水稻抽穗期相關基因、功能標記及應用的製作方法

2023-04-30 19:48:13 1

本發明涉及水稻分子生物技術與育種應用領域，具體地說是一種與水稻抽穗期相關的基因、功能標記及其應用。

背景技術：

抽穗期(hd)是水稻的重要農藝性狀之一，決定水稻品種的季節適應性和地域適應性，合適的抽穗期是水稻高產穩產的前提和基礎。因此選育合適抽穗期的水稻品種以提高水稻廣適性是水稻育種的重點。目前多項研究表明，抽穗期與水稻產量性狀相關聯。長日照條件下，ghd7的增強表達能推遲抽穗、增加株高和每穗粒數，而功能減弱的自然突變體能夠種植到溫帶甚至更冷的地區。因此，ghd7在增加全球水稻產量潛力和適應性方面有非常重要的作用(xuew,xingy,wengx,zhaoy,tangw,wangl,zhouh,yus,xuc,lix,zhangq(2008)naturalvariationinghd7isanimportantregulatorofheadingdateandyieldpotentialinrice.natgenet40:761–767)。長日條件下，導入asominori中有功能的dth8等位基因能顯著增加cssl61的抽穗期、株高和每穗粒數(weix,xuj,guoh,jiangl,chens,yuc,zhouz,hup,zhaih,wanj(2010)dth8suppressesfloweringinrice,influencingplantheightandyieldpotentialsimultaneously.plantphysiol153:1747–1758)。由此可以看出，抽穗期在水稻研究中是一個重要的部分。

功能標記是根據功能基因內部引起表型性狀變異的多態性基序開發出來的一種新型分子標記，是來源於控制表型的基因序列內部。由於功能標記來自基因內的功能性基序，不需要進一步驗證就可以在不同的遺傳背景下確定目標等位基因的有無，因此在作物遺傳育種的研究應用中較傳統分子標記更具高效、便捷等優勢。功能標記在水稻中的應用已經有很多報導，在水稻抗稻瘟病研究中，因為其抗性基因xa-5是隱性遺傳的，因此在鑑定抗稻瘟病水稻品種時比較繁瑣，後anjiali(anjalis,susanr(2007)functionalmarkersforχα5-mediatedresistanceinrice(oryzasativa,l.).molecularbreeding,19(4):291-296.)等通過將xa-5等位基因中功能性核苷酸多態性位點轉化為caps標記後，可以快速、直接篩選帶有xa-5功能性位點的材料和變種，並且可靠性達到100％。楊傑等(楊傑，曹卿，王軍，範方軍，張玉瓊，仲維功(2011)水稻多酚氧化酶基因功能標記的開發與應用.中國水稻科學，25(1)：37-42.)根據ppo等位基因的dna序列差異開發的fmppo-18和fmppo-29標記，可應用於水稻種質資源鑑定、進化等研究。稻米香味受隱性基因fgr控制，因此雜合基因型水稻不表現香味。王軍(王軍，楊傑，陳志德，仲維功(2008)水稻香米基因標記的開發與應用.分子植物育種，6(6):1209-1212)等設計了基於fgr基因兩個等位基因的功能標記(indel-e2、indel-e7)，且應用此對標記不僅可以驗證純合型品系，而且對雜合型水稻品系的驗證同樣有效。

因此，克隆與水稻抽穗期相關基因，開發相關的功能標記，快速鑑定篩選具有早抽穗期的陽性水稻植株，對於獲得水稻新品種具有極其重要的意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供與水稻抽穗期相關的基因、與所述基因相關的功能標記開發及應用。本發明所提供的水稻抽穗期相關基因及其分子標記，可應用於檢測和篩選不同抽穗期的水稻品種，可以大大加快水稻適應更廣的選育進程。

