考馬斯亮藍染色法及相關固定液和染色劑的製作方法

2023-04-30 18:43:36

考馬斯亮藍染色法及相關固定液和染色劑的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種新的考馬斯亮藍染色方法以及相關的固定液和染色液。所述考馬斯亮藍染色方法相關的固定液包含酸和醇，所述醇為甲醇和/或乙醇，所述酸為V乙酸：V磷酸＝1:1的混合酸；所述考馬斯亮藍染色方法相關的染色液包含質量體積濃度為0.05％～0.12％的考馬斯亮藍,體積百分含量為5％～20％的醇，體積百分含量為3％～10％的酸，質量體積濃度為3％～10％的硫酸銨。所述方法線性關係更好、質譜兼容性更好、膠體不易碎、基本無背景，並且減少了近一半的試劑用量，降低了染色成本，更加環保。
【專利說明】考馬斯亮藍染色法及相關固定液和染色劑

【技術領域】
[0001] 本發明涉及凝膠電泳領域，更具體地涉及在凝膠電泳中使用的考馬斯亮藍染色的 相關試劑和方法。

【背景技術】
[0002] 凝膠電泳技術，尤其是單向SDS-PAGE凝膠電泳（1-DE )和二維凝膠電泳（2-DE ) 是目前蛋白質組學研究中使用範圍最廣泛的蛋白質分離技術。其定量的基礎是利用某種 特定的染料對膠上的蛋白進行染色，然後基於染色強度對蛋白進行定量。因此，基於凝膠 定量的靈敏度、線性範圍以及定量精度均高度依賴於蛋白染色水平。現有的染色方法主 要分為4種：有機染料染色、負染、銀染以及螢光染料染色。其中，有機試劑染色以考馬斯 亮藍染色法（Coomasie brilliant blue，CBB)為代表，其在1963年被首次應用到醋酸 纖維素片上的蛋白染色（Fazekas De St.Groth，S.，Webster，R.G.，Datyne;r，A.，Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips [J]. Biochim. Biophys. Actal963, 71，377 - 391 )，隨後 Meyer 等使用甲醇 / 乙酸 /水的溶液配製CBB R250染色液為聚丙烯醯胺凝膠中的蛋白染色（M. Pink，N. Venna，A. W. Rettenmeier, et al. CBB staining protocol with higher sensitivity and mass spectrometric compatibility[J]· Electrophoresis，2010, 31，593-598.)。由於 CBB 染色 法簡單易用，價格低廉，且與下遊的蛋白質譜分析高度兼容，因而，已成為目前使用最廣泛 的染色方法。然而，其主要的問題在於染色靈敏度不高，對低豐度蛋白質的顯現較差。
[0003] 自Groth等第一次使用考馬斯亮藍進行蛋白染色以來（Fazekas De St. Groth，S 等人，同上)，已有很多研究為提高其染色靈敏度進行了努力（Neuhoff V，Aix)ld N，Taube D，Ehrhard t W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using coomassie brilliant blue G_250and R-250[J]. Electroph oresis1988;9:255 - 62 ； G.Candiano, M. Brusch, L. Musant, et al.Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G_250staining for proteome analysis[J]. Electrophoresis,2004,25,13 27-1333 ;M. Pink 等人，同上；Victoria J. Gauci，Matthew P. Padula，Jens R. Coorssen. