容易地分離的具有天然免疫球蛋白形式的雙特異性抗體的製作方法

2023-05-01 06:29:41 2

專利名稱：容易地分離的具有天然免疫球蛋白形式的雙特異性抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有重鏈異源二聚體(即相差至少一個胺基酸的兩個免疫球蛋白重鏈)的抗原結合蛋白或抗體，其允許基於免疫球蛋白重鏈和經修飾或經突變的免疫球蛋白重鏈對於親和試劑的差別親和力來進行該抗原結合蛋白質的分離。本發明還涉及抗原結合蛋白(包括雙特異性抗體)，其具有有著不同的關於A蛋白的親和力的IgG CH2和CH3區， 這允許通過所述IgG區對於A蛋白的差別結合來進行快速分離。背景抗體是多功能分子，其攜帶有獨特的對於靶抗原的結合特異性以及通過不依賴於抗原的機制與免疫系統相互作用的能力。許多目前所使用的用於癌症的生物學治療劑是針對通常在所靶向的癌細胞上過表達的抗原的單克隆抗體。當此類抗體結合腫瘤細胞時，它們可以觸發依賴抗體的細胞毒性(ADCC)或依賴補體的細胞毒性(CDC)。不幸地，癌性細胞經常發展出抑制這些正常免疫應答的機制。近年來，已經進行了努力以開發出具有超過一種抗原結合特異性的抗體樣治療齊U，例如雙特異性抗體。在癌症療法的情況下，多特異性形式可以允許這樣的可能性，即使用例如，一種特異性來將該分子靶向腫瘤細胞抗原，和另一種特異性來觸發通常對於免疫系統不可用的應答。雙特異性抗體也可以用作雙組分異源二聚受體系統的替代配體，所述雙組分異源二聚受體系統通常在當其天然配體與該兩個組分結合併將該兩個組分帶到一起時而被其天然配體激活。在本領域中已開發了許多形式以處理由具有多種結合特異性的分子所提供的治療機會。理想地，此類分子應當是表現良好的蛋白質，其易於生產和純化，並且具有有利的體內特性，例如，適合於所希望的目的的藥物動力學，最小的免疫原性，和如果希望，常規抗體的效應子功能。產生雙特異性抗體的最直接的方式(在單個細胞中表達兩種不同的抗體)引起多個種類，因為各自的重鏈形成同源二聚體和異源二聚體，但是只有異源二聚體是所希望的。 此外，輕鏈和重鏈可能不適當地配對。下面描述了試圖以不同的方式解決這些問題的形式的幾個實例。用於雙特異性T細胞募召劑(Bispecific T cell Engager, BiTE)分子的一種形式(參見例如，Wolf，E.等人，(2005)Drug DiscoveryToday 10 :1237-1244)基於單鏈可變區片段(scFv)模塊。scFv由通過柔性連接體相融合的抗體的輕鏈和重鏈可變區構成，這樣的輕鏈和重鏈可變區通常可以合適地摺疊從而這些區域可以結合關聯抗原。BiTE將兩個具有不同特異性的scFv串聯連接在單鏈上(參見

圖1A)。這種構造排除了具有兩個拷貝的相同重鏈可變區的分子的產生。此外，設計連接體構造以確保各自輕鏈和重鏈的正確配對。BiTE形式具有幾個缺點。首先，scFv分子在其聚集傾向方面是眾人皆知的。並且，儘管據說scFv連接體的免疫原性低，但不能排除產生針對BiTE的抗體的可能性。BiTE 形式中Fc部分的不存在也使得其血清半壽期非常短，並且這不得不要求頻繁的重複施用或通過泵的連續輸注這樣的複雜化。最後，Fc的不存在也意味著由Fc介導的效應子功能的缺失，所述由Fc介導的效應子功能在某些情況下可能是有益的。第二種形式(圖1B)為小鼠和大鼠單克隆抗體的雜合體，並且依賴於常規的A蛋白親和層析的改進(參見例如，Lindhofer，H.等人，(1995) J. Immunol. 155 :219-225)。在該形式中，在同一細胞中(例如，要麼作為兩個雜交瘤的四源雜交瘤(quadroma)融合物，要麼在經改造的CHO細胞中)一起產生小鼠IgGh和大鼠IgG2b抗體。由於每個抗體的輕鏈優先地與其關聯種類的重鏈相聯合，因此僅可以裝配出三種不同的抗體種類兩種親本抗體，以及通過其Fc部分相聯合的各包含一個重鏈/輕鏈對的兩個抗體的異源二聚體。所希望的異源二聚體可以容易地從該混合物中純化出來，因為其與A蛋白的結合特性不同於親本抗體的結合特性大鼠IgG2b不與A蛋白結合，而小鼠IgGh結合。因此，該小鼠-大鼠異源二聚體與A蛋白結合，但在比小鼠IgGh同源二聚體高的pH處洗脫出來，並且這使得可能選擇性地純化該雙特異性異源二聚體。與使用BiTE形式一樣，這種雜合體形式具有兩個單價抗原結合位點。所述小鼠/大鼠雜合體的缺點在於由於它是非人的，因而它可能在患者中引起免疫應答，這可能具有有害的副作用(例如，「HAMA」或「HARA」反應)，和/或中和該治療劑。被稱為「杵-臼(knobs-into-holes) 」的第三種形式(圖1C)已經在現有技術中進行了討論，其被認為潛在地可用於產生雙特異性抗體(US專利號7，183，076)。在該策略中，將兩個抗體的Fc部分進行改造以給予一個抗體以凸出的「杵」，和給予另一個抗體以互補的「臼」。當在同一細胞中生產時，據稱重鏈優先地通過經改造的「杵」與經改造的「臼」 的聯合而形成異源二聚體而不是同源二聚體。正確的輕鏈-重鏈配對的問題通過選擇具有不同特異性但是採用相同輕鏈的抗體而得到解決。這種形式的缺點在於，「杵-臼」策略可以導致大量不希望的同源二聚體的產生，因而不得不需要進一步的純化步驟。這種困難通過下述事實而加重汙染性種類在許多其特性方面與所希望的種類幾乎相同。所述經改造的形式還可能是潛在地免疫原性的，因為產生「杵」和「臼」的突變引入了外源序列。