一種調控根系發育的蘋果生長素運輸載體基因MdPIN1及其應用的製作方法

2023-05-01 00:14:47 1

本發明涉及分子生物學和生物技術領域，具體涉及一種蘋果調控生長素運輸及根系發育基因MdPIN1的克隆及其應用。

背景技術：

生長素是一種重要的植物激素，在植物生長發育過程中發揮重要作用，包括植物器官發生(Benkováet al.,2003；Bohn-Courseau,2010),重力響應和及頂端優勢(Kepinski and Leyser,2005)以及組織分化(Reinhardt,2003)。細胞間單項極性運輸是生長素特有的運輸方式，即生長素只能從植物體形態學的上端向下端運輸，且與重力作用無關(Liu et al.,1993；Lupini et al.,2014)。生長素極性運輸存在於植物的莖，根和葉中，影響生長素不對稱分布和植株形態(Friml,2003)。生長素的極性運輸由定位於質膜上的生長素運輸載體負責(Kepinski and Leyser,2005；Mravec et al.,2009)。

生長素運輸載體，包括生長素輸入載體(AUX1)和生長素輸出載體(PINs)，它們通過調節生長素的運輸和分布影響植物生長發育的各個方面( ek and Friml,2009；Haga and Sakai,2012)。在擬南芥中，有八個PIN基因(PIN1-PIN8)，PIN1首先被鑑定與生長素運輸相關(Kramer et al.,2004)。AtPIN1基因編碼622個胺基酸殘基，包含8-12個對於生長素轉運活性至關重要的跨膜區域。以前的研究已經表明AtPIN1參與側根器官形成( et al.,2014),向光性反應(Blakeslee et al.,2004),形態發生和生長素運輸(Heisler et al.,2010)。AtPIN1的功能可以被生長素運輸抑制劑影響(Geldner et al.,2001)，進一步說明了AtPIN1在生長素極性運輸過程中發揮重要作用。最近，水稻PIN1基因，OsPIN1被鑑定參與生長素依賴的不定根生成和分櫱(Xu et al.,2005)。

蘋果是世界上重要的水果作物，對果樹生長素極性運輸進行研究有助於實現植株形態結構和根系發育調節，最終提高果樹產量。在本研究中，我們通過同源克隆的方式鑑定了MdPIN1基因，結果顯示，在擬南芥中異位表達MdPIN1促進了植株根系發育和生長素運輸。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種從蘋果中鑑定並分離的一新型調控根系生長素運輸以及根系發育的生長素輸出載體基因MdPIN1。實驗發現MdPIN1影響根系生長素運輸，MdPIN1超量表達擬南芥表現出主根長度受到抑制，側根數目增多的表型；提示該基因在植物生長素運輸和根系發育中發揮重要作用。

首先，本發明公開了一種分離的蘋果生長素運輸載體基因MdPIN1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

進一步的，所述生長素運輸載體基因MdPIN1來自嘎啦蘋果。

本發明第二方面公開了前述蘋果生長素運輸載體基因MdPIN1編碼的蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發明利用同源克隆技術獲得了蘋果生長素運輸相關基因MdPIN1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，蛋白質胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