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics[J]. proteomics，2003, 90, 96-106)，其中Blue Silver被證明是更加靈敏的染色方法，該研究報 道其染色靈敏度能達到lng每蛋白條帶（G. Candiano等人，同上)，但是通過肉眼判斷的可 見條帶下限在l〇ng左右。而且，該方法染色背景深，脫色時間較長，脫色過程中因為聚丙烯 醯胺的伸展而使膠體過度膨脹，易碎（M. Pink等人，同上)。
[0004] 基於以上分析，本領域中需要可以顯著增加現有的考馬斯亮藍染色法的靈敏度， 用量更少，與質譜兼容性更好的考馬斯亮藍染色法相關試劑以及使用其進行染色的方法。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種在蛋白質組學研究領域中應用的經濟環保的考馬斯亮 藍凝膠染色方法及其相應的凝膠固定液和染色劑，旨在形成新的染色方法，降低染色試劑 消耗，解決脫色困難的問題並具有較高的染色靈敏度，具有顯著的經濟環保特色。
[0006] 為達此目的，本發明採用以下技術方案：
[0007] 在第一方面，本發明提供了一種用於考馬斯亮藍染色的固定液，所述固定液包含 酸和醇，其中所述醇為甲醇和/或乙醇，所述酸為乙酸和磷酸體積比為1:1的混合酸。
[0008] 在本發明的固定液中，所述醇的體積百分濃度可以為30%、31%、32%、33%、34%、35%、 36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49% 或 50%，優選為 35% ?45%， 最優選40%。
[0009] 在本發明的固定液中，所述混合酸的體積百分濃度可以為8%?12%，優選為 9%-11%，最優選 10%。
[0010] 在第二方面，本發明提供了一種考馬斯亮藍染色液，所述染色液包含質量體積濃 度為0. 05%?0. 12%，優選為0. 08%?0. 10%的考馬斯亮藍，體積百分含量為5%?20%， 優選為10%?15%的醇，體積百分含量為3%?10%，優選為5%的酸，質量體積濃度為3%? 10%，優選為5%的硫酸銨；其中所述考馬斯亮藍包括R250和G250中的至少一種；所述醇包 括甲醇和乙醇中的至少一種；所述的酸包括乙酸和磷酸中的至少一種。
[0011] 在本發明的染色液中，所述醇可以為甲醇和/或乙醇。
[0012] 在本發明的染色液中，所述酸可以為磷酸。
[0013] 本發明的染色液可以包含質量體積濃度為0. 05%、0. 06%、0. 07%、0. 08%、0. 09%、 0. 10%、0. 11%或0. 12%的考馬斯亮藍。
[0014] 本發明的染色液可以包含體積百分含量為5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、 14%或15%的醇。
[0015] 本發明的染色液可以包含體積百分含量為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的酸。
[0016] 本發明的染色液可以包含體積百分含量為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的硫酸 銨。
[0017] 在第三方面，本發明提供了一種考馬斯亮藍染色方法，其特徵在於，所述方法包括 將SDS-PAGE凝膠置於根據第一方面所述的固定液中進行固定和/或將SDS-PAGE凝膠置於 根據第二方面所述的染色液進行染色，任選地在所述固定和/或所述染色後在ddH 20中進 行漂洗。
[0018] 在本發明的考馬斯亮藍染色方法中，所述固定的時間為30-60min，優選地40?50 分鐘，更優選地45分鐘。
