一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統及製備方法與流程

2023-05-01 05:23:51 1

本發明屬於藥物製劑領域和基因疫苗載體給藥領域，具體涉及一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統及製備方法。

背景技術：

疫苗是預防和治療癌症、C型肝炎、愛滋病、流感等疾病的有效方法。而DNA疫苗相比於傳統疫苗，具有穩定、易於修飾與製備、安全性、能形成長期體液免疫和細胞免疫等方面的優勢，而成為疫苗發展的新方向。然而，DNA疫苗的遞送過程存在酶解、低吸收、轉染效率低、抗原遞呈不足等方面的風險。因此，選擇合適的DNA疫苗遞送載體對於發展至關重要。

首先，將DNA疫苗靶向遞送至抗原遞呈細胞，如巨噬細胞和樹突細胞能顯著提高攝取與遞呈效率。CN 104771764A公布了一種巨噬細胞靶向載體系統，通過甘露糖修飾載體靶向抗原遞呈細胞表面過量表達的甘露糖受體。然後，DNA疫苗進入內涵體-溶酶體系統，突破溶酶體進入細胞質是DNA疫苗所編碼抗原表達的必要步驟。電荷反轉材料能響應環境pH的變化，通過化學鍵的斷裂改變自身電性，pH響應型釋放DNA。最後，帶正電荷的DNA載體材料通過質子海綿效應突破溶酶體到達細胞質，使DNA進入細胞核進行表達。具有仿病毒結構的兩親性樹狀脂肽其兼具非病毒載體的安全性和病毒載體的高轉染效率。高轉染效率有助於表達足量抗原，觸發後續的主要組織相容性複合物I介導的細胞免疫和主要組織相容性複合物II介導的體液免疫。

雖然靶向性材料、電荷反轉材料、DNA載體材料能分別發揮其作用，但是要將它們有機地結合起來並根據遞送過程中的環境變化發揮程序化轉染的作用仍然需要藉助層層自組裝的技術。層層自組裝是利用靜電作用將帶正電荷和帶負電荷的聚合物依次沉積於內核表面。通過調整聚合物的濃度與用量避免聚沉而形成穩定的納米粒。層層自組裝技術是一種成熟的技術，已被廣泛地應用於藥物、蛋白、基因遞送系統的構建中。

技術實現要素：

針對以上問題，本發明的目的是通過層層自組裝構建一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統，降低細胞毒性，提高轉染效率，進而增強後續的免疫反應。

為實現上述目的，本發明採用的方案如下：

一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統，包括DNA載體材料DSPE-G2、電荷反轉材料PAH-Cit和靶向性材料MCS，其特徵在於，由兩親性的樹狀脂肽DSPE-G2壓縮DNA形成的正電性納米粒作為層層自組裝的內核，在其表面覆蓋陰離子聚電解質PAH-Cit作為電荷反轉層，再在其表面覆蓋陽離子聚電解質MCS作為外層靶向樹突細胞。從而形成粒徑為256.8±10.7nm、分散係數為0.104、表面電位為25.1±2.3mV的四元複合物納米粒。

所述的DSPE-G2的結構為：

所述的電荷反轉層PAH-Cit在酸性條件下酯鍵斷裂，脫去檸康醯支鏈，形成陽離子聚電解質聚丙烯胺。

所述的外層MCS具有靶向樹突細胞表面甘露糖受體功能，進而促進受體介導的內吞作用。

為實現上述目的，本發明採用的製備方法如下：

a、DNA載體的製備：將2mg DSPE-G2溶於100μL氯仿/甲醇(v/v＝4∶1)中，注入1mL快速攪拌中的HEPES緩衝液(10mM，pH 7.4)中，持續攪拌6h除去有機溶劑。

b、二元複合物的製備：將pDNA溶於HEPES緩衝液(10mM，pH 7.4)中，調整濃度為0.2mg/mL。將pDNA溶液與濃度為0.1-2mg/mL的DSPE-G2溶液等體積混合，渦旋1min，室溫孵化20min。

c、三元複合物的製備：將PAH-Cit溶於HEPES緩衝液(10mM，pH 7.4)中，調整濃度為1mg/mL、2mg/mL。取50-200μL PAH-Cit溶液與100μL二元複合物溶液混合，室溫孵化30min。

d、四元複合物的製備：將MCS溶於1％(v/v)醋酸溶液，靜置過夜，用1M NaOH調節pH＝5.5，過0.8μm濾膜，調整濃度為0.5mg/mL。取150-300μL三元複合物溶液逐滴加入300μL攪拌中的MCS溶液，持續攪拌30min。

