異的中和抗體，但不同豬之間抗體滴度低的為1 8，高的達到1 32。WtSPV, PK15免疫組豬血清對SIV沒有中和活性。免疫後21d攻毒，免疫rSPV/H3-2A_Hl的豬均無SI症狀出現，而對照組豬表現為體溫升高、精神沉鬱、食慾下降、眼瞼水腫、流鼻涕、喜臥、呼吸困難、咳嗽和皮膚發紅等流感症狀。rSPV/H3-2A-Hl免疫組豬中無肉眼可見病理變化，而對照組豬肺部都有紫色、堅實區出現。免疫rSPV/H3-2A-Hl的豬未分離到SIV，而對照組豬全都分離到SIV。本研究成功構建了表達SIV HAl的重組豬痘病毒rSPV/H3-2A_Hl，並在小鼠、 豚鼠和豬體內分別進行了免疫及攻毒保護實驗。結果顯示，免疫了重組豬痘病毒rSPV/ H3-2A-H1的動物體內產生了 SIV HAl特異的抗體，免疫組的淋巴細胞增殖指數和培養上清中IFN-γ、IL-4含量顯著高於對照組。證明rSPV/H3-2A-Hl能夠顯著提高機體的體液免疫及細胞免疫反應。攻毒後，HQ5和wtSPV組豬的鼻腔中都有SIV分泌，而重組毒免疫組未檢測到病毒。用同源SIV (H3N2)和SIV (HlNl)攻擊免疫rSPV/H3-2A_Hl的豚鼠和豬無流感症狀和病理變化，且未分離到病毒。而對照組則表現為體溫升高、精神沉鬱、食慾下降、流鼻涕、 呼吸困難、咳嗽等流感症狀，所有對照組肺部都有範圍大小不等的紫色、肉變區出現，並從中分離到病毒。綜上所述，本研究獲得了串聯表達豬流感病毒H3N2和HmiHAl蛋白重組豬痘病毒 rSPV/H3-2A-Hl。rSPV/H3-2A_Hl能誘導動物產生顯著的體液免疫和細胞免疫反應，能保護豚鼠和豬抵禦同源SIVHmi和H3N2的攻擊。表1豚鼠的免疫應答及攻毒後結果
權利要求
1.一種豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl基因的轉移載體pUSZll/H3-2A_Hl，其特徵在於該轉移載體是將序列為SEQ ID NO. 1所示的由豬流感病毒H3N2毒株HAl基因序列、口蹄疫病毒的2A基因序列和豬流感病毒Hmi毒株HAl基因序列串聯組成的H3-2A-H1基因插入豬痘病毒載體PUSZll的BamH I酶切位點所得。
2.一種豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒，其特徵在於該病毒是將豬痘病毒和權利要求1所述的轉移載體PUSZ11/H3-2A-H1感染、轉染H(15細胞，進行同源重組獲得的陽性克隆。
3.根據權利要求2所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒，其特徵在於所述的豬痘病毒為ATCC保藏號為ATGG^number VR-363 野生型豬痘病毒wtSPV。
4.根據權利要求3所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒，其特徵在於所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒(rSPV/H3-2A_Hl)於 2011年1月6日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :V201102。
5.權利要求2所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)根據GenBank收錄號為FJ157986的豬流感病毒H3N2(A/swine/ Guangxi/1/2004(H3N2))毒株HAl的基因序列、GenBank收錄號為HQ4U603 口蹄疫病毒2A 基因、GenBank 收錄號為 EU502884 的豬流感病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (HlNl)) 毒株HAl的基因序列，自行設計併合成序列為SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因；(2)將所述的序列為SEQID NO. 1的H3-2A-H1基因插入豬痘病毒載體pUSZll的BamHI 酶切位點，然後通過酶切和測序鑑定，獲得所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl基因的轉移載體 PUSZ11/H3-2A-H1 ；(3)將豬痘病毒和所述的H3-2A-H1基因的轉移載體pUSZll/H3-2A-Hl感染、轉染H(15 細胞，進行同源重組獲得所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒。
6.根據權利要求5所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒的製備方法，其特徵在於步驟( 所述的將H3-2A-H1基因插入豬痘病毒載體pUSZll的具體方法為利用BamH I分別對步驟(1)所述的序列為SEQ ID NO. 1的H3-2A-H1基因和豬痘病毒載體pUSZll進行單酶切，回收大小為2084bp的H3-2A-H1基因目標片段和大小為8391bp的豬痘病毒載體pUSZll線性大片段，連接兩片段，得到重組質粒，經測序和測定正反向，將測序結果符合目的片段且方向為正向的質粒定名為pUSZl 1/H3-2A-H1。
7.根據權利要求5所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒的製備方法，其特徵在於所述的製備方法還包括所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒的蝕斑純化步驟。
8.根據權利要求5所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒的製備方法，其特徵在於所述的製備方法還包括利用IFA和ffestern-blot技術對所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒進行表達鑑定的步驟。
9.權利要求2所述的豬流感病毒H3N2和Hmi亞型HAl蛋白重組豬痘病毒在製備預防和/或治療豬流感病毒H3N2和Hmi亞型感染的藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，公開了豬流感病毒H3N2和H1N1亞型HA1蛋白重組豬痘病毒及其製備方法。根據豬流感病毒H3N2毒株和H1N1毒株的HA1基因序列、口蹄疫病毒的2A基因序列，設計、合成H3-2A-H1基因，並把該基因克隆入豬痘病毒載體pUSZ11中，得到轉移載體pUSZ11/H3-2A-H1。將豬痘病毒和轉移載體pUSZ11/H3-2A-H1感染、轉染PK15細胞，進行同源重組獲得重組豬痘病毒。該重組豬痘病毒能穩定表達豬流感病毒H3N2和H1N1的HA1蛋白，能有效地刺激機體的免疫保護反應，可在製備預防和/或治療豬流感病毒H3N2和H1N1亞型感染的藥物中應用。
文檔編號C12R1/93GK102154367SQ20111002690
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月25日 優先權日2011年1月25日
發明者許家榮, 陸承平, 黃冬豔 申請人:南京農業大學