MdPIN1基因序列如下：

ATGATTACATTATCCGACTTCTACCACGTCATGACGGCGGTGGTGCCGCTCTACGTGGCCATGATCTTGGCCTACGGCTCCGTGAAGTGGTGGAAGATCTTCACCCCCGACCAGTGCTCCGGCATCAACCGCTTCGTCGCCCTCTTTGCCGTCCCCCTCCTCTCCTTCCACTTCATCTCCACCAACGACCCTTACAACATGAACACCCGCTTCATTGCCGCCGACACCCTCCAGAAGCTGATCGTCCTCGCCGTCCTCGGCGTCTGGACCAAAGTCAGCAAAAGGGGCTGCCTGGAATGGACGATCACTCTCTTCTCCGTCTCCACTCTGCCCAACACTCTGGTCATGGGAATCCCATTGCTCAAGGGAATGTACGGCGATTTTTCCGGGAGTTTGATGGTGCAGATCGTCGTCCTCCAGTGCATTATCTGGTACACTTTGATGCTTTTCATGTTCGAATACCGAGGAGCAAGACTCCTCATCTCGGAGCAGTTTCCCGACACTGCGGGATCCATTGTCTCCATCCACGTCGACTCCGATATTATGTCGCTCGACGGAAGACAGCCCCTCGAGACTGAAGCGGAGATCAAGGAGGACGGCAAACTCCACGTCACTGTCAGAAAATCAAACGCTTCGCGCTCGGATATTTTATCGCGGCGATCTCAGGGGCTGTCGTCCACCACCCCGCGGCCGTCGAATCTCACTAATGCGGAGATTTACTCCCTGCAGTCTTCGAGAAATCCGACGCCGAGAGGGTCAAGTTTCAACCACACGGACTTCTACTCCATGATGGCTGCCGGAAGGAACTCGAATTTCGGAGCTAACGATGTTTATGGGATGTCTGCGTCCAGAGGGCCGACTCCACGGCCATCAAATTTCGAGGAAGACGGTGGCGGCGGCGCTGTCAGCTCCGCTACTGGAAATAAGCCACGGTTTTACCACGGCGGACAGAATAATGCAGTGGCGCATTACCCGGCCCCAAACCCAGGGATGTTTTCTCCGACGGCGTCCAGAACCGTCACCGCTAATGCTAATAGCAATGCCATGAATGCAAAGAGAGCTAATGGGCAAGCTCAGAAAACAGAGGACACCAATGGCGGGAAGGATCTTCATATGTTTGTTTGGAGCTCAAGTGCTTCTCCTGTTTCAGATGTGTTTGGAAGCAATGAATACGGTGGTGCTGCCCATGATCACAAAGAAGTAAAATTGGCTGTGTCTCCAGGAAAAGTGGAGGGGAGGAGAGAGAATCAGGAAGAGTATTTGGAGAGAGAAGATTTCAGATTTGGAAACAGAGATCAGATGAACATGAACAATGAGGCTGAGAAAGGAGGGGATGGGATTGGAAAAGCCAAAGTGATGCCTCCAACAAGTGTGATGACAAGGCTAATTCTCATCATGGTTTGGAGAAAACTCATTAGAAACCCAAACACTTACTCCAGCTTGATCGGCCTCACTTGGTCTCTAGTCTCATTCAGGTGGCACGTTCAAATGCCAGCCATTGTAGCGAAGTCCATCGCCATACTATCTGATGCAGGACTTGGCATGGCCATGTTCAGCCTCGGTTTGTTTATGGCTTTGCAGCCAAAGATCATAGCTTGTGGAAACTCCGTTGCAGCTTTTGCCATGGCTGTGAGATTCCTTACAGGTCCAGCTGTCATGGCAGCTGCTTCCATTGCTGTTGGCTTAAGAGGCACTCTCTTACATGTTGCCATTGTACAGGCAGCCCTACCCCAAGGAATTGTTCCCTTTGTCTTTGCCAAGGAATACAATGTACACCCTGATATTCTCAGCACGGGGGTTATATTTGGAATGTTGATTGCGTTGCCCATAACGCTTGTTTACTACATTTTGTTGGGGCTATGA(SEQ ID NO:1)