仍然存在有對於使上面所提及的某些或所有缺點最小化的雙特異性抗體形式的需要，特別是對於治療應用。附圖簡述圖1圖解說明了三種雙特異性抗體形式(A)雙特異性T細胞募召劑(BiTE) ； (B) 小鼠-大鼠雜合體；和(C)具有共同輕鏈的杵-臼。圖 2 圖解說明了 Fc Δ Adp 修飾(A)人 IgGl (SEQ ID NO 1)和 IgG3(SEQ ID NO 3)的Fc區的比對，顯示了加框的FcAAdp修飾；(B)FcAAdp雙特異性抗體的示意性表示。圖3圖解說明了 IgGl、IgG2和IgG4(有和沒有AAdp 二肽修飾)以及IgG3的人 CH3結構域的比對(採用IMGT外顯子編號和EU編號)。圖4顯示了關於雙特異性抗體的分離的A蛋白柱描記圖，顯示了使用階梯式梯度的洗脫譜。圖5顯示了來自層析分離的經洗脫的柱級分(在圖4中所顯示的)的IL4_Ra和 IL-6Ra BIAC0RE 結合譜。用固定化的抗-Fc抗體來捕獲級分中的抗體，然後就與所捕獲的抗體的結合來對可溶性IL_4Ra或IL-6Ra進行檢定。
圖6顯示了 Fc Δ Adp雙特異性抗體(IL-6R Δ /IL-4R)、Fc Δ Adp同源二聚體 (IL-6RA/IL-6RA)、具有野生型CH3序列的IgGl抗體(IL-4R/IL-4R)和對照單特異性抗體的藥物動力學譜。圖7圖解說明了在Raji細胞殺傷測定法中⑶20x⑶3 AAdp雙特異性抗體的效力。圖8圖解說明了使用⑶20x⑶3 Δ Adp雙特異性抗體的旁觀細胞093)殺傷測定法。圖9顯示了使用不同mFc異源二聚體的表達試驗的結果。圖版A 異源二聚 mIgG2a/mIgG2aPTTTK 與同源二聚 mIgG2a 和同源二聚 IgG2aPTTTK 的 pH 分離的 Western 印跡；圖版B 異源二聚mlgGh/mlgGhTTTK與同源二聚mlgGh和同源二聚IgGhTTTK的pH 分離的 Western 印跡；IP =輸入；FT =流過(flow through) ；W2 =第二次洗滌(lx PBS pH 7.2) ；El =第一次洗脫(20mM檸檬酸鈉，IM NaCl pH 5.5) ；E2 =第二次洗脫(20mM檸檬酸鈉，IM NaCl ；57% pH 5. 5+43% pH 2.6) ；E3 =第三次洗脫(20mM 檸檬酸鈉，IM NaCl pH 2. 6)。圖10圖解說明了相對於混合的同種型(例如，mlgG^i和mlgGl)的異源二聚體的形成而言突變型IgGh的異源二聚體的優先形成，其中使用4 1的IFNARl構建體IFNAR2 構建體比例。泳道1 :IFNARl_IgG2a :IFNAR2_IgGl ；泳道2 :INFARl-IgG2a :IFNAR2_IgG2aTTT ；泳道3 :IFNARl-IgG2a :IFNAR2_IgG2aTTTK ；泳道4 :IFNARl-IgG2a :IFNAR2_IgG2aPTTTK ；泳道5 :IFNARl-IgG2a :IFNAR2_IgG2aRF。概述本發明至少部分地基於在雙特異性抗原結合蛋白中採用兩個相差至少一個胺基酸的免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域序列。所述至少一個胺基酸的差異導致經改善的分離該蛋白質的能力，因為該差異導致有差別的所述CH3結構域序列結合親和試劑的能力。在一個方面，提供了抗原結合蛋白，其包含第一和第二多肽，所述第一多肽從 N-末端至C-末端包含選擇性地結合第一抗原的第一抗原結合區，隨後為包含第一 CH3區的恆定區，該第一 CH3 區為選自 IgGl (SEQ ID NO :1)、IgG2 (SEQ ID NO :3)、IgG4 (SEQ ID NO: 5)及其組合的人IgG的CH3區；並且，所述第二多肽從N-末端至C-末端包含選擇性地結合第二抗原的第二抗原結合區，隨後為包含第二 CH3區的恆定區，該第二 CH3區為選自IgGl、 IgG2、IgG4及其組合的人IgG的CH3區，其中所述第二 CH3區包含減少或消除該第二 CH3結構域與A蛋白的結合的修飾。在一個實施方案中，所述第二 CH3區包含95R修飾(根據IMGT外顯子編號；435R， 根據EU編號)。在另一個實施方案中，所述第二 CH3區還包含96F修飾(IMGT;436F，根據 EU)。在特別的實施方案中，所述第二 CH3區選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO: 6。在一個實施方案中，所述第二 CH3區來自經修飾的人IgGl(SEQ IDNO :2)，並且還包含選自 D16E、L18M、N44S、K52N、V57M 和 V82I (IMGT ；D356E, L358M、N384S、K392N、V397M 和V422I，根據EU)的修飾。