[0019] 在本發明的考馬斯亮藍染色方法中，所述染色的時間為8_12h，優選地9?llh，更 優選地1 Oh。
[0020] 在第四方面，本發明提供了根據第一方面所述的固定液、根據第二方面所述的染 色液和/或根據第三方面所述的方法在蛋白質研究中的應用。
[0021] 有益效果：
[0022] (1)本發明的染色方法對固定過程，染色過程試劑配比進行了優化，最後僅用蒸餾 水簡單漂洗即可快速完成脫色；
[0023] (2)本發明降低了甲醇的體積百分濃度、考馬斯亮藍的質量體積濃度、硫酸銨的使 用量以及磷酸的體積百分濃度，節約了近一半的染色試劑，更經濟環保，並且與一般考馬斯 亮藍染色相比提高了染色靈敏度；
[0024] (3)本發明的考馬斯亮藍染色法與Blue Silver染色法相比靈敏度相當，但性關係 更好、質譜兼容性好、膠體不易碎、基本無背景，並且減少了近一半的試劑用量，降低了染色 成本，更加環保，並且無需脫色，操作簡便，效率高。
[0025] 附圖簡述
[0026] 圖1是不同質量的牛血清白蛋白BSA按照本發明實驗組一的染色結果圖。
[0027] 圖2是不同質量的牛血清白蛋白BSA按照本發明實驗組二的染色結果圖。
[0028] 圖3是不同質量的牛血清白蛋白BSA按照本發明實驗組三的染色結果圖。
[0029] 圖4是不同質量的牛血清白蛋白BSA按照本發明實驗組四的染色結果圖。
[0030] 圖5是不同質量的牛血清白蛋白BSA按照對照實驗組一（Blue Silver)的染色結 果圖。
[0031] 圖6是不同質量的牛血清白蛋白BSA按照對照實驗組二（Meyer Stain)的染色結 果圖。
[0032] 圖7是BSA含量為1?lOOOng梯度範圍內的染色線性關係圖：其中圖A、B、C、D 分別為實驗組三、對照實驗組一（Blue Silver)、實驗組四、對照實驗組二（Meyer Stain)。
[0033] 圖8是是BSA含量為1?10ng梯度範圍內的染色線性關係圖：其中圖A、B、C、D 分別為實驗組三、對照實驗組一（Blue Silver)、實驗組四、對照實驗組二（Meyer Stain)。
[0034] 圖9是不同染色方法SDS-PAGE中50ng BSA條帶膠內酶解MALDI-T0F/T0F分析結 果圖；其中圖A、B、C、D分別為實驗組三、對照實驗組一（Blue Silver)、實驗組四、對照實 驗組二（Meyer Stain)。

【具體實施方式】
[0035] 下面結合附圖並通過【具體實施方式】來進一步說明本發明的技術方案。
[0036] 下述實施例中所用方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0037] 實驗組一
[0038] 本發明實驗組一所用的凝膠固定液含如下組分：凝膠固定液中的混合酸體積百分 濃度優選為12%，乙醇體積百分濃度優選為50%。具體配製過程如下：
[0039] 將250mL乙醇、30mL乙酸、30mL磷酸和190mL ddH20混勻即可。
[0040] 本發明實驗組一所用的考馬斯亮藍染色液含如下組分：質量體積濃度為0. 05%的 G-250的水溶液，體積百分含量為20%的乙醇，體積百分含量為10%的磷酸，質量體積濃度為 5%的硫酸銨；各溶液採用ddH20配製。具體配製過程如下：
[0041] (1)量取58. 8mL體積百分含量為85%的磷酸加入200mL ddH20中，混勻。
[0042] (2)稱取25. 0g的硫酸銨加入（1)中的混合液，攪拌使硫酸銨溶解完全。
[0043] (3)加入0· 25g的G-250於（2)中的混合液。
[0044] (4)將（3)中所得溶液放到搖床上，設置轉速150rpm，溫度為37°C搖一個小時以 上，保證G-250完全溶解。
[0045] (5)把100mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻備用。
