MALDI‑TOFMS技術鑑定臨床感染豬腸球菌的方法與流程
2023-05-01 12:00:06 1
本發明涉及細菌檢測領域，尤其是公開了一種maldi-tofms技術鑑定臨床感染豬腸球菌的方法。
背景技術：
腸球菌為革蘭陽性兼性厭氧菌，是動物性食品汙染的常見菌之一，近來腸球菌對動物致病性的報導不斷增多，尤其是20～70日齡豬常發生一種高熱、皮下及實質臟器腫大、出血為主要特徵的傳染病，以散養和小規模豬群多發，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。由於腸球菌對現有抗生素均產生不同程度的耐藥性，且抗性基因通過食物鏈由動物傳播給人或在其他細菌之間傳遞，這使得腸球菌快速準確的鑑定顯得尤為重要，並對感染腸球菌的診斷和治療具有重要意義。
技術實現要素：
本發明克服現有技術存在的不足，提供一種操作簡便、快速、準確性高的鑑定臨床感染豬腸球菌的方法。
為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為：maldi-tofms技術鑑定臨床感染豬腸球菌的方法，其特徵在於，包括以下步驟：
步驟一：採用甲酸提取法對樣品進行處理與點樣；
1)向1.5mlep離心管中加入300μl去離子水；取待測樣本(一個菌落)5-10mg至離心管中；充分混勻；加入900μl無水乙醇，充分混勻；
2)13000rpm離心2min，倒去上清。再次離心，用移液槍完全吸取殘餘的上清液，整個過程不觸碰沉澱。室溫下乾燥沉澱2-3min。
3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混勻；再加入50μl的純乙腈，充分混勻；13000rpm離心2min，吸取上清置於另一新的離心管中；
4)取上清1μl置於maldi靶板上，室溫晾乾，再加1μlhcca基質液覆蓋樣品，室溫晾乾後上機；
5)分別取等體積的標準肽溶液與基質溶液混合後，取1μl混合液置於maldi靶板上，室溫晾乾，待完全乾燥後進行檢測，每個樣品和標準品各做三個平行孔。
步驟二：利用maldibiotyper高通量微生物鑑定系統對經過步驟一處理的樣品進行質譜分析，得到質譜圖；
放入已點好樣品和校準品的靶板。打開flexcontrol，校準儀器，先用標準品進行系統誤差校正，再進行待測樣本的質譜分析，通過biotyper軟體進行分析鑑定。
步驟三：使用biotyper軟體，對得到的質譜圖進行分析，得到腸球菌質譜圖資料庫的標準圖譜；
步驟四：將待檢測的腸球菌用腦心浸液瓊脂培養及分純，並進行步驟一和步驟二處理；
步驟五：對待檢測的腸球菌質譜圖進行聚類分析。
所述步驟一具體包括以下步驟：1)向1.5mlep離心管中加入300μl去離子水；取待測樣本5-10mg至離心管中；充分混勻；加入900μl無水乙醇，充分混勻；
2)13000rpm離心2min，倒去上清；再次離心，用移液槍完全吸取殘餘的上清液，整個過程不觸碰沉澱；室溫下乾燥沉澱2-3min；
3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混勻；再加入50μl的純乙腈，充分混勻；13000rpm離心2min，吸取上清置於另一新的離心管中；
4)取上清1μl置於maldi靶板上，室溫晾乾，再加1μlhcca基質液覆蓋樣品，室溫晾乾後上機；
5)分別取等體積的標準肽溶液與基質溶液混合後，取1μl混合液置於maldi靶板上，室溫晾乾，每個樣品和標準品各做三個平行孔；所述步驟二具體包括以下步驟：放入已點好樣品和校準品的靶板；打開flexcontrol，校準儀器，先用標準品進行系統誤差校正，再進行待測樣本的質譜分析，通過biotyper軟體進行分析鑑定。
所述樣品為16srrna確認的臨床株；所述標準品為atcc29212糞腸球菌。
所述步驟三具體包括以下步驟：對樣品處理與點樣，每個平行樣品重複點3個樣品孔；每個樣品孔採集8張質譜圖；每個菌株採集24張譜圖，共收集到240張並保存；使用biotyper軟體，分別調入所採集的每株腸球菌的質譜圖，將此質譜圖匯總進行分析，該圖譜即為腸球菌質譜圖資料庫的標準圖譜。
所述待檢測的腸球菌為33株腸球菌臨床野生株。
本發明與現有技術相比有以下有益效果：
本發明採用的檢測方法與傳統和基因型鑑定方法相比，maldi-tofms是基於蛋白指紋圖譜的鑑定方法，操作簡便、快速、準確性高。本研究從河南不同地區病豬分離的腸球菌，利用maldi-tofms方法鑑定均為糞腸球菌和屎腸球菌，且親緣關係較近。而糞腸球菌和屎腸球菌是所有腸球菌感染致病中較為常見的菌株，也是醫院、食品和豬糞等環境中的優勢菌，由於腸球菌具有較強的獲得性耐藥能力，且在各種環境中生存能力較強，maldi-tofms方法對腸球菌的快速鑑定，可避免菌株的傳播和更多耐藥菌株的產生，對於獸醫臨床實踐具有重要的意義。