在一個實施方案中，所述第二 CH3區來自經修飾的人IgG2(SEQ IDNO :4)，並且還包含選自 N44S、K52N 和 V82I(IMGT ；N384S、K392N 和 V422I，根據 EU)的修飾。在一個實施方案中，所述第二 CH3區來自經修飾的人IgG4 (SEQ IDNO :6)，並且還包含選自 Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q 和 V82I (IMGT ；Q355R、N384S、K392N、V397M、 R409K、E419Q 和 V422I，根據 EU)的修飾。在一個實施方案中，所述CH3結構域是嵌合的結構域，其包含人IgGl、人IgG2、人 IgG3和人IgG4之中兩個或更多個的序列。在一個實施方案中，所述CH3結構域來自人IgGl、人IgG2或人IgG4，並且所述抗原結合蛋白還包含CHl結構域和CH2結構域，其中所述CHl結構域和所述CH2結構域獨立地選自人IgGl CHl或CH2結構域，人IgG2 CHl或CH2結構域，或者嵌合的人/人IgGl/IgG2 或嵌合的人/人IgGl/IgG3或嵌合的人/人IgG2/IgG3結構域或嵌合的人/人IgGl/IgG4 或嵌合的IgG3/IgG4或嵌合的IgG2/IgG4結構域。在一個特別的實施方案中，所述嵌合的 IgGl/IgG2、IgGl/IgG3、IgG2/IgG3、IgGl/IgG4、IgG3/IgG4 和 IgG2/IgG4 結構域在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。在一個實施方案中，所述抗原結合蛋白還包含免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白輕鏈選自人λ和人κ輕鏈。在一個實施方案中，所述第一和第二抗原結合區各包含至少一個⑶R，在另一個實施方案中，至少兩個CDR，在另一個實施方案中，各包含三個CDR。在一個特別的實施方案中，所述CDR來自免疫球蛋白重鏈。在另一個特別的實施方案中，所述重鏈為人重鏈。在一個實施方案中，所述第一抗原結合區包含第一免疫球蛋白重鏈可變結構域， 並且所述第二抗原結合區包含第二免疫球蛋白重鏈可變結構域。在一個實施方案中，所述第一和第二免疫球蛋白重鏈可變結構域獨立地選自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、猴、猿和人的結構域。在一個實施方案中，所述第一和第二免疫球蛋白重鏈可變結構域獨立地包含人 ⑶R、小鼠⑶R、大鼠⑶R、兔⑶R、猴⑶R、猿⑶R和人源化的⑶R。在一個實施方案中，所述 CDR是人的，並且是經體細胞突變的。在一個實施方案中，所述第一和第二免疫球蛋白重鏈可變結構域包含人構架區 (FR)。在一個實施方案中，所述人FR是經體細胞突變的人FR。在一個實施方案中，通過就對於目的抗原的反應性來篩選包含抗體可變區的噬菌體文庫而獲得所述第一和/或第二抗原結合區。在另一個實施方案中，通過用目的抗原免疫接種非人動物例如小鼠、大鼠、兔、猴或猿並且鑑定編碼對於目的抗原特異性的可變區的抗體可變區核酸序列來獲得所述第一和/或第二抗原結合區。在一個特別的實施方案中， 所述非人動物包含一個或多個人免疫球蛋白可變區基因。在另一個特別的實施方案中，所述一個或多個人免疫球蛋白可變區基因以染色體外的形式，作為在內源性免疫球蛋白基因座處的替換，或者作為隨機整合入該非人動物的基因組中的轉基因而存在於所述非人動物中。在一個實施方案中，所述第一和/或第二抗原結合區從雜交瘤或四源雜交瘤獲得，在另一個實施方案中，從使用細胞分選來篩選經免疫接種的非人動物的免疫細胞而獲得。在一個實施方案中，所述抗原結合蛋白為雙特異性抗體。在一個實施方案中，所述雙特異性抗體是完全人的雙特異性抗體並且具有獨立地在μ Μ、ηΜ或PM範圍內的對於每個表位的親和力。在一個實施方案中，所述抗原結合蛋白在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。在一個特別的實施方案中，所述抗原結合蛋白缺乏非天然的人T-細胞表位。在一個實施方案中，所述CH3區的修飾在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。在一個特別的實施方案中，所述CH3區的修飾不導致非天然的人T-細胞表位。在一個實施方案中，所述抗原結合蛋白包含重鏈，其中所述重鏈在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。在一個實施方案中，所述重鏈具有不包含非天然的T細胞表位的胺基酸序列。在一個實施方案中，所述重鏈包含這樣的胺基酸序列，所述胺基酸序列的蛋白水解不能形成在人中具有免疫原性的大約9個胺基酸的胺基酸序列。在一個特別的實施方案中，所述人為用所述抗原結合蛋白進行治療的人。在一個實施方案中，所述重鏈包含這樣的胺基酸序列，所述胺基酸序列的蛋白水解不能形成在人中具有免疫原性的大約13 至大約17個胺基酸的胺基酸序列。在一個特別的實施方案中，所述人為用所述抗原結合蛋白進行治療的人。在一個方面，提供了包含如在本文中所描述的CH2和/或CH 3修飾的雙特異性結合蛋白，其中所述雙特異性結合蛋白包含特異性地識別B細胞上的抗原的第一結合部分， 和特異性地識別T細胞上的抗原的第二結合部分。在一個實施方案中，所述結合蛋白為雙特異性抗體。在一個特別的實施方案中，所述雙特異性抗體包含人IgGl重鏈和人IgGl AAdp重鏈。在一個實施方案中，所述第一結合部分為特異性地識別CD20的人重鏈可變結構域。在一個實施方案中，所述第二結合部分為特異性地識別CD3的人重鏈可變結構域。在一個實施方案中，所述雙特異性抗體在Raji殺傷測定法中展示出大約2. 8-3. 2 X IO^12M或大約2. 8-3. OXlO^12M的EC50，並且在旁觀細胞殺傷測定法中展示出不大於大約1-10%或1-5%的旁觀細胞殺傷，其中所述旁觀細胞不包含CD20表位。在一個特別的實施方案中，所述旁觀細胞為293細胞。