一個水稻基因kt484在提高植物耐逆性能上的應用的製作方法
2023-05-01 12:06:01 1
專利名稱：一個水稻基因kt484在提高植物耐逆性能上的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程和分子生物學領域，具體涉及植物耐逆性相關的基因 及其應用。
背景技術：
轉錄因子是一類調控基因表達的關鍵基因，對作物的生長發育起著重要的調節 作用。利用生物信息手段，根據轉錄因子的結構特點從基因組水平推測的轉錄因子基因 是一組最有可能具有明確功能的基因。多年以來，轉錄因子的克隆和功能研究一直是科 學研究的熱點之一。科學家們利用不同的研究路線分離鑑定了大量的轉錄因子，豐富了 轉錄因子資料庫，也從中發現了一些與農藝性狀相關調控因子，為農作物的性狀改良提 供了重要基因資源。轉錄因子是調控基因表達的關鍵基因，對作物的生長發育起著重要的調節作 用。多年以來，轉錄因子的克隆和功能研究一直是科學研究的熱點之一，科學家們利用 不同的研究路線分離鑑定了大量的轉錄因子，也從中發現了一些與農藝性狀相關的調控 因子，為農作物的性狀改良提供了重要基因資源。水稻是單子葉模式植物，又是我國的 重要糧食作物。在水稻基因組測序工作完成後，許多資料庫對水稻基因組進行了分析。 據預測，在秈稻和粳稻中分別包含2,025個和2,384個轉錄因子，分屬於63個轉錄因子基 因家族，如 WRKY (111/113，秈稻 / 粳稻)、bZIP (88/109), AP2/EREBP (174/182)、 AUX/IAA(30/46)、MYB(136/138), HB(84/103)等。根據以往的文獻報導與資料庫 的功能注釋，這裡既包含植物所特有的轉錄因子家族，如WRKY，也包含與植物生長發 育、抗逆性等密切相關的其它一些轉錄因子家族，如bZIP、AP2/EREBP、MYB等。利 用這些資料庫，結合基因晶片雜交、EST序列等基因表達信息，從基因組水平預測和分 離水稻轉錄因子全長cDNA，並利用已經建立的高效的水稻轉化系統使其在水稻中過量表 達，對其進行規模化功能驗證，進一步通過研究轉基因水稻的表型變化及抗逆性能的改 變等特性推斷轉錄因子的功能；在大量的重複性的植物轉化、表型分析、功能鑑定等工 作的基礎上，尋找在改良農作物中具有實用價值的植物重要調節因子，並應用於作物的 性狀改良，從而有效解決農業生產中的實際問題，具有重要的理論意義和應用價值。
發明內容
本發明的目的是提供一個與耐逆性相關的水稻基因KT484，以用於提高植物的 耐逆性能。本發明所提供的基因KT484，來源於稻屬水稻(Oryza sativa L.)，編碼具有下述 胺基酸序列的蛋白質1)序列表中的 SEQ IDNO 1 ；序列表中的SEQ ID NO 1由250個胺基酸殘基組成，為蛋白KT484。本發明中KT484的編碼基因既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組DNA序列，或者是與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA 序列。具有SEQ ID NO 1所示胺基酸序列的編碼基因可以具有序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸序列。含有本發明基因的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範 圍。擴增KT484任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內。本發明的另一個目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。本發明所提供的提高植物耐逆性的方法，是將編碼本發明與耐逆性相關的 KT484基因導入植物組織、細胞或器官，植物耐逆性獲得提高。在上述提高植物耐逆性的方法中，本發明中水稻與耐逆性相關的KT484基因既 可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90% 以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列 用已知的方法進行分離和/或修飾和/或設計得到的。本領域的技術人員應該理解的是， 特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會導致該基因效能的降低或者加強，而且 在一些應用(例如，反義或共抑制技術)中，部分序列經常會和全長序列同樣有效地發揮 作用。基因序列變化或縮短的方法，以及測試這些發生變化的基因的有效性的方法均是 本領域技術人員熟知的。本發明水稻與耐逆性相關KT484基因或其同源序列可通過植物表達載體導入植 物組織、細胞或器官；用於構建所述植物表達載體的出發載體可為任意一種可用於根瘤 農桿菌或髮根農桿菌轉化植物的雙元載體或可用於植物微彈轟擊的載體等，如pBin系列 載體(如pBinl9等)、pBI系列載體(如pBI 101等)、Gateway 系列載體(如pH2GW7 等)、pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表達載 體，所述出發載體還可為可在原核生物中複製的載體，如pENTER-TOPO、pUC系列載 體或pBluescript系列載體等。