本發明提供了水稻抽穗期相關基因qhd5，所述基因是如下a)或b)或c)的基因：a)其cdna的核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示，命名為qhd5-nil(bg1)；b)其cdna的核苷酸序列如序列表中seqidno.2所示，命名為qhd5-nil(xlj)；c)與a)或b)的基因具有90％以上的同源性，且編碼相同功能的蛋白質。上述基因qhd5-nil(bg1)和qhd5-nil(xlj)為水稻抽穗期相關基因qhd5的兩個等位基因。

本發明還提供了上述水稻抽穗期相關基因qhd5的擴增引物，為如下引物a)或b)：a)具有seqidno.3所示的核苷酸序列的正向引物qhd5-cdna-f，以及具有seqidno.4所示的核苷酸序列的反向引物qhd5-cdna-r；b)具有seqidno.5所示的核苷酸序列的正向引物qhd5-com-f，以及具有seqidno.6所示的核苷酸序列的反向引物qhd5-com-r。

本發明保護含有上述基因qhd5的生物材料，所述生物材料可以為載體、宿主細胞或表達盒。

本發明還保護上述的基因qhd5或其編碼的蛋白在選育不同抽穗期水稻品種中的應用。

本發明還提供一種改變水稻抽穗期性狀的方法，是將上述的基因a)即qhd5-nil(bg1)導入目的水稻組織或細胞中，得到抽穗期提前的轉基因水稻。

基於上述水稻抽穗期相關基因qhd5，本發明還開發了檢測該基因的功能標記，所述功能標記為qhd5-1032-dcaps1，該功能標記的引物包括：正向引物qhd5-1032-dcaps1-f，其核苷酸序列如seqidno.7所示；反向引物qhd5-1032-dcaps1-r，其核苷酸序列如seqidno.8所示。

所述的功能標記可應用於選育不同抽穗期水稻品種的工作中。

利用上述的功能標記，本發明還提供了一種鑑別水稻抽穗期性狀的方法，包括以下步驟：s1：利用所述的功能標記的引物對待測水稻植株dna/cdna進行pcr擴增，獲得擴增產物；s2：將上述擴增產物用espⅰ內切酶進行酶切，酶切產物經電泳分離，並根據電泳結果進行判斷：若獲得141bp條帶和120bp條帶，則認為該水稻植株含有基因qhd5-nil-bg1和qhd5-nil-xlj；若獲得141bp的條帶，則認為該水稻植株只含有基因qhd5-nil-bg1；若獲得120bp的條帶，則認為該水稻植株只含有基因qhd5-nil-xlj，其中前兩種水稻植株為早抽穗型，後一種水稻植株為晚抽穗型。

具體地，上述方法中，所述步驟s1中pcr擴增體系為12μl，包含h2o3μl，2×pcrmix5.0μl，正反向引物各1μl，cdna模板2.0μl；pcr擴增條件為94℃預變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環；72℃延伸10min。

具體地，上述方法中，所述步驟s2中espⅰ內切酶體系為15μl，包含espⅰ內切酶0.6μl，10×buffer1.2μl，pcr產物12μl，h2o1.2μl；反應條件為37℃，5min。

本發明研究獲得了與水稻抽穗期相關基因qhd5的一對等位基因qhd5-nil(bg1)和qhd5-nil(xlj)，這兩個等位基因對應了水稻抽穗期表型性狀上的差異，因此，可以作為分子標記用於鑑定水稻的抽穗期性狀，從而在水稻品種選育中發揮作用。本發明基於這兩個等位基因還開發了功能標記，所述功能標記可在實際應用中實現對水稻抽穗期性狀的快速鑑別、篩選，例如，對早抽穗品種或品系的篩選，不僅篩選快速精準，目標明確，而且節約生物進程，大大提高了水稻植株的選擇效率和質量。

附圖說明

上述僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，以下結合附圖與具體實施方式對本發明作進一步的詳細說明。