在另一個特別的實施方案中，在大約ΙΟΛ 至大約ΙΟ—1、的雙特異性抗體濃度範圍內，測量在該測定法中的旁觀細胞殺傷。在一個方面，提供了製備雙特異性抗體的方法，其包括獲得核酸序列，其編碼包含識別第一表位的第一可變結構域的第一免疫球蛋白重鏈，其中所述第一免疫球蛋白重鏈包含IgGl、IgG2或IgG4同種型恆定結構域，或者它們的嵌合的同種型恆定結構域；獲得第二核酸序列，其編碼包含識別第二表位的第二可變結構域的第二免疫球蛋白重鏈，其中所述第二免疫球蛋白重鏈包含IgGl、IgG2或IgG4同種型恆定結構域，或者它們的嵌合的同種型恆定結構域，所述IgGl、IgG2或IgG4同種型恆定結構域或者它們的嵌合的同種型恆定結構域在其CH3結構域中包含根除或減少與A蛋白的結合的修飾；獲得第三核酸序列，其編碼與所述第一和第二免疫球蛋白重鏈相配對的免疫球蛋白輕鏈；將所述第一、第二和第三核酸序列引入到哺乳動物細胞中；允許所述細胞表達免疫球蛋白；和，使用A蛋白來分離所述免疫球蛋白。在一個實施方案中，所述細胞選自CHO細胞、COS細胞、293細胞、HeLa細胞和表達病毒核酸序列的視網膜細胞(例如，PERC. 6 細胞)。在一個方面，提供了雙特異性抗原結合蛋白，其包含結合抗原的第一特異性和激活受體的第二特異性，其中所述雙特異性抗原結合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含含有A蛋白結合決定子的第一 IgGl、IgG2或IgG4 CH3結構域，並且所述第二多肽包含缺乏A蛋白結合決定子的第二 IgGl、IgG3或IgG4 CH3結構域。在一個實施方案中，激活受體的所述第二特異性以在M、mM、μ Μ、ηΜ或ρΜ範圍內的Kd結合所述受體。在一個實施方案中，所述第二特異性結合選自G蛋白偶聯受體、受體酪氨酸激酶、 整聯蛋白和Toll-樣受體的受體。在一個實施方案中，所述第二特異性與所述受體接觸，並且引起該受體或亞基或蛋白質與其物理地相聯合從而進行絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的磷酸化；引起核苷酸的環化 (例如，cAMP、cADP或cGMP)；引起磷脂醯肌醇或其衍生物(例如，IP3或PIP3)的產生；弓丨起脂質第二信使(例如，二醯甘油、神經醯胺、溶血磷脂酸、類二十烷酸)的產生；引起去磷酸化(例如，磷酸酶活性)；引起脂質的磷酸化從而形成第二信使；引起第二信使的水解； 引起蛋白水解；引起氧化還原信號傳導；引起蛋白質向細胞器(例如，向細胞核)的轉運； 引起所述受體(與自身)聚集從而形成同源多聚體，或(與其他受體)聚集從而形成異源多聚體；或者引起跨膜通道的打開或關閉。在一個方面，提供了製備雙特異性抗體的方法，其包括從四源雜交瘤中分離目的雙特異性抗體，其中所述目的雙特異性抗體包含第一重鏈、第二重鏈，所述第一重鏈為 IgGl、IgG2或IgG4同種型，和所述第二重鏈為具有這樣的恆定結構域的IgGl、IgG2或IgG4 同種型，所述恆定結構域在其CH3結構域中包含根除或減少與A蛋白的結合的修飾，其中使用A蛋白來分離所述目的雙特異性抗體。在一個方面，提供了製備雙特異性抗體的方法，其包括從破裂的細胞或抗體混合物中分離具有經差別修飾的IgGl、IgG2或IgG4 CH3結構域的雙特異性抗體的步驟，其中所述經差別修飾的CH3結構域在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的，並且其中所述修飾導致具有異源二聚重鏈的雙特異性抗體，所述異源二聚重鏈的單體具有對於A蛋白的差別親和力，並且使用A蛋白從所述破裂的細胞或混合物中分離所述雙特異性抗體。在一個實施方案中，使用A蛋白親和支持物來分離所述雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體在大約3. 9至大約4. 4，大約4. 0至大約4. 3，大約4. 1至大約4. 2的pH處， 或者在大約PH 4. 2處洗脫下來。在一個實施方案中，所述雙特異性抗體在大約4、4. 1,4. 2、 4. 3,4. 4或4. 5的pH處洗脫下來。在一個實施方案中，使用A蛋白親和支持物和PH梯度或階梯來分離所述雙特異性抗體，其中所述PH梯度或階梯包含離子改性劑。在一個特別的實施方案中，所述離子改性劑以大約0.5至大約1.0M的濃度存在。在一個特別的實施方案中，所述離子改性劑為鹽。在一個實施方案中，所述離子改性劑選自乙酸的鈹、鋰、鈉和鉀鹽；碳酸氫鈉和碳酸氫鉀；碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀和碳酸銫；氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化銫和氯化鎂；氟化鈉和氟化鉀；硝酸鈉、硝酸鉀和硝酸鈣；磷酸鈉和磷酸鉀；以及硫酸鈣和硫酸鎂。在一個特別的實施方案中，所述離子改性劑為鹼金屬或鹼土金屬的滷化物鹽。在一個特別的實施方案中， 所述離子改性劑為氯化鈉。在一個方面，結合蛋白包含Fe，其中所述Fc包含如本文所描述的那樣進行修飾的第一 CH3結構域和未修飾的第二 CH3，從而形成異源二聚Fe，其中該差別修飾導致所述結合蛋白在比缺乏差別修飾的相應結合蛋白高0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 2、1. 3或1. 4個pH單位處從A蛋白親和材料上洗脫下來。