附圖說明
圖1為腸球菌的主要離子峰圖譜；
圖2為33株腸球菌的可信度分值；
圖3為33株腸球菌指紋圖譜的聚類分析。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述，以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
本實施例中，10株建庫的腸球菌為16srrna確認的臨床株，33株建庫後驗證的腸球菌為臨床野生分離株。質控菌株atcc29212為糞腸球菌，以上均為河南農業大學贈送。
實驗中用到的甲酸、乙腈、三氟乙酸、無水乙醇都是由fisher公司提供的色譜純。bts標準品、基質α-氰-4-羥基肉桂酸(hcca)、msp96孔靶由德國bruker公司提供。
革蘭陽性細菌鑑定卡(gpi；生產批號：b56k)，購自法國生物梅裡埃中國有限公司產品；
腦心浸液瓊脂培養基(bhi)(生產批號：160220)購自北京陸橋；maldibiotyper高通量微生物鑑定系統，購自德國brukerdahonics公司，參數設置：線性操作模式，正離子，基質抑制偏轉模式。脈衝離子提取時間：100ns。相對分子質量：2000～20000d；
具體鑑定方法包括如下步驟：
步驟一：採用甲酸提取法對樣品進行處理與點樣；
步驟二：利用maldibiotyper高通量微生物鑑定系統對經過步驟一處理的樣品進行質譜分析，得到質譜圖；
步驟三：使用biotyper軟體，對得到的質譜圖進行分析，得到腸球菌質譜圖資料庫的標準圖譜；
步驟四：將待檢測的腸球菌用腦心浸液瓊脂培養及分純，並進行步驟一和步驟二處理；
步驟五：對待檢測的腸球菌質譜圖進行聚類分析。
1.2.1樣品處理與點樣採用甲酸提取法
1)向1.5mlep離心管中加入300μl去離子水；取待測樣本(一個菌落)5-10mg至離心管中。充分混勻；加入900μl無水乙醇，充分混勻；
2)13000rpm離心2min，倒去上清。再次離心，用移液槍完全吸取殘餘的上清液，整個過程不觸碰沉澱。室溫下乾燥沉澱2-3min；
3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混勻；再加入50μl的純乙腈，充分混勻；13000rpm離心2min，吸取上清置於另一新的離心管中；
4)取上清1μl置於maldi靶板上，室溫晾乾，再加1μlhcca基質液覆蓋樣品，室溫晾乾後上機；
5)分別取等體積的標準肽溶液與基質溶液混合後，取1μl混合液置於maldi靶板上，室溫晾乾，待完全乾燥後進行檢測，每個樣品和標準品各做三個平行孔；
1.2.2數據採集
放入已點好樣品和校準品的靶板。打開flexcontrol，校準儀器，先用標準品進行系統誤差校正，再進行待測樣本的質譜分析，通過biotyper軟體進行分析鑑定。
1.2.3建立資料庫的方法
按1.2.1.1的方法進行樣品處理與點樣，每個平行樣品重複點3個樣品孔。每個樣品孔採集8張質譜圖。每個菌株採集24張譜圖，共收集到240張並保存。使用biotyper軟體，分別調入所採集的每株腸球菌的質譜圖，將此質譜圖匯總(已有資料庫和新建資料庫)進行分析，該圖譜腸球菌質譜圖資料庫的標準圖譜。
1.2.4臨床野生株的鑑定
取33株腸球菌臨床野生株，用腦心浸液瓊脂(bhi)培養及分純，
參照上述建庫時的處理方法，然後上機。
1.2.5結果判斷如表1所示為質譜數據判斷標準
表1
2結果
2.1建庫
經過16srrna確認的10株腸球菌臨床株，用於建立maldi-tofms資料庫，對10株菌全部進行了數據採集與匯總，建立了標準圖譜，最終建成包含10株腸球菌信息的資料庫，如圖1所示。這10株腸球菌菌株的主要離子峰一致，峰譜穩定；
2.2臨床野生株的鑑定
依次將1-33株腸球菌如圖2所示，分別進行鑑定，分析與腸球菌資料庫中的匹配結果。經maldi-tofms鑑定，33株腸球菌的匹配分值均大於2.300，表明鑑定結果的可信度很高。
2.3腸球菌maldi-tofms質譜聚類分析結果
選取33株腸球菌質譜圖進行聚類分析，採用相似分值構建系統樹，33株腸球菌聚類分型樹狀圖如圖3所示。差異程度0-1000表示菌株之間的同源性程度高低，差異程度越接近1000，表示菌株同源性越低，越接近0時表示菌株同源性越高。經maldi-tofms分析33株腸球菌在差異程度為0.8時分成兩個主要的類別，用不同的顏色標示，其中綠色為糞腸球菌共13株，紅色為屎腸球菌20株,1號菌株為糞腸球菌atcc29212，與5號菌株同源性最高，與屎腸球菌相比，糞腸球菌的親緣關係更近一些。
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換,凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。