MdPIN1基因編碼的胺基酸序列如下：

MITLSDFYHVMTAVVPLYVAMILAYGSVKWWKIFTPDQCSGINRFVALFAVPLLSFHFISTNDPYNMNTRFIAADTLQKLIVLAVLGVWTKVSKRGCLEWTITLFSVSTLPNTLVMGIPLLKGMYGDFSGSLMVQIVVLQCIIWYTLMLFMFEYRGARLLISEQFPDTAGSIVSIHVDSDIMSLDGRQPLETEAEIKEDGKLHVTVRKSNASRSDILSRRSQGLSSTTPRPSNLTNAEIYSLQSSRNPTPRGSSFNHTDFYSMMAAGRNSNFGANDVYGMSASRGPTPRPSNFEEDGGGGAVSSATGNKPRFYHGGQNNAVAHYPAPNPGMFSPTASRTVTANANSNAMNAKRANGQAQKTEDTNGGKDLHMFVWSSSASPVSDVFGSNEYGGAAHDHKEVKLAVSPGKVEGRRENQEEYLEREDFRFGNRDQMNMNNEAEKGGDGIGKAKVMPPTSVMTRLILIMVWRKLIRNPNTYSSLIGLTWSLVSFRWHVQMPAIVAKSIAILSDAGLGMAMFSLGLFMALQPKIIACGNSVAAFAMAVRFLTGPAVMAAASIAVGLRGTLLHVAIVQAALPQGIVPFVFAKEYNVHPDILSTGVIFGMLIALPITLVYYILLGL(SEQ ID NO:2)

從嘎啦蘋果組培苗中提取總RNA，反轉錄得到cDNA。根據國際基因庫中已發布的擬南芥中PIN1的保守胺基酸序列，設計兼併引物，進行常規聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)。將合適大小的PCR產物與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選重組子，並進行測序分析確認，最後得到cDNA全長序列。

該基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)為1863bp。由此推得，該基因編碼620個胺基酸，基因序列號為MDP0000138035，位於第6號染色體，包括6個外顯子和5個內含子。將其胺基酸序列在國際基因庫中檢索，發現與已公布的擬南芥相關基因AtPIN1有較高的同源性，所以我們將該基因命名為MdPIN1。

本發明第三方面公開了前述蘋果生長素運輸載體基因MdPIN1在調節植株生長素運輸和/或根系發育中的用途。

進一步的，所述蘋果MdPIN1基因在根系發育中的用途，為提高主根長度並抑制側根數目。

由實驗結果可知，蘋果MdPIN1基因影響根系生長素運輸，但對根系生長素合成沒有顯著影響。

本發明第四方面公開了一種核酸構建體，包含處於強啟動子控制下的前述蘋果生長素運輸載體基因MdPIN1。

進一步的，所述強啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子。

利用強啟動子(花椰菜花葉病毒35S啟動子)驅動原理的轉基因技術，將MdPIN1基因的超量表達載體轉入擬南芥中，從而獲得轉基因植株。MdPIN1影響根系生長素運輸，MdPIN1超量表達擬南芥表現出主根長度受到抑制，側根數目增多的表型，說明MdPIN1基因在植株生長素運輸和根系發育中發揮重要作用。

綜上所述，本發明的有益效果在於，發明人首次在蘋果中分離出一個新型的調節植株生長素運輸和根系發育的生長素運輸載體基因。

附圖說明

圖1載體的構建及轉基因擬南芥的獲得

(A:蘋果MdPIN1基因PCR擴增產物電泳MdPIN1:MdPIN1基因擴增產物，Mark:分子量標記DM2000；B：35S:MdPIN1結構示意圖；C：RT-PCR分析MdPIN1基因在轉基因擬南芥L1，L2,L3株系中的表達水平)；

圖2 MdPIN1對植株生長素運輸的影響

(A-B：根系向地性實驗，C-D：植株向光性實驗)；

圖3 MdPIN1對植株生長素合成沒有顯著影響

(A：DR5-GUS染色觀察生長素積累情況B：定量PCR檢測野生性擬南芥與轉基因擬南芥及生長素合成基因YUC1，YUC2，YUC4，YUC6，TAA1表達量)；

圖4 MdPIN1調節根系發育

(A：生長10天的野生型擬南芥(Col-0)和轉基因擬南芥(L1，L2，L3)根系系統觀察；B-C：轉基因擬南芥與野生型擬南芥相比，主根長度明顯受到抑制，側根數目顯著增多，Bars＝1cm)。