[0046] 本發明提供的利用上述考馬斯亮藍染色液進行染色的方法具體包括以下幾個步 驟：
[0047] (1)將SDS-PAGE凝膠置於固定液中搖30分鐘；
[0048] (2)將SDS-PAGE凝膠轉移至ddH20中漂洗兩次，每次搖15min。
[0049] (3 )將SDS-PAGE凝膠放入上述染色液中，室溫搖動，染色8h。
[0050] (4)將SDS-PAGE凝膠轉移至ddH20中洗掉浮色，基本無背景。
[0051] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝膠指分離膠為質量百分含量為12%聚丙烯醯胺和濃 縮膠為質量百分含量為5%聚丙烯醯胺，使用7cm模具配製1mm厚的凝膠。
[0052] 實驗組二
[0053] 本發明實驗組二所用的凝膠固定液含如下組分：凝膠固定液中的混合酸體積百分 濃度優選為8%，甲醇體積百分濃度優選為30%。具體配製過程如下：
[0054] 將150mL甲醇、20mL乙酸、20mL憐酸和310mL ddH20混合在一起即可。
[0055] 本發明實驗組二所用的考馬斯亮藍染色液含如下組分：質量體積濃度為0. 12%的 R-250的水溶液，體積百分含量為5%的甲醇，體積百分含量為3%的磷酸，質量體積濃度為 3%的硫酸銨；各溶液採用ddH 20配製。具體配製過程如下：
[0056] (1)量取17. 6mL體積百分含量為85%的磷酸加入200mLddH20中，混勻。
[0057] (2)稱取15g的硫酸銨加入（1)中的混合液，攪拌使硫酸銨溶解完全。
[0058] (3)加入0· 6g的R-250於（2)中的混合液。
[0059] (4)將（3)中所得溶液放到搖床上，設置轉速150rpm，溫度為37°C搖一個小時以 上，保證R-250完全溶解。
[0060] (5)把25mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻備用。
[0061] 本發明提供的利用上述考馬斯亮藍染色液進行染色的方法具體包括以下幾個步 驟：
[0062] (1)將SDS-PAGE凝膠置於固定液中搖60分鐘；
[0063] (2)將SDS-PAGE凝膠轉移至H20中漂洗兩次，每次搖15min。
[0064] (3)將SDS-PAGE凝膠放入上述染色液中，室溫搖動，染色12h。
[0065] (4)將SDS-PAGE凝膠轉移至ddH20中，搖床脫色至條帶清晰明亮，背景乾淨。
[0066] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝膠指分離膠為質量百分含量為12%聚丙烯醯胺和濃 縮膠為質量百分含量為5%聚丙烯醯胺，使用的是7cm模具配製1mm厚的凝膠。
[0067] 實驗組三：
[0068] 本發明實驗組三所用的凝膠固定液含如下組分：凝膠固定液中的混合酸體積百分 濃度優選為8%，甲醇體積百分濃度優選為35%。具體配製過程如下：
[0069] 將175mL甲醇、20mL乙酸、20mL磷酸和280mL ddH20混勻即可。
[0070] 本發明實驗組三所用的考馬斯亮藍染色液含如下組分：質量體積濃度為0. 08%的 G-250的水溶液，體積百分含量為15%的甲醇，體積百分含量為8%的磷酸，質量體積濃度為 10%的硫酸銨；各溶液採用ddH 20配製。具體配製過程如下：
[0071] (1)量取47. lmL體積百分含量為85%的磷酸加入200mL ddH20中，混勻。
[0072] (2)稱取40g的硫酸銨加入（1)中的混合液，攪拌使硫酸銨溶解完全。
[0073] (3)加入0· 4g的G-250於（2)中的混合液。
[0074] (4)將（3)中所得溶液放到搖床上，設置轉速150rpm，溫度為37°C搖一個小時以 上，保證G-250完全溶解。