圖1是本發明qhd5-nil(bg1)基因和qhd5-nil(xlj)基因的cdna核苷酸序列比對圖。

圖2是利用本發明的功能標記鑑定不同轉基因水稻植株的結果示意圖。

圖3是互補轉基因植株表型對比圖。

具體實施方式

首先需要說明的是，發明人前期利用轉錄組測序技術對兩個近等基因系(nils)水稻進行了研究(nils的獲得參考文獻sun,b.,zhan,x.d.,lin,z.c.,wu,w.x.,yu,p.,zhang,y.x.,sun,l.p.,cao,l.y.,cheng,s.h.(2017).finemappingandcandidategeneanalysisofqhd5,anovelmajorqtlwithpleiotropismforyield-relatedtraitsinrice(oryzasatival.).theoreticalandappliedgenetics,130(1),247-258.)，並通過實時定量rt-pcr進行驗證，將與抽穗期相關的數量性狀位點基因qhd5精細定位到水稻5號染色體短臂上大小為52.59kb的區域。研究發現，主要影響數量性狀位點(qtl)的qhd5基因，被認為是導致nil(bg1)和nil(xlj)水稻在長日照和短日照條件下產生至少10天的抽穗期差異的單個孟德爾因子。該研究結果目前已發表(sun,b.,zhan,x.d.,lin,z.c.,wu,w.x.,yu,p.,zhang,y.x.,sun,l.p.,cao,l.y.,cheng,s.h.(2017).finemappingandcandidategeneanalysisofqhd5,anovelmajorqtlwithpleiotropismforyield-relatedtraitsinrice(oryzasatival.).theoreticalandappliedgenetics,130(1),247-258.)。本發明在此引用前述研究，並對前述研究所涉及的具體內容不再贅述。

本發明是基於發明人前期的科學實驗結果所做的進一步深入研究。針對上述水稻抽穗期相關的基因qhd5，研究發現該基因包括兩個等位基因，這裡被命名為qhd5-nil(bg1)和qhd5-nil(xlj)。通過序列比對分析發現，此兩個等位基因存在snps的差異，其中自5』端第1032位點在兩等位基因間產生一個espⅰ酶切位點。基於此位點，本發明還開發了一個功能標記qhd5-1032-dcaps1，通過該功能標記對qhd5互補轉基因植株dna/cdna進行pcr擴增，可以快速檢測和篩選出含有qhd5-nil(bg1)的陽性植株。

以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。

實施例1：水稻抽穗期基因qhd5的克隆及互補轉基因植株的獲得

1)a.nil-bg1和nil-xlj總rna提取

利用tiangen(天根公司)ranpreppure植物總rna提取試劑盒提取nil-bg1和nil-xlj總rna，具體步驟如下：

1.均漿處理：50mg左右nil-bg1和nil-xlj葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μlrl(使用前已加入β-巰基乙醇)，渦旋劇烈震蕩混勻。

2.將所有溶液轉移至過濾柱cs上(過濾柱cs放在收集管中)，12000rpm離心2min，小心吸取收集管中的上清至rnase-free的離心管中，吸頭儘量避免接觸收集管中的細胞碎片沉澱。

3.緩慢加入0.5倍上清體積的無水乙醇(通常為225μl)，混勻後將得到的溶液和沉澱一起轉入吸附柱cr3中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。

4.向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。

5.dnaseⅰ工作液的配製：取10μldnaseⅰ儲存液放入新的dnase-free離心管中，加入70μlrdd溶液，輕柔混勻。

6.向吸附柱cr3中央中加入80μl的dnaseⅰ工作液，室溫放置15min。

7.向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。

8.向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(事先已加入乙醇)，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。

9.重複步驟8。

10.12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱cr3置於室溫放置數分鐘，以徹底曬乾吸附材料中殘餘的漂洗液。

11.將吸附柱cr3放入一個新的rnase-free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加40μlrnase-freeddh2o，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到rna溶液。

b.合成nil-bg1cdna和nil-xljcdna

利用toyobofirststrandcdnasynthesiskit(東洋紡公司cdna第一鏈合成試劑盒)參考50μl體系合成nil-bg1cdna和nil-xljcdna，具體步驟如下：