在上述製備過程中，不同濃度DSPE-G2與pDNA複合的N/P比為1-20，優選的N/P比為20。

在上述製備過程中，PAH-Cit與二元複合物需按照DSPE-G2與PAH-Cit的濃度比為1∶1，質量比為1∶1的比例混合。

在上述製備過程中，MCS與三元複合物需按照PAH-Cit與MCS的濃度比為4∶1，質量比為2∶3的比例混合。

本發明製備的DNA疫苗遞送系統可用於靶向遞送DNA疫苗到樹突細胞，實現程序化轉染。

相比於現有技術，本發明具有如下優點：

1、由於外層殼聚糖衍生物甘露糖配體的引入，該DNA疫苗遞送系統具有很好的樹突細胞靶向性。

2、該DNA疫苗遞送系統具有pH響應，經樹突細胞攝取進入內涵體-溶酶體系統後，電荷反轉層在酸性環境刺激下電性由負變正，快速釋放含DNA的內核。

3、具有仿病毒結構的DNA載體材料DSPE-G2能有效壓縮DNA，而且能顯著提高DNA的轉染效率，表達足量的抗原，促進機體產生免疫反應。

4、本發明所用的材料都具有良好的生物相容性和生物可降解性，細胞毒性小，安全性高。

5、本發明製備方法簡單，反應條件溫和可控，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1二元複合物的凝膠阻滯電泳圖

圖2二元複合物隨N/P比的粒徑、電位變化圖

圖3四元複合物的透射電鏡圖

圖4 DSPE-G2的細胞毒性評價

圖5 DNA疫苗遞送系統的細胞毒性評價

圖6 DNA疫苗遞送系統的螢光顯微鏡觀察體外轉染圖

具體實施方式

下面具體實施例是對本發明的進一步說明，但下述僅用於說明本發明而非用於限定本發明的範圍。

實施例1：DNA載體的製備

將2mg DSPE-G2溶於100μL氯仿/甲醇(v/v＝4∶1)中，注入1mL快速攪拌中的HEPES緩衝液(10mM，pH 7.4)中，持續攪拌6h除去有機溶劑。

用雷射粒度分析儀測定DSPE-G2納米粒的粒徑分布與表面電位。結果表明，DSPE-G2納米粒的粒徑為296.3±19.6nm，分散係數為0.269，表面電位為31.5±6.1mV。

實施例2：二元複合物的製備

將pDNA溶於HEPES緩衝液(10mM，pH 7.4)中，調整濃度為0.2mg/mL。用HEPES緩衝液(10mM，pH 7.4)調節DSPE-G2溶液濃度為0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、1、1.5、2mg/mL。將不同濃度的DSPE-G2溶液與pDNA溶液等體積混合，對應N/P比為1、2、4、5、6、10、15、20，渦旋1min，室溫孵化20min。

對二元複合物進行凝膠阻滯實驗，檢驗DSPE-G2對pDNA的壓縮能力。取10μL二元複合物溶液與上樣緩衝液混合，加入含Goldview核酸染料的1％瓊脂糖凝膠上樣孔中，浸入TAE電泳緩衝液中，恆壓90V電泳30min。紫外燈下觀察凝膠阻滯條帶。結果表明，當N/P比≥4時，DSPE-G2能完全壓縮pDNA，將其阻滯於加樣孔中而不向正極遷移(附圖1)。

用雷射粒度分析儀測定二元複合物的粒徑分布與表面電位，進一步優化N/P比。N/P比從5增加到20的過程中，粒徑從＞400nm降至250nm左右並趨於平穩。電位從接近0mV增加到30mV左右並趨於平穩。說明隨著DSPE-G2用量的增加，能更好地壓縮pDNA形成緊緻的內核，而且表明正電性的增加有利於PAH-Cit電荷反轉層的吸附。最終N/P比＝20的二元複合物粒徑為242.5±10.1nm，分散係數為0.297，表面電位為30.5±6.4mV(附圖2)。

實施例3：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統的製備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取100μL 1mg/mL的PAH-Cit溶液與二元複合物溶液混合，室溫孵化30min。將200μL三元複合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續攪拌30min。

實施例4：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統的製備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取150μL 1mg/mL的PAH-Cit溶液與二元複合物溶液混合，室溫孵化30min。將250μL三元複合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續攪拌30min。

實施例5：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統的製備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取200μL 1mg/mL的PAH-Cit溶液與二元複合物溶液混合，室溫孵化30min。將300μL三元複合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續攪拌30min。

實施例6：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統的製備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取50μL 2mg/mL的PAH-Cit溶液與二元複合物溶液混合，室溫孵化30min。將150μL三元複合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續攪拌30min。

實施例7：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統的製備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取75μL 2mg/mL的PAH-Cit溶液與二元複合物溶液混合，室溫孵化30min。將175μL三元複合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續攪拌30min。

實施例8：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統的製備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取100μL 2mg/mL的PAH-Cit溶液與二元複合物溶液混合，室溫孵化30min。將200μL三元複合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續攪拌30min。

表1：三元複合物與四元複合物的粒徑、表面電位

從表中可以看出，相同的PAH-Cit用量下，濃度較高的PAH-Cit溶液(2mg/mL)相比於低濃度(1mg/mL)更易於與二元複合物吸附，形成負電性更強的三元複合物。而在相同的PAH-Cit濃度(2mg/mL)條件下，增加PAH-Cit用量對於三元複合物的粒徑、電位沒有顯著影響。但與MSC複合後會形成粒徑更大的四元複合物，而且會增大聚沉的風險。所以選定實施例6為優方案。