使用本發明中水稻與耐逆性相關的KT484基因或其同源序列構建植物表達載 體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型 (ABA、乾旱、鹽鹼或化學誘導等)啟動子。所述組成性表達啟動子可為花椰菜花葉病毒 (CAMV) 35S啟動子，玉米Ubiquitin啟動子或水稻actinl啟動子等；所述組織特異性表 達啟動子可為根特異性表達啟動子、葉片特異性表達啟動子、維管特異性表達啟動子、 種子特異性表達啟動子、花特異性表達啟動子或花粉特異性表達啟動子，如2S1啟動子 (GenBank 號NM_118848.2，GI: 30687489)禾Π NapinA (GenBank 號Μ64633.1，GI: 349405)啟動子等；所述誘導型啟動子可為受低溫、乾旱、ΑΒΑ、乙烯、鹽鹼或化學等 誘導的啟動子。上述啟動子可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。此外，使用 本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子和/或轉錄增強 子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序 列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源 是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結 構基因。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS 基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(新黴素磷酸轉移酶 (NPTII)基因、潮黴素磷酸轉移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大黴素標記 物或卡那黴素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新黴 素磷酸轉移酶(NPTII)基因的宿主植物細胞、組織或器官可由卡那黴素或其替代衍生物 如G418等進行篩選，含潮黴素磷酸轉移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植 物細胞、組織或器官可由潮黴素進行篩選。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。經上述方法進行篩選後還可採用Southern、 PCR或點雜交等分子檢測手段對轉基因植株進行檢測，以確定其是否轉化有目的基因。其中，本發明以pCAMBIA1300為出發載體，構建的含有本發明水稻與耐逆性 相關的KT484基因的植物表達載體命名為PCactF-KT484。攜帶有本發明水稻與耐逆性相 關的KT484基因或其同源序列的植物表達載體可通過使用原生質體_化學介導法(Ca2+、 PEG)、Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、花粉管導入、微注射、電 激、基因槍、農桿菌介導等常規生物學方法中的任何一種或幾種方法的組合轉化植物細 胞、組織或器官，並將轉化的植物細胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包 括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。此外，通過將轉化有本發明水稻與耐逆性相關的KT484基因或其同源序列的轉 基因植株進行繼代培養後，可從中進一步篩選出基因純合的轉基因植株。此外，還可對 該轉基因植株進行擴繁，可使轉基因植物的耐逆性進一步改善和提高。所述轉基因植物 的擴繁包括無性繁殖和/或種子繁殖。本發明的方法對雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉化的植物細 胞、組織或器官既可來源於菸草、油菜、棉花、大豆、楊樹、桉樹、馬鈴薯或牧草等雙 子葉植物，也可來源於水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、穀子或草坪草等單子葉植物。本發明提供了一個水稻與耐逆性相關的核定位蛋白基因KT484。實驗證明，將 本發明的基因轉化水稻可提高水稻對低溫和乾旱逆境脅迫的耐受性。本發明的蛋白及其 編碼基因對於植物耐逆機制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關性狀的改良具有重要 的理論及實際意義，將在植物(特別是禾穀類作物)的耐逆基因工程改良中發揮重要作 用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1表達載體pCactF的T-DNA區圖譜。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和 右邊界；hyg表示潮黴素抗性；p35S表示35S基因的啟動子；CaMV35S ter表示35S基因 的終止子；pActl表示水稻Actinl基因的啟動子；3flag表示3倍的flag標籤序列；OCS 表示ocs基因的終止子；HindIIK KpnK SpeK XbaK SalI和PstI分別表示限制性內切酶