[0075] (5)把75mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻備用。
[0076] 本發明提供的利用上述考馬斯亮藍染色液進行染色的方法具體包括以下幾個步 驟：
[0077] (1)將SDS-PAGE凝膠置於固定液中搖30分鐘；
[0078] (2)將SDS-PAGE凝膠轉移至ddH20中漂洗兩次，每次搖15min。
[0079] (3)將SDS-PAGE凝膠放入上述染色液中，室溫搖動，染色8h。
[0080] (4)將SDS-PAGE凝膠轉移至ddH20中洗掉浮色，基本無背景。
[0081] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝膠指分離膠為質量百分含量為12%聚丙烯醯胺和濃 縮膠為質量百分含量為5%聚丙烯醯胺，使用7cm模具配製1mm厚的凝膠。
[0082] 實驗組四
[0083] 本發明實驗組四所用的凝膠固定液含如下組分：凝膠固定液中的混合酸體積百分 濃度優選為10%，乙醇體積百分濃度優選為40%。具體配製過程如下：
[0084] 將200mL乙醇、25mL乙酸、25mL磷酸和250mL ddH20混勻即可。
[0085] 本發明實驗組四所用的考馬斯亮藍染色液含如下組分：質量體積濃度為0. 10%的 R-250的水溶液，體積百分含量為10%的甲醇，體積百分含量為5%的磷酸，質量體積濃度為 5%的硫酸銨；各溶液採用ddH 20配製。具體配製過程如下：
[0086] (1)量取29. 4mL體積百分含量為85%的磷酸加入200mLddH20中，混勻。
[0087] (2)稱取25g的硫酸銨加入（1)中的混合液，攪拌使硫酸銨溶解完全。
[0088] (3)加入0· 5g的R-250於（2)中的混合液。
[0089] (4)將（3)中所得溶液放到搖床上，設置轉速150rpm，溫度為37°C搖一個小時以 上，保證R-250完全溶解。
[0090] (5)把50mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻備用。
[0091] 本發明提供的利用上述考馬斯亮藍染色液進行染色的方法具體包括以下幾個步 驟：
[0092] (1)將SDS-PAGE凝膠置於固定液中搖30分鐘；
[0093] (2)將SDS-PAGE凝膠轉移至H20中漂洗兩次，每次搖15min。
[0094] (3 )將SDS-PAGE凝膠放入上述染色液中，室溫搖動，染色8h。
[0095] (4)將SDS-PAGE凝膠轉移至ddH20中，搖床脫色至條帶清晰明亮，背景乾淨。
[0096] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝膠指分離膠為質量百分含量為12%聚丙烯醯胺和濃 縮膠為質量百分含量為5%聚丙烯醯胺，使用的是7cm模具配製1mm厚的凝膠。
[0097] 對照實驗組
[0098] 對照實驗組一選用了 Blue Silver染色法，染色步驟如下：
[0099] (1)將 SDS-PAGE 凝膠置於染色液（0. 12%CBB G-250、10% 硫酸銨、10% 磷酸、20% 甲 醇水溶液）中染色過夜；
[0100] (2)染色完成後，SDS-PAGE凝膠用蒸餾水漂洗脫色，直至背景無顏色即可。
[0101] 對照實驗組二選用了經典的Meyer Stain染色法，染色步驟如下：
[0102] (1)將SDS-PAGE凝膠置於染色液（0. 1%的R-250,45%的甲醇，10%乙酸）中搖lh ;
[0103] (2)染色完成後，SDS-PAGE凝膠用蒸餾水漂洗一下，轉入脫色液（25%乙醇、8%乙 酸）中脫色，每15min更換一次脫色液，直至背景無顏色即可。
[0104] 其中上述染色過程中所用甲醇硫酸銨優選自生工生物，R-250、G-250等均優選自 Amresco〇
[0105] 1、實驗組一至四和對照組的染色實驗結果如圖1-6所示。