在一個實施方案中，經差別修飾的結合蛋白在大約4. 2的pH處洗脫下來，而未修飾的結合蛋白在大約3的pH處洗脫下來。在一個實施方案中，經差別修飾的結合蛋白在大約4. 5的pH處洗脫下來，而未修飾的結合蛋白在大約3. 5的pH處洗脫下來。在一個實施方案中，經差別修飾的結合蛋白在大約4的pH處洗脫下來，而未修飾的結合蛋白在大約 2. 8-3. 5,2. 8-3. 2或2. 8-3的pH處洗脫下來。在一個實施方案中，經差別修飾的結合蛋白在大約4.2的pH處洗脫下來，而未修飾的結合蛋白在大約2.8的pH處洗脫下來。在一個實施方案中，經差別修飾的結合蛋白在大約4. 4的pH處洗脫下來，而未修飾的結合蛋白在大約3. 6的pH處洗脫下來。在這些實施方案中，「未修飾的」是指在所述CH3結構域兩者上都缺乏在435 (EU編號)處的修飾，或缺乏在435和436 (EU編號)處的修飾。在本文中所描述的實施方案和方面中的任一個可以彼此結合使用，除非另外指明或從上下文中顯而易見。從對於隨後的描述所進行的研究中，其他實施方案將會對於本領域技術人員來說變得顯而易見。詳細描述本發明不限於所描述的特定方法和實驗條件，因為這樣的方法和條件可以變動。 也要理解，本文中所使用的術語僅是為了描述特定實施方案的目的，而並不旨在是限制性的，因為本發明的範圍由權利要求書來定義。除非另外定義，本文中所使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的普通技術人員通常所理解的那樣相同的含義。儘管在本發明的實踐或測試中可以使用與在本文中所描述的那些相似或等價的任何方法和材料，但現在描述特定的方法和材料。所有述及的出版物特此通過提及而合併。在本文中所使用的術語「抗體」包括由四條多肽鏈(通過二硫鍵相互連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈)組成的免疫球蛋白分子。每條重鏈包含重鏈可變區(在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域，CHI、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(在本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域，CL。VH和VL區可以進一步細分為高變區(稱為互補性決定區(CDR))，其點綴有更為保守的區域(稱為構架區(FR))。每個VH和VL由三個⑶R和四個FR組成，所述三個⑶R和四個FR從氨基末端至羧基末端以下述順序布置FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重鏈CDR可以縮寫為HCDRl、HCDR2和HCDR3 ；輕鏈CDR可以縮寫為LCDRl、LCDR2和LCDR3)。 術語「高親和力」抗體是指具有至少IO-9M,至少ΙΟ—Μ，至少IO-11M,或至少KT12M(如通過表面等離子共振(例如BIAC0RE )或溶液親和ELISA所測量的)的與其靶的結合親和力的那些抗體。短語「抗原結合蛋白」包括這樣的蛋白質，所述蛋白質具有至少一個⑶R並且能夠選擇性地識別抗原，即能夠以至少在μΜ範圍內的Kd結合抗原。治療性抗原結合蛋白(例如，治療性抗體)常常要求位於ηΜ或ρΜ範圍內的KD。「抗原結合蛋白」還包括這樣的蛋白質，所述蛋白質包含如本文中所描述的第一和第二 CH3結構域以及第一蛋白或配體識別結構域和第二蛋白或配體識別結構域，其中所述第一蛋白或配體識別結構域和所述第二蛋白或配體識別結構域每個獨立地識別相同的蛋白或配體，或一起識別相同的蛋白或配體，或者每個獨立地識別不同的蛋白或配體。此類蛋白質的一個實例是免疫粘附素，其包含融合蛋白(異源或同源)二聚體，其中該二聚體的多肽為包含受體組分或配體組分的融合多肽， 其中所述配體組分包含結合受體的胺基酸序列。短語「雙特異性抗體」包括能夠選擇性地結合兩個或更多個表位的抗體。雙特異性抗體通常包含兩條不同的重鏈，每條重鏈特異性地結合不同的表位——要麼在兩個不同的分子(例如，抗原)上，要麼在同一個分子(例如，同一個抗原)上。如果雙特異性抗體能夠選擇性地結合兩個不同的表位(第一表位和第二表位)，那麼第一重鏈對於第一表位的親和力通常將會比第一重鏈對於第二表位的親和力低至少一個或兩個或三個或四個數量級，反之亦然。被雙特異性抗體所識別的表位可以在相同的或不同的靶上(例如，在相同或不同的蛋白質上)。可以例如通過將識別相同抗原的不同表位的重鏈相組合來製備雙特異性抗體。例如，可以將編碼識別相同抗原的不同表位的重鏈可變序列的核酸序列與編碼不同重鏈恆定區的核酸序列相融合，並且可以在表達免疫球蛋白輕鏈的細胞中表達這樣的序列。典型的雙特異性抗體具有兩條重鏈，每條重鏈具有三個重鏈⑶R，隨後為(N-末端至 C-末端)CHl結構域、鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域；以及免疫球蛋白輕鏈，其要麼不賦予抗原結合特異性但可以與每條重鏈相聯合，要麼可以與每條重鏈相聯合併且可以結合一個或多個被重鏈抗原結合區所結合的表位，要麼可以與每條重鏈相聯合併且使得一條或兩條所述重鏈能夠與一個或兩個表位結合。術語「細胞」包括適合於表達重組核酸序列的任何細胞。這些細胞包括原核生物和真核生物(單細胞或多細胞)的細胞、細菌細胞(例如，大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)、鏈黴菌屬物種(Str印tomyces spp.)