的酶切位點。圖2KT484轉基因株系的耐冷性分析。A 冷處理前苗生長狀態；B 冷處理後 苗生長狀態；C:恢復正常培養7天後苗生長狀態；D:冷處理後存活率統計。圖3KT484轉基因株系的表達分析。「1」為質粒對照；「2」為中花11; 「3」為轉空載體株系；「4-7」為KT484轉基因各株系；KT484為KT484基因的擴增產物； actin為水稻內參基因Actin的擴增產物。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見《分子克 隆》。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術有限公司合成，測序由北京華大基因 研究中心完成，載體構建過程中的核酸限制性內切酶及T4 DNA連接酶等均購自NEB公 司，方法均參照試劑盒提供的方法進行。實驗中所用的載體骨架來自於pCAMBIA1300。1、KT484基因的分離從KT484基因的編碼起始位點ATG開始設計5』端引物，於終止密碼處設計3』 端引物引物1:5，GCACGCtctagaATGGAGCCATCATCACAACCTCA 3』引物2:5，GCACGCgtcgacTTAATCACTTTGCTGCTCTGCAGG 3，弓丨物1中tctaga序列為限制性內切酶XbaI的酶切位點，下劃線標識的序列為 KT484基因的編碼序列；弓丨物2中gtcgac序列為限制性內切酶SalI的酶切位點，下劃線 標識的序列為KT484基因的編碼序列。提取幼苗期的日本晴水稻的總RNA，通過反轉錄得到CDNA作為模板，用以上 引物擴增KT484基因的全長，其大小為753bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO : 2 所示，所編碼的蛋白質胺基酸序列如序列表中的SEQIDNO : 1所示。具體反應為取約2 μ g的總RNA，力卩入1 μ 1 10 X DNase buffer, 1 μ 1的 DNase,補DEPC處理過的水至10 μ 1體系，混勻，37°C溫育30min後，加入1 μ 1的RQ DNase stop solution, 65°C溫育 IOmin 以終止反應後，加入2 μ 1 Oligo (dT) 18primer(0.1 μ g/ μ 1), 4 μ 1 5 X First-strand buffer, 1 μ 1 Ribonuclease inhibitor (40U/ μ 1), 2yl4XdNTP (各 IOmM)，1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，小心混勻，37 °C 保溫 1 小時。 然後90°C處理5分鐘，冰上冷卻，離心收集即獲得相應的反轉錄產物cDNA。將得到 的cDNA稀釋10倍，取Iyl作為PCR反應的模板，上、下遊引物(10 μ Μ)各1 μ 1， LA Taq 酶(5U/μ 1) 0.5 μ 1，4 XdNTPs (各 IOmM) 1 μ 1，2 X GCbuffer (Mg2+) 25 μ 1，H2O 20.5 μ L PCR反應條件為預熱95°C 5min，變性94°Clmin，退火56°C30sec，延伸 72°C lmin50sec, 34個循環。反應結束後，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢 測，獲得了大小分別與預期結果相符的DNA片段。分別回收並純化上述片段，將其連接 入載體pEASY-Tl (全式金公司)中，通過熱激法轉化大腸桿菌(E.coli)TOPlO菌株，挑 選陽性菌落加入到5ml含50mg/L卡那黴素的LB液體培養基中，37°C、200rpm的搖床中 培養12-16小時，提取質粒，分別得到含有目的片段的重組質粒，測序驗證正確後，用 XbaI和SalI雙酶切切下目的片段KT484，連入進行相同雙酶切的pCactF植物表達載體， 構建得到載體pCactF-KT484。挑取菌落PCR鑑定為陽性的菌落進行測序驗證。植物表 達載體pCactF的T-DNA區圖譜如圖1所示。2、KT484轉基因水稻的獲得用農桿菌介導法將按具體實施方式
2獲得的與耐逆性相關的基因KT484轉化水 稻，具體方法如下
利用熱激法將上述重組載體pCactF_KT484轉入農桿菌AGLO菌株(中國科學院 遺傳所贈送)，利用農桿菌對水稻進行共轉化。將獲得的水稻轉基因植株的部分葉片，按常規方法提取總DNA，在正向引物 5，-ACTCACCGCGACGTCTGT-3，和反向引物 5，-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3，的