具體實施方式

本發明通過分子克隆技術研究了蘋果生長素運輸相關基因MdPIN1在調節根系發育，影響生長素運輸中的應用。利用35S強啟動子驅動原理的轉基因技術，將MdPIN1基因在擬南芥中異位表達，獲得轉基因擬南芥；MdPIN1在擬南芥中超量表達影響植株根系生長素運輸，但是對生長素合成沒有顯著影響。進一步表型觀察發現，MdPIN1在擬南芥中超量表達可以顯著抑制主根伸長，並促進側根數目增多。

以下結合附圖對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。

實施例1 嘎啦蘋果MdPIN1基因的克隆

1.嘎啦蘋果組培葉片RNA提取

通過CTAB法提取嘎啦蘋果組培葉片的總RNA，包括以下步驟：

1)取1.5g經200mM NaCl鹽處理24小時的嘎啦蘋果組培苗，放入預冷的研缽，加液氮磨碎，轉入預冷的50ml離心管中；

2)迅速加入10ml預熱到65℃的提取緩衝液(CTAB 20％w/v，Tris-HCl 0.1mol/l，EDTA 25mol/l，NaCl 2mol/l，巰基乙醇2％w/v，PVP 2％w/v，無RNA酶的雙蒸水定容，其中PVP和巰基乙醇現用現加)，輕輕混勻，65℃水浴中0.5小時；

3)加入與上步離心管液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振蕩0.5小時，4℃、12,000rpm離心20分鐘；將上清液轉移到新的50ml離心管中；

4)加入1/3上清液體積的10mol/L預冷LiCl，-20℃放置3小時，12,000rpm離心30分鐘，棄上清液；

5)加入500μl SSTE緩衝液(NaCl 1mol/l，SDS 0.5％w/v，EDTA 10mol/l，無RNA酶的雙蒸水定容)充分懸浮沉澱後，平均分裝到2支1.5ml離心管中；

6)分別加入與懸浮液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12,000rpm離心10分鐘；將上清液轉移到新的1.5ml離心管；

7)分別加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇(24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12,000rpm離心10分鐘；將上清液轉移到新的1.5ml離心管；

8)加入2.5倍上清液體積的預冷無水乙醇，-20℃放置1-2小時；

9)於4℃、12,000rpm離心20分鐘，70％乙醇洗2次；

10)於4℃、14,000rpm離心10分鐘，超淨臺上風乾沉澱；加入20μl DEPC水溶解RNA。

11)置-80℃儲藏備用，或立即進行以下反轉錄實驗。

2.將總RNA反轉錄得到cDNA

總RNA的反轉錄使用市售的反轉錄試劑盒，獲得反轉錄cDNA。

3.MdPIN1全長DNA序列的擴增

設計兼併引物(MdPIN1-F/MdPIN1-R)，以上述反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增。

MdPIN1-F：5』-CCACTCAATCTCTCTGCCAAT-3』(SEQ ID NO:3)；

MdPIN1-R：5』-GACTGGTGAGAGGGAGAGTT-3』(SEQ ID NO:4)。

PCR擴增體系：純化的cDNA產物25μl，5×TdT緩衝液10μl，0.1％BSA5μl，10mM dCTP 2.5μl，TdT 15U，雙蒸水定容至50μl。

PCR擴增程序：94℃預變性5分鐘；循環參數為94℃變性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒，進行32個循環；72℃充分延伸10分鐘。

PCR反應結束後，回收PCR產物並將其連接到pMD-18T載體上，獲得pMD18-T-MdPIN1質粒。測序(北京六合華大基因科技股份有限公司)結果顯示，MdPIN1基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其胺基酸序列如SEQID NO:2所示。測序正確的單克隆，鹼法提取pMD18-T-MdPIN1的質粒DNA，-20℃保存，用於後續功能驗證實驗(附圖1A)