的菌株，等等)、分支桿菌細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如，釀酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、甲醇畢赤酵母(P. methanolica)等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如，SF-9、SF-21、被杆狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)等)、非人動物細胞、人細胞、或者細胞融合物例如雜交瘤或四源雜交瘤。在一些實施方案中，所述細胞為人、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施方案中，所述細胞是真核的並且選自下列細胞CH0(例如，CHO KU DXB-IlCH0, Veggie-CHO)、C0S(例如，C0S-7)、視網膜細胞、Vero, CV1、腎細胞(例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、H印G2、WI38、MRC5、 Colo205、HB 8065、HL-60 (例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431 (表皮的)、CV-1、U937、3T3、 L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞託利細胞、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞以及源自上面提及的細胞的細胞系。在一些實施方案中，所述細胞包含一個或多個病毒基因，例如表達病毒基因的視網膜細胞(例如，PER. C6 細胞)。短語「互補性決定區」或術語「⑶R」包括由生物的免疫球蛋白基因的核酸序列所編碼的胺基酸序列，其通常(即，在野生型動物中)出現在免疫球蛋白分子(例如，抗體或T 細胞受體)的輕鏈或重鏈的可變區中的兩個構架區之間。CDR可以由例如種系序列或者經重排或未重排的序列編碼，和例如由幼稚或成熟的B細胞或T細胞編碼。在某些情況下(例如，對於CDR3)，CDR可以由不是鄰接的(例如，在未重排的核酸序列中)但在B細胞核酸序列中是鄰接的(例如，由於剪接或連接所述序列(例如，V-D-J重組從而形成重鏈CDR3))兩個或更多個序列(例如，種系序列)編碼。短語「重鏈」或「免疫球蛋白重鏈」包含來自任何生物的免疫球蛋白重鏈恆定區序列，並且，除非另外說明，包含重鏈可變結構域。重鏈可變結構域包含三個重鏈CDR和四個FR區，除非另外說明。重鏈的片段包括CDR，CDR和FR，以及其組合。典型的重鏈在可變結構域之後(從N-末端至C-末端)具有CHl結構域、鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域。重鏈的功能性片段包括這樣的片段，所述片段能夠特異性地識別抗原(例如，以在μΜ、ηΜ或pM 範圍內的Kd識別抗原)，能夠從細胞中進行表達和分泌，並且包含至少一個CDR。短語「包含Fc的蛋白質」包括抗體、雙特異性抗體、免疫粘附素以及其他至少包含免疫球蛋白CH2和CH3區的功能性部分的結合蛋白。「功能性部分」是指可以結合Fc受體 (例如，Fc γ R ；或Fcfoi，即新生Fc受體)和/或可以參與補體激活的CH2或CH3區。如果 CH2和CH3區包含致使其不能結合任何Fc受體並且也不能激活補體的缺失、置換和/或插入或者其他修飾，那麼該CH2和CH3區就不是功能性的。包含Fc的蛋白質可以在免疫球蛋白結構域中包含修飾，包括所述修飾影響該結合蛋白的一個或多個效應子功能(例如，影響Fc YR結合，Fcfoi結合和因此半壽期，和/或 ⑶C活性的修飾)的情況。此類修飾包括但不限於下列修飾及其組合(參考免疫球蛋白恆定區的 EU 編號):238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、 276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、 308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、 337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、 384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438 和 439。例如，但非限制性地，所述結合蛋白為包含Fc的蛋白質並展示出增加的血清半壽期(相比於沒有所描述的修飾的相同的包含Fc的蛋白質而言)，並且具有在位置250(例如，E 或 Q) ；250 禾口 428(例如，L 或 F) ；252(例如，L/Y/F/W 或 T)、2M(例如，S 或 T)禾口 256 (例如，S/R/Q/E/D或T)處的修飾；或者在428和/或433 (例如，L/R/SI/P/Q或K)和/ 或434(例如，H/F或Y)處的修飾；或者在250和/或似8處的修飾；或者在307或308 (例如，308F、V308F)和434處的修飾。