[0106] 其中實驗組一的靈敏度也可達到10ng，與Blue Sliver的靈敏度10ng相當，但減 少了 58. 3%的染色試劑G-250和50%的硫酸銨消耗，高於Meyer Stain法靈敏度20ng，並且 所得的凝膠背景淺，用蒸餾水旋搖洗掉凝膠表面的浮色即可獲得清晰明亮的條帶，再用蒸 餾水震蕩lh即可完成脫色，整個過程凝膠膨脹變化小，有利於後續的質譜分析。
[0107] 實驗組二的靈敏度可達到8ng，與Blue Sliver的靈敏度10ng相當，但減少了 50% 的甲醇、70%的磷酸和70%的硫酸銨消耗，高於Meyer Stain法靈敏度20ng，並且所得的凝 膠背景淺，用蒸餾水旋搖洗掉凝膠表面的浮色即可獲得清晰明亮的條帶，無需脫色液即可 完成脫色，整個過程凝膠膨脹變化小，有利於後續的質譜分析。
[0108] 實驗組三的靈敏度可達到2ng，與Blue Sliver的靈敏度10ng相當，但減少了 25% 的染色試劑G-250、25%的甲醇、20%的磷酸和20%的硫酸銨消耗，高於Meyer Stain法靈敏 度20ng，並且所得的凝膠背景淺，用蒸餾水旋搖洗掉凝膠表面的浮色即可獲得清晰明亮的 條帶，再用蒸餾水震蕩lh即可完成脫色，整個過程凝膠膨脹變化小，有利於後續的質譜分 析。
[0109] 實驗組四的靈敏度也可達到10ng，與Blue Sliver的靈敏度10ng相當，但減少了 16. 7%的染色試劑G-250、50%的甲醇、50%的磷酸和50%的硫酸銨消耗，高於Meyer Stain法 靈敏度20ng，並且所得的凝膠背景淺，用蒸餾水旋搖洗掉凝膠表面的浮色即可獲得清晰明 亮的條帶，無需脫色液即可完成脫色，整個過程凝膠膨脹變化小，有利於後續的質譜分析。
[0110] 其中實驗組一至實驗組四的靈敏度差異不大，約為6ng左右，與對照實驗組一 (Blue Silver)的靈敏度10ng相當，遠遠高於對照實驗組二（Meyer Stain)染色法僅能檢 測到20ng的牛血清蛋白（BSA)。本發明的靈敏度與Blue Sliver的靈敏度相當，比經典的 Meyer Stain染色法靈敏度高很多，且本發明所需試劑少，成本低，產生的廢液量也顯著降 低，更加環保，與對照實驗組一相比能降低50%以上的試劑消耗。此外對照實驗組Meyer Stain和Blue Sliver染色法的脫色時間較長，膠體易碎，但實驗組一至四染色後基本無背 景，用蒸餾水洗掉浮色即可，無需脫色液即可完成脫色，故整個過程凝膠膨脹變化小，膠體 不易碎，更有利於後續的質譜分析。
[0111] 2、Blue Silver、Meyer Stain染色法與本發明實驗組三、實驗組四染色法線性關 系比較
[0112] 雙向電泳技術是蛋白質組學研究中的經典技術，複雜的蛋白樣品，經過雙向電泳 分離後，再經染色，通過比較不同蛋白含量和不同樣本中相同蛋白的含量差異，尋找有興趣 的區域，再結合質譜對其進行鑑定。那麼一個染色方法具備良好的定量線性關係對於基於 雙向電泳技術的蛋白質組學研究而言是非常重要，因此考察較寬濃度範圍內的蛋白著色情 況及其響應的線性關係是非常必要的，此外，低豐度蛋白（low abundance protein)在細胞 內可能具有重要的調節功能，代表蛋白質組研究的"冰山之尖"，因此考察低濃度蛋白著色 情況及其在較窄濃度範圍內響應的線性關係也是非常必要的。故本發明考察了實驗組三、 實驗組四、Blue Silver和Meyer Stain四種染色方法的線性關係，分別對它們的SDS-PAGE 凝膠蛋白條帶光密度值（Vol%)與1?lOOOng範圍的BSA含量的相關性進行分析，以及 SDS-PAGE凝膠蛋白條帶光密度值（Vol%)與低濃度範圍的BSA(1?10ng)的相關性進行分 析，結果見圖7和圖8。