1.rna變性

在200μlrnase-free管中加入rnase-freeh2o22.5μl，oligoprimer2.5μl，rna5μl，輕柔混勻後，65℃，5min後立即置於冰上。

2.反應液配置

在上步驟的溶液中繼續加入以下液體，5×rtbuffer10μl，dntpmixture(10mm)5μl，rnaseinhibitor(10u/μl)2.5μl，revertraace2.5μl。pcr程序為：42℃40min，99℃5min，4℃10min後置於-20℃保存。

c.nil-bg1和nil-xlj中qhd5-cdna擴增

利用正向引物qhd5-cdna-f(序列表中seqidno.3)和反向引物qhd5-cdna-r(序列表中seqidno.4)對nil-bg1和nil-xlj的cdna進行擴增，擴增體系為kod-neo50μl體系：2μlcdna，5μlkod-neo-pcrbuffer，5μl2mmdntps，1μl10mmqhd5-cdna-f和qhd5-cdna-r，3μl2.5mmmgso4，0.5ukod-neo酶，32μlddh2o。反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，68℃延伸1min,35個循環；68℃延伸5min，10℃保存。擴增的產物與peasy(transgenbiotech，全式金公司)平末端載體連接，挑選陽性單克隆送杭州擎科公司測序。測序後分析序列差異，序列分析如圖1所示。

2)nil-bg1在田間表現出早抽穗的表型，nil-xlj在田間表現出晚抽穗期的表型，而在生產實踐中，育種家們大多喜歡具有早抽穗表型的品種，因此我們將包含qhd5-nil(bg1)全長及其上下遊部分序列的一段序列擴增出來。所用擴增引物qhd5-com，其正向序列qhd5-com-f如序列表中seqidno.5所示，反向序列qhd5-com-r如序列表中seqidno.6所示。選擇的酶切位點是bamhⅰ和hindⅲ，在引物qhd5-com中就引入這兩個酶切位點，同時用bamhⅰ和hindⅲ快切酶酶切實驗室保存的pcambia1300載體，後利用vazyme公司onestepcloningkit將擴增片段與酶切後的載體pcambia1300連接。後利用農桿菌轉化的方法轉入到nil-xlj種子中獲得qhd5互補轉基因植株。t0代植株經過轉基因鑑定，結果顯示和空載體相比，轉基因植株的抽穗期明顯提前。於是我們經過轉基因拷貝數檢測隨機挑選單拷貝的t0代植株，收種後種植成t1代家系。t1代家系中出現抽穗期分離的現象。附圖2、3分別給出了對轉基因植株的檢測結果。其中，附圖2中t1-1代表t1代家系中第一個家系的第一株，t1代第一個家系中一共挑選了10株進行檢測。t2-1代表t1代家系中第二個家系的第一株，第二個家系中挑選了11個單株進行檢測。附圖3中t1-1(+)代表t1代植株第一個家系中的轉基因陽性植株；t1-1(-)代表t1代植株第一個家系中的轉基因陰性植株；t1-2(+)代表t1代植株第二個家系中的轉基因陽性植株；t1-2(-)代表t1代植株第二個家系中的轉基因陰性植株。

實施例2：功能標記開發

1)用序列擴增引物qhd5-cdna-f和qhd5-cdna-r(正向引物序列為seqidno.3，反向引物序列為seqidno.4)對nil(bg1)和nil(xlj)的cdna進行pcr擴增，連接peasy載體測序後發現qhd5序列在nil(bg1)和nil(xlj)中存在snps序列差異(如圖1所示)。

2)在qhd5基因組序列中存在6個snps位點：自5』端第122位核苷酸為t和c的差異，自5』端第124位核苷酸為g和a的差異，自5』端第1032位核苷酸為a和c的差異，自5』端第1173位核苷酸為c和t的差異，自5』端第1386位核苷酸為c和g的差異，自5』端第1524位核苷酸為-(單鹼基缺失)和t的差異。