在另一個實例中，所述修飾可以包括428L (例如，M^8L) 和 434S (例如，N4;34S)修飾；^8L、259I(例如，V259I)和 308F (例如，V308F)修飾；433K (例如，H433K)和 434(例如，434Y)修飾；252、254 和 256 (例如，252Y、254T 和 256E)修飾；250Q 和428L修飾(例如，T250Q和M428L) ；307和/或308修飾(例如，308F或308Ρ)。短語「離子改性劑」包括這樣的部分，其減少蛋白質之間的非特異性(即，非親和力)離子相互作用的影響，或者破壞蛋白質之間的非特異性(即，非親和力)離子相互作用。「離子改性劑」包括，例如，I族和II族金屬與乙酸根、碳酸氫根、碳酸根、滷素(例如， 負氯離子或負氟離子)、硝酸根、磷酸根或硫酸根的鹽，離子組合。「離子改性劑」的非限制性的舉例說明性的列表包括乙酸的鈹、鋰、鈉和鉀鹽；碳酸氫鈉和碳酸氫鉀；碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀和碳酸銫；氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化銫和氯化鎂；氟化鈉和氟化鉀；硝酸鈉、 硝酸鉀和硝酸鈣；磷酸鈉和磷酸鉀；以及硫酸鈣和硫酸鎂。「離子改性劑」包含影響離子相互作用的那些部分，其在加入至PH梯度或階梯之後，或者在「離子改性劑」中平衡A蛋白支持物和應用PH階梯或梯度之後，導致在同源二聚IgG和異源二聚IgG(例如，野生型人IgG 和相同的但攜帶一個或多個本文中所描述的其CH3結構域的修飾的IgG)的洗脫之間的ρΗ 單位距離的變寬。「離子改性劑」的合適的濃度可以由採用相同的柱子、PH階梯或梯度的其濃度來確定，其中增加「離子改性劑」的濃度直至在給定的PH階梯或ρΗ梯度下達到最大ρΗ 距離。
短語「輕鏈」包含來自任何生物的免疫球蛋白輕鏈恆定區序列，並且，除非另外說明，包含人κ和λ輕鏈。輕鏈可變(VL)結構域通常包含三個輕鏈CDR和四個構架 (FR)區，除非另外說明。通常，全長輕鏈從氨基末端至羧基末端包含VL結構域(其包含 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)和輕鏈恆定結構域。在本發明中可使用的輕鏈包括，例如不選擇性地結合被所述抗原結合蛋白選擇性地結合的第一或第二抗原的那些。合適的輕鏈包括可以通過在現有的抗體文庫(溼文庫或計算機文庫)中就最經常採用的輕鏈進行篩選而鑑定出的那些，其中所述輕鏈基本上不幹擾所述抗原結合蛋白的抗原結合結構域的親和力和/或選擇性。合適的輕鏈包括可以結合一個或兩個被所述抗原結合蛋白的抗原結合區結合的表位的那些。短語「μ M範圍」意指1-999 μ M ；短語「ηΜ範圍」意指1_999ηΜ ；短語「ρΜ範圍」意指 1-999ρΜ。短語「經體細胞突變的」包括涉及來自經歷了類別轉換的B細胞的核酸序列，其中在經類別轉換的B細胞中的免疫球蛋白可變區(例如，重鏈可變結構域，或包括重鏈CDR或 FR序列)的核酸序列與在類別轉換之前的B細胞中的該核酸序列是不同的，例如在未經歷類別轉換的B細胞與經歷了類別轉換的B細胞之間CDR或構架核酸序列的差異。「經體細胞突變的」包括涉及來自經親和力成熟的B細胞的核酸序列，其與在未經親和力成熟的B細胞中的相應序列(即，在種系細胞的基因組中的序列)是不同的。短語「經體細胞突變的」 還包括涉及來自在將B細胞暴露於目的抗原之後的該B細胞的核酸序列，其中所述核酸序列不同於在將該B細胞暴露於目的抗原之前的相應核酸序列。短語「經體細胞突變的」涉及來自抗體的序列，所述抗體已在動物(例如具有人免疫球蛋白可變區核酸序列的小鼠) 中作為對於抗原攻擊的應答而產生，並且由於在這樣的動物中固有地運作的選擇過程而引起。短語「可變結構域」包括免疫球蛋白輕鏈或重鏈(其如所希望的那樣進行修飾) 的胺基酸序列，其從N-末端至C-末端(除非另外指明)順次包含下列胺基酸區域FR1、 ⑶R1、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。「可變結構域」包括能夠摺疊成具有雙β片層結構的規範結構域(VH或VL)的胺基酸序列，其中所述β片層通過在第一 β片層和第二 β片層之間的二硫鍵相連接。具有經修飾的IgG CH3區的雙特異性抗體發明人已開發了一種新的形式，其將常見的輕鏈策略與選擇性A蛋白純化方案 (其可以用於人抗體組分)的實施相組合。先前已注意至Ij(Lindhofer, H.等人，(1995) J. Immunol. 155 :219-225)，由於人 IgG3不與A蛋白結合，因而潛在地可以將它與任何其他三種人IgG亞類一起在與用於小鼠-大鼠雜合體的純化策略相似的純化策略中使用。然而，儘管所有四種人IgG亞類是高度同源的，但並不知道IgGl、IgG2和IgG4的Fc部分如何容易地與IgG3形成異源二聚體； 甚至僅優先形成同源二聚體都將可能在某些情況下(例如，從四源雜交瘤中分離)對於所希望的異源二聚體的總產量具有負面影響。還可能需要額外的修飾以補償IgG3的鉸鏈區與其他亞類的鉸鏈區之間的差異。還優選的是，在某些情況下，不需要存在完全的IgG3 Fe, 因為對於效應子功能的潛在影響。因此，發明人設計出了採用幸運地簡單的A蛋白結合決定子的「最小」形式。已報導(Jendeberg, L.等人，(1997) J. ImmunologicalMeth. 