4.蘋果MdPIN1生物信息學分析

通過GDR資料庫(http://www.rosaceae.org/)分析MdPIN1基因的染色體位置和基因組結構。結果顯示，MdPIN1定位於蘋果基因組的第6號染色體上，由6個外顯子和5個內含子構成。

MdPIN1基因編碼區含有1863bp的核苷酸，利用DNASTAR相關軟體進行序列分析，蘋果MdPIN1基因編碼620個胺基酸。通過NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的資料庫和expasy網站(http://www.expasy.org/)的分析軟體，對MdPIN1蛋白預測序列的功能結構域和保守域進行比較分析，結果發現：MdPIN1預測蛋白在9-615aa含有6個連續的跨膜結構域，這對於MdPIN1蛋白的膜定位至關重要。

實施例2 MdPIN1基因載體的構建

為進一步研究MdPIN1基因的功能，將包含有MdPIN1基因編碼區在內的共1863bp片段正確插入表達載體pCAMBIA 1300上(附圖1B)。

1.利用DNAMAN軟體，根據分離出的MdPIN1基因的核苷酸序列(SEQ.ID.NO:1)，設計帶酶切位點的引物EMdPIN1-F和EMdPIN1-R(SEQ ID NO:18-19)，以實例1保存的pMD18-T-MdPIN1的質粒DNA為模板，進行PCR反應，擴增帶有EcoRI和PstI酶切位點的MdPIN1序列。

EMdPIN1-F：5』-CTGCAGCCACTCAATCTCTCTGCCAAT-3』(SEQ ID NO:5)，劃橫線部分為PstⅠ酶切位點；

EMdPIN1-R：5』-GGATCCGACTGGTGAGAGGGAGAGTT-3』(SEQ ID NO:6)，劃橫線部分為BamHⅠ酶切位點。

擴增體系及擴增程序同實施例1，僅將引物和模板進行替換。

2.PCR反應結束後，1.0％瓊脂糖凝膠電泳、PCR產物回收、載體連接、轉化、測序。鹼法提取其質粒DNA，用PstⅠ和BamHⅠ雙酶切，鑑定正確後用於後面的實驗。

3.用PstⅠ和BamHⅠ兩個內切酶，同時雙酶切前一步驟所得質粒DNA與pCAMBIA 1300質粒，回收MdPIN1的片段和pCAMBIA 1300載體片段，用T4連接酶將二者連接起來。篩選陽性克隆進行測序，從中選擇正確的重組子pCAMBIA 1300-MdPIN1。

4.用構建好的重組子pCAMBIA 1300-MdPIN1轉化農桿菌LB4404感受態細胞。進行PCR鑑定，挑取陽性菌落進行測序。測序正確的重組子pCAMBIA 1300-MdPIN1單克隆用於後面擬南芥的轉化。

實施例3 獲得轉基因擬南芥

將獲得的擬南芥種子，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min(期間多次搖晃)，滅菌水衝洗5次，吸乾水。播種於種子萌發培養基上(直接鋪於表面)，光培養(25-28℃，16h長日照/8h短日照，10d)，至小苗長出。移栽到基質培養到開花。

挑取農桿菌單克隆菌落接種於10mL YEP液體培養基(含50mg/L潮黴素)中，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為0.6-0.8(約48h)；取其中lmL菌液加入20mL YEP液體培養基內，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為0.6-0.8(約5h)。離心收集菌體，用侵染液(含0.05g/ml蔗糖、0.03-0.05％Silweet)懸浮稀釋20倍，備用；

將擬南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果莢，50mg·L-1潮黴素抗性篩選後，PCR檢測得到陽性轉基因植株，經過連續3代篩選得到T3代純合體，收取種子，進行表型分析。