在四元複合物層層自組裝的製備過程中，納米粒的粒徑變化不明顯，表面電位由內核的正電性到三元複合物的負電性，再到四元複合物的正電性，說明每一種材料的充分結合，並形成穩定的複合物。最終四元複合物的粒徑為256.8±10.7nm，分散係數為0.104，表面電位為25.1±2.3mV(附圖3)。

實施例9：DSPE-G2的細胞毒性評價

將對數生長期的樹突細胞按每孔1×104個細胞接種於96孔板，0.1μL RMPI-1640完全培養基/孔，培養24h，使細胞匯合度為70-80％。吸去培養基，每孔加入100μL不同濃度的DSPE-G2或PEI 25k(2.5、5、10、20、50μg/mL，RMPI-1640完全培養基為溶劑)。24h後，吸去培養基，每孔加入100μL含10％MTT溶液(5mg/mL，pH＝7.4PBS)的RMPI-1640完全培養基，37℃繼續孵育4h。棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，室溫振蕩10min，用酶聯免疫測定儀於570nm測定吸光度。以未經陽離子聚合物處理的細胞作為對照，計算細胞生存率，細胞生存率(％)＝OD570(實驗組)/OD570(對照組)×100。

結果表明，PEI 25k的細胞毒性隨濃度的增加而顯著增加，當濃度達到20μg/mL以上時，細胞大量死亡，顯示了較強的細胞毒性。而DSPE-G2的細胞毒性低於PEI 25k，在高濃度的情況下尤為明顯，所以適用於遞送pDNA(附圖4)。

實施例10：DNA疫苗遞送系統的細胞毒性評價

將對數生長期的樹突細胞按每孔1×104個細胞接種於96孔板，100μL RMPI-1640完全培養基/孔，培養24h，使細胞匯合度為70-80％。吸去培養基，每孔加入100μL含不同複合物(pDNA/PEI25kN/P＝10、二元複合物N/P＝5、二元複合物N/P＝10、二元複合物N/P＝15、二元複合物N/P＝20、三元複合物、四元複合物，控制pDNA含量為200ng)的無血清RMPI-1640培養基。孵育4h後，換RMPI-1640完全培養基，繼續培養20h。吸去培養基，每孔加入100μL含10％MTT溶液(5mg/mL，pH＝7.4PBS)的RMPI-1640完全培養基，37℃繼續孵育4h。棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，室溫振蕩10min，用酶聯免疫測定儀於570nm測定吸光度。以未經陽離子聚合物處理的細胞作為對照，計算細胞生存率，細胞生存率(％)＝OD570(實驗組)/OD570(對照組)×100。

結果表明，二元複合物的N/P比增大使轉染毒性增大；而且，隨著層層自組裝的進行，轉染毒性也會增強。但是，所有複合物的細胞生存率均高於80％，轉染毒性均低於pDNA/PEI25kN/P＝10對照組，表明具有樹突細胞靶向性和pH敏感性的DNA疫苗遞送系統的低毒性(附圖5)。

實施例11：DNA疫苗遞送系統的體外轉染評價

以綠色螢光蛋白質粒pGRP為報告基因，考察不同DNA疫苗遞送系統的轉染效率。將對數生長期的樹突細胞按每孔4×105個細胞接種於6孔板，1mL RMPI-1640完全培養基/孔，培養24h，使細胞匯合度為70-80％。吸去培養基，每孔加入1mL含不同複合物(pGFP/PEI25kN/P＝10、二元複合物pGFP/DSPE-G2 N/P＝20、四元複合物pGFP/DSPE-G2/PAH-Cit/CS、四元複合物pGFP/DSPE-G2/PAH-Cit/MCS，控制pDNA含量為2μg)的無血清RMPI-1640培養基。孵育4h後，換RMPI-1640完全培養基，繼續培養20h。用倒置螢光顯微鏡觀察綠色螢光蛋白的表達，並拍照。

結果表明，二元複合物pGFP/DSPE-G2、未經靶向修飾的四元複合物pGFP/DSPE-G2/PAH-Cit/CS的轉染效率均低於pGFP/PEI25k N/P＝10，而四元複合物pGFP/DSPE-G2/PAH-Cit/MCS的轉染效率顯著高於pGFP/PEI25k N/P＝10，說明了PAH-Cit電荷反轉層的pH響應性釋放pDNA、甘露糖配體的靶向樹突細胞作用能顯著提高轉染效率。使不易被轉染的免疫細胞也達到了較高的轉染效率，有助於表達足量抗原，進而激發免疫反應(附圖6)。

實施例1-11結果表明，本發明構建的一種具有樹突細胞靶向性和pH敏感性的DNA疫苗遞送系統細胞毒性低、轉染效率高，能增強核酸疫苗的免疫原性，在基因免疫治療方面有著廣闊的應用前景。

以上所述僅是本發明的具體實施方式，應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護範圍。