3)其中自5』端第1032位點在qhd5-nil(bg1)和qhd5-nil(xlj)等位基因間的差異產生一個espⅰ酶切位點多態性，其中qhd5-nil(xlj)等位基因在此snp位點的核苷酸位c，能被espⅰ內切酶識別並切開，qhd5-nil(bg1)在此snp位點的核苷酸位a，不能被espⅰ內切酶識別。根據此處的snp位點利用dcapsfinder2.0開發特異的snp標記，命名為qhd5-1032-dcaps1。該標記qhd5-1032-dcaps1的引物為：正向引物序列為seqidno.7，反向引物序列為seqidno.8。

4)利用qhd5-1032-dcaps1對nil-bg1和nil-xlj的cdna進行擴增，擴增產物用espⅰ內切酶酶切，後利用8％的聚丙烯醯胺凝膠檢測結果，如圖2所示。圖中顯示nil-bg1不能被espⅰ酶切開，而nil-xlj能被espⅰ酶切開。

實施例3：用qhd5-1032-dcaps1標記檢測互補轉基因後代植株

1)提取待測互補轉基因後代植株的dna/cdna，用qhd5-1032-dcaps1標記引物(正向引物序列為：seqidno.7，反向引物序列為seqidno.8)對互補轉基因後代植株進行pcr擴增，其pcr擴增體系為12μl，包含ddh2o3μl，2×pcrmix5.0μl，正反向引物各1μl，cdna2.0μl；擴增條件為94℃預變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環；72℃延伸10min；10℃保存。

2)將上述擴增產物分別用espⅰ內切酶進行酶切，酶切產物在8％聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離，如pcr擴增產物被切開大小為141bp和120bp的兩條帶，則該植株為含有qhd5-nil-bg1和qhd5-nil-xlj兩個等位基因的轉基因陽性植株；如pcr擴增產物只有一條被切開的大小為120bp的帶，則該植株為只含有qhd5-nil-xlj的轉基因陰性植株；其中espⅰ內切酶體系為15μl，包含espⅰ內切酶0.6μl，10×buffer1.2μl，pcr產物12μl；反應條件為37℃，ddh2o1.2μl，5min。

3)檢測結果如附圖2和3所示，t1-5、t1-6、t2-11植株因為只含有和nil-xlj一樣的條帶，所以是轉基因陰性植株，即它們的抽穗期都是相對較晚的。而其他單株均顯示含有兩條帶，說明該植株中已經含有nil-bg1片段，為轉基因陽性植株，同時其抽穗期也表現出相對較早的性狀。圖3中就是轉基因陽性植株和轉基因陰性植株同時期抽穗期表型對比。

實施例4：用qhd5-1032-dcaps1標記鑑別不同水稻品種的水稻抽穗期性狀

為更好的應用qhd5-1032-dcaps1標記，我們選擇了12份有代表性的地方品種按照實施例3中的步驟對這些品種進行檢測，結果如下表1所示，其中，鎮稻88、t65、tainaniku487、魚眼糯、冷水糯共5份品種不能被espⅰ酶切開，說明這5個品種cdna序列1032位點與qhd5-nil(bg1)等位基因一致；而td25、順德塘禾、padiboenor、dv85、ir24、gie57、鄂早18這7份品種cdna序列1032位點與qhd5-nil(xlj)等位基因一致。該檢測結果與這些品種的實際測序結果相吻合，驗證了該功能標記可以有效應用於水稻品種抽穗期基因型鑑定。

表1qhd5-1032-dcaps1標記檢測水稻品種結果

以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明作任何形式上的限制，本領域技術人員利用上述揭示的技術內容做出些許簡單修改、等同變化或修飾，均落在本發明的保護範圍內。

sequencelisting

中國水稻研究所

水稻抽穗期相關基因、功能標記及應用

2017

patentinversion3.3

1538

dna

oryzasativa

atggagttggatctgaacaacgtggcggaaggggtggtggagaagcatgagacggcggcg60

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