利用篩選培養基(含100mg/L潮黴素)篩選抗潮黴素陽性的候選轉基因株系，共獲得3個35S:MdPIN1陽性株系(L1、L2、L3)；為進一步鑑定轉基因株系，在進行繼代培養時，每株系各取0.1g左右的組培苗，提取相應的RNA，反轉錄並進行半定量PCR檢測，以確定這些株系中MdPIN1的表達水平。結果顯示，MdPIN1基因在L1、L2及L3中過量表達(附圖1C)。

實施例4 轉基因擬南芥的根系表型

作為生長素輸出載體，PIN1基因調控生長素運輸。為了研究MdPIN1對生長素運輸的影響，我們實施根系向地性實驗和向光性實驗。

1.根系向地性實驗

取野生型(Col-0)和轉基因擬南芥豎直培養生長6天的幼苗暗處傾斜135°培養，分別在生長8h,18h,28h時拍照觀察，並計算主根彎曲度數。結果發現，與野生型擬南芥相比，35S::MdPIN1轉基因擬南芥彎曲度數更大(附圖2A-B)，暗示轉基因擬南芥中生長素運輸可能受到影響。

2.向光性實驗

取野生型(Col-0)和轉基因擬南芥暗處生長5天的幼苗在單側光照下培養，觀察統計植株下胚軸彎曲角度。結果顯示，野生型擬南芥相比，35S::MdPIN1轉基因擬南芥下胚軸彎曲度數更大(附圖2C-D)。以上結果說明，轉基因擬南芥中生長素運輸可能受到影響。

實施例5 MdPIN1對生長素合成沒有顯著影響

DR5作為生長素的Mark基因，可以用來種子雜交。選擇生長狀態良好的DR5-GUS轉基因擬南芥(山東農業大學生命科學學院張憲省教授提供)以及MdPIN1轉基因擬南芥進行雜交。雜交成功後，收集果莢，PCR檢測得到陽性轉基因植株，經過連續3代篩選得到T3代純合體，收取種子，進行表型分析。

GUS染色液染色觀察根系中生長素積累情況。結果顯示，在DR5-GUS/MdPIN1雜交植株中，主根根尖與側根原基部位GUS染色沒有顯著差異，說明超量表達MdMIEL1基因可能不影響生長素積累(附圖3A)。

定量PCR檢測野生型與轉基因擬南芥中生長素合成基因(AtYUC1，AtYUC2，AtYUC4，AtYUC6，AtTAA1)表達量(檢測方法參考Mashiguchi K,Tanaka K,Sakai T,et al.The main auxin biosynthesis pathway in Arabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108(45):18512-18517.)。結果顯示，擬南芥與轉基因擬南芥中生長素合成基因沒有顯著差異，暗示MdPIN1基因可能不影響生長素的合成(附圖3B)。

實例6 MdPIN1調控根系發育

為進一步確定轉基因植株的功能，將擬南芥播種在豎直的MS培養基上，觀察擬南芥根系發育表型。

(1)種子處理。將獲得的擬南芥種子(Col-0，L1，L2，L3)，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min(期間多次搖晃)，滅菌水衝洗5次，吸乾水。播種於種子萌發培養基上。4℃層積處理4天後至光下培養(21-24℃，16h長日照/8h短日照)。

(2)選擇萌發後4天左右、根系發育一致的野生型擬南芥(Col-0)和轉基因擬南芥(L1，L2，L3)，轉移到MS培養基上豎直培養(21-24℃，16h長日照/8h短日照)。繼續培養6天後，觀察擬南芥根系表型並拍照。

結果發現，與野生型擬南芥相比，超量表達MdPIN1的轉基因擬南芥主根長度明顯受到抑制，側根數目顯著增多。(附圖4A-C)

綜上所述，MdPIN1基因不僅影響生長素運輸，對根系發育也有顯著影響。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。