[0113] 從圖7中可以看出，在BSA含量為1?lOOOng範圍內，四種染色方法均有相對較 好的線性關係；但從圖8中可以看出，在低含量的BSA (1?10ng)梯度內，Meyer Stain、 Blue Silver和實驗組四都不能隨著蛋白量的增加而形成一定的線性關係，而實驗組三不 僅在1?lOOOng BSA範圍內線性關係良好，且在低含量的BSA (1?10ng)範圍內仍保持 較好的線性關係。從各染色方法低蛋白含量線性關係圖可以看出，實驗組三具有較寬的定 量線性範圍，因此，CBBG-250在該染色體系中比CBB R-250有更加廣泛的適用性，更加適合 於定量。另外，也表明通過染色前增加固定過程，染色液中磷酸、硫酸銨、甲醇的濃度降低對 定量結果是有利的。
[0114] 3、Blue Silver、Meyer Stain染色法與本發明實驗組三、實驗組四染色法質譜兼 容性評估
[0115] 儘管以上評價結果表明本發明實驗組三、實驗組四為靈敏的蛋白染色方法，在一 定範圍內定量線性關係也較好，但是由於不同的染色方法對後續的質譜分析有重要影響， 因此評價改良方法的質譜兼容也非常重要。為了評價四種染色方法的質譜兼容性情況，我 們將其SDS-PAGE凝膠中250ng和50ng的BSA條帶進行膠內酶解消化，然後進行質譜分析 (見圖3)及鑑定，結果見表1 ;圖表結果表明實驗組三在低蛋白含量時依然保持了較好的質 譜兼容性，能準確鑑定出BSA，而其它三種方法在低蛋白含量時不能穩定鑑定或不能鑑定出 BSA。該結果說明本發明的實驗組三更有利於後續質譜分析。
[0116] 表1四種染色方法的SDS-PAGE凝膠中BSA條帶MALDI-T0F/T0F鑑定分析情況表
[0117]

【權利要求】
1. 一種用於考馬斯亮藍染色的固定液，其特徵在於，所述固定液包含酸和醇，其中所述 醇為甲醇和/或乙醇，所述酸為:V_g=l: 1的混合酸。
2. 根據權利要求1所述的固定液，其特徵在於，所述醇的體積百分濃度為30%?50%， 優選為35%?45%，最優選40%。
3. 根據權利要求1或2所述的固定液，其特徵在於，所述混合酸的體積百分濃度為 8%?12%，優選為9%-11%，最優選10%。
4. 一種考馬斯亮藍染色液，其特徵在於，所述的染色液包含質量體積濃度為0. 05%? 0. 12%，優選為0. 08%?0. 10%的考馬斯亮藍，體積百分含量為5%?20%，優選為10%?15% 的醇，體積百分含量為3%?10%，優選為5%的酸，質量體積濃度為3%?10%，優選為5%的 硫酸銨；其中所述考馬斯亮藍包括R250和G250中的至少一種；所述醇包括甲醇和乙醇中 的至少一種；所述的酸包括乙酸和磷酸中的至少一種，優選的為磷酸。
5. 根據權利要求4中所述的染色液，其特徵在於，所述醇為甲醇和/或乙醇。
6. 根據權利要求4或5所述的染色液，其特徵在於，所述酸為磷酸。
7. -種考馬斯亮藍染色方法，其特徵在於，所述方法包括將SDS-PAGE凝膠置於根據權 利要求1至3中任一項所述的固定液中進行固定和/或將SDS-PAGE凝膠置於根據權利要 求4至6中任一項所述的染色液進行染色，任選地在所述固定和/或所述染色後在ddH 20中 進行漂洗。
8. 根據權利要求7中所述的方法，其特徵在於，所述固定的時間為30?60min，優選地 40?50分鐘，更優選地45分鐘。
9. 根據權利要求7或8中所述的方法，其特徵在於，所述染色的時間為8h?12h，優選 地9?llh，更優選地10h。
10. 根據權利要求1至3中任一項所述的固定液、根據權利要求4至6中任一項所述 的染色液和/或根據權利要求7至9中任一項所述的方法在蛋白質組學研究中的定性和/ 或定量中的應用。
【文檔編號】C09B67/14GK104266893SQ201410083962
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】饒維橋, 訾金, 肖偉敏, 張繼遠, 饒媛, 林梁 申請人:深圳華大基因研究院