引導下，PCR擴增潮黴素磷酸轉移酶基因，經擴增獲得1009bpDNA片段的為陽性轉基因 植株，檢測結果表明用上述方法獲得了轉化有pCactF-KT484的轉基因水稻。3、KT484轉基因水稻株系的耐冷性分析收穫KT484的Tl代轉基因水稻種子，選取6個以上的株系進行低溫脅迫。用水 浸種培養3天使其萌發，然後用50mg/L潮黴素進行抗性篩選，同時以轉空載體的水稻中 花11作對照，篩選5天後，對照植株全部死亡，統計轉基因植株抗性苗與死亡苗數，分 析轉基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3 1的株系，結果表 明獲得了具有單位點插入的KT484的Tl轉基因株系，待苗長到8cm左右時，將小苗從培 養皿中轉移到三角瓶中，每瓶10株，三個重複。培養至三葉期(第3片葉完全舒展)， 其生長狀態如圖2A。開始4°C冷篩，當對照新葉、老葉全卷後1至2天(圖2B)，重新 正常培養，期間三角瓶中的營養液2天更換一次，以保持營養液的新鮮狀態。低溫篩選 結果如圖2C所示，轉空載體對照株系大部分都已發黃、萎蔫、死亡，而轉基因植株表現 出很強的低溫耐受力和恢復能力，恢復一周後的存活率統計如圖2D所示，轉基因株系的 存活率均比對照要高。在獲得KT484轉基因水稻T2代的種子後，我們再一次進行了耐冷性實驗，結果 與上述實驗結果相一致。此實驗說明KT484基因具有增強水稻耐受低溫的能力。4、KT484轉基因水稻株系的表達分析KT484基因的RT-PCR檢測引物引物3: 5' GATAAAGTCGAGGGGGGGCC 3'引物4 5' GCACGCgtcgacTTAATCACTTTGCTGCTCTGCAGG 3『KT484基因的RT-PCR擴增片段是773bp。Actin基因的RT-PCR檢測引物弓丨物5: 5，-TGTTCCTGCCATGTATGT-3，弓丨物6: 5，-ATGTCCCTCACAATTTCC-3『Actin基因的RT-PCR擴增片段是252bp。以上引物分別以KT484轉基因水稻幼苗cDNA為模板，陰性對照模板為正常生 長的中花11幼苗cDNA，檢測這些基因在轉基因水稻中的表達變化，PCR檢測體系和程
序為
IOXbuffer 2μ 1
IOmM dNTP 0.4 μ 1
10 μ M弓丨物F 0.4 μ
10 μ M弓丨物R 0.4 μ
Taq polymerase 0.4 μ 1
cDNA 1 μ 1
ddH20 15.4 μ 1
PCR反應條件為預變性95°C，5分鐘；變性94 °C，30秒，，退火 55°C, 30 秒，延伸72°C，2min, 28 個循環；72°C，10 分鐘。反應結束後，對PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR檢測結果見圖 3，其中泳道「1」為質粒對照；「2」為中花11; 「3」為轉空載體株系；「4-7」為 KT484轉基因各株系；KT484指該基因的擴增產物；actin指水稻actin基因的擴增產物。 由圖可見，KT484基因在轉基因水稻中均有表達。
權利要求
1.一種增強植物抗逆性的方法，其特徵是將植物抗逆相關蛋白的編碼基因插入表達 載體，獲得含有植物抗逆相關蛋白編碼基因的重組表達載體，將該重組表達載體導入目 的植物，從表達所述植物抗逆相關蛋白的植株或所述植物抗逆相關蛋白表達量增加的植 株中篩選得到抗逆性增強的植株；其中，所述植物抗逆相關蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.權利要求1所述的增強植物抗逆性的方法，其特徵在於所述植物抗性相關蛋白 的編碼基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 2所示的核苷酸序列；2)與SEQID NO 2序列具有90%以上相似性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
3.權利要求1所述的方法，其特徵在於將所述抗逆相關蛋白編碼基因導入植物組 織、細胞或器官，再將被轉化的植物細胞、組織或器官培育成植株，得到耐逆性提高的 轉基因植物。
4.權利要求1所述的方法，其中所述表達載體的特徵是用於構建所述植物表達載 體的出發載體是一種可用於根瘤農桿菌或髮根農桿菌轉化植物的雙元載體或可用於植物 微彈轟擊的載體，或者是可在原核生物中複製的載體。
5.權利要求4所述的方法，其中所述表達載體的特徵是用所述抗逆相關蛋白編碼 基因構建植物表達載體時，用一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子來驅動 其表達。
6.權利要求4所述的方法，其中所述出發載體為pCAMBIA系列載體，優選為 pCAMBIA1300。
7.權利要求1所述的方法，其中所述增強植物的抗逆性是指增強植物耐受低溫和乾旱 的能力。
8.權利要求1所述的方法，其中所述抗逆相關蛋白可用於增強轉基因水稻的耐逆性。
9.權利要求8所述的方法，其中所述增強轉基因水稻的耐逆性是指增強了水稻對低溫 和乾旱的耐受性。
全文摘要
本發明公開了一個來源於水稻的與耐逆性相關的基因KT484。實驗證明，將本發明的基因轉化水稻可顯著提高水稻對逆境脅迫乾旱和低溫的耐受性。本發明的蛋白及其編碼基因對於植物耐逆機制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關性狀的改良具有重要的理論及實際意義，將在植物(特別是禾穀類作物)的耐逆基因工程改良中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C07K14/415GK102021179SQ20101056600
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月25日 優先權日2009年11月25日
發明者劉春霞, 劉雨, 周君莉, 李早霞, 李曉娟, 王喜萍 申請人:北京未名凱拓作物設計中心有限公司