201 :25-34)，IgG3 不能結合 A 蛋白是由單個胺基酸殘基，Arg435 (EU編號；Arg95，根據IMGT)(在其他IgG亞類中的這一相應位置被組氨酸殘基佔據)所決定的。因此，可能的是，使用其中His435突變為Arg的IgGl 序列，以代替IgG3。因此，IgGl中的單個點突變應當足以產生順應於新純化方案的不同的結合親和力。這種修飾將被稱為IgGlAA,以表示其不能結合A蛋白(和，類似地，IgG2AA 和IgG4 Δ A——或更一般地，Fc Δ A)。然而，特定的點突變通過所述突變而引入新的肽序列，其可能潛在地是免疫原性的。在理論上，點突變可以加載到MHC II類分子上並呈遞給T細胞，並因此引起免疫應答。 為了避免該缺陷，可以使用二肽突變，H435R/W36F(EU編號；H95R/Y96F，根據IMGT)。所得的序列在所述改變附近與IgG3的序列相同(參見，圖2A)，並因此預期是免疫學上「不可見的」，因為將沒有非天然的短肽可用於呈遞給T細胞。已報導，該雙突變體仍然不結合A蛋白(Jendeberg, L.等人，(1997) J. Immunological Meth. 201 :25-34)。最後，該雙肽突變不包括任何形成Fc 二聚體界面的殘基，因此不可能干擾異源二聚體的形成。該二肽突變被稱為「IgGlAAdp，，(禾口，類也，IgG2AAdp、I gG4 Δ Adp 禾口 Fc Δ Adp)。 IgGl、IgG2 禾口 IgG4 中該二肽修飾的布置在圖3中在標示為IgGlAAdp、IgG2AAdp和IgG4AAdp的序列(其與野生型人IgG CH3結構域序列以及hIgG3—起顯示)中指明，其中顯示了 IMGT外顯子編號和 EU編號。所述Fc Δ Adp修飾不包括任何據信形成Fc 二聚體界面的殘基，因此所述Fc Δ Adp 修飾不可能干擾異源二聚體的形成。由於所述Fc Δ Adp是如此地最小，因而它也可能摻入到其他經改造的Fc形式中。IgG2AAdp和IgG4 AAdp在其中希望與它們中的每一個相關的效應子功能(或其缺乏)的情況下可以是有利的。總之，上面所描述的雙特異性抗體形式包括使用相同輕鏈的具有不同特異性的兩個抗體，其中它們中之一的Fc區被修飾為FcAAdp形式(參見，圖2B)。它的構型為天然的人抗體的構型，並因此應當共享其有利的特性，包括低的聚集傾向，體內穩定性，最小的免疫原性，與抗體相似的生物分布特性，良好的藥物動力學，和可選地，效應子功能。提供了用於分離此類雙特異性抗體的方法，其在實施中是相對快速和簡單的。具有經修飾的小鼠IgG CH區的雙特異性結合蛋白發明人已設計出了用於容易地分離結合蛋白的方法，所述結合蛋白包含關於在 CH3結構域中的一個或多個胺基酸而言為異源二聚的免疫球蛋白重鏈(或其功能性的包含 CH2和CH3的片段)。仔細選擇小鼠IgG CH結構域的修飾和應用特定的分離技術賦予了從同源二聚體中和從不包含所述修飾的異源二聚體中容易地分離包含兩個經差別修飾的小鼠CH區的結合蛋白的能力。在247處包含脯氨酸，在252、2M和256處包含蘇氨酸，和在258處包含賴氨酸的小鼠IgGl僅微弱地與A蛋白結合。然而，小鼠IgGh和IgG^在那些位置(IgG^位置256 和258除外)處包含不同的殘基，並且小鼠IgGh和2b與A蛋白很好地結合。在製備對於重鏈而言為異源二聚的抗體的方法中差別修飾兩個小鼠IgG的CH區將會賦予這樣的抗體以有區別的A蛋白結合特徵。以這樣的方式，設計出了有區別的A蛋白分離方案，其允許簡便地將經修飾的異源二聚體與任何小鼠IgG同源二聚體(無論其是IgGl (其將會僅十分弱地與A蛋白結合，如果從根本上來說)的同源二聚體，還是小鼠IgGh的同源二聚體、小鼠IgG2b的同源二聚體或者IgGh/IgG2b的異源二聚體)相分開。例如，具有兩個不同的重鏈可變結構域但相同的同種型(例如IgGh)的雙特異性抗體可以在採用重鏈序列的合適的表達系統中進行表達，其中僅修飾IgGh CH區中的一個以減少或消除A蛋白結合決定子。 以這樣的方式，IgGh CH區中僅一個將會展示出實質的對於A蛋白的親和力，並且將會容易地從經修飾的異源二聚體中分離任何從未修飾的IgGh和經修飾的IgGh的二聚體形成的抗體。在各種實施方案中，涉及這樣的抗體，其中Fc 二聚體的單個CH區包含經修飾的CH 區，而Fc二聚體的另一CH缺乏它們。修飾小鼠IgG CH區以便在選自下列的特定位置(EU編號)處包含特定的胺基酸252T、254T 和 256Τ ；252Τ、254Τ、256Τ 和 258Κ ；247Ρ、252Τ、254Τ、 256Τ 和 258Κ ；435R 和 436F ；252T、254T、256T、435R 和 436F ；252T、254T、256T、258K、435R 和 436F ；24tP、252T、254T、256T、258K、435R 和 436F ；和 435R。在一個特別的實施方案中，進行特定的成組修飾，其選自下列M252T、S2MT、S256T ；M252T, S254T, S256T, I258K ；I247P, M252T、S254T、S256T、I258K ；H435R、H436F ；M252T、S254T、S256T、H435R、H436F ；M252T、 S254T、S256T、I258K、H435R、H436F ； I247P、M252T、S254T、S256T、I258K、H435R、H436F ；和 H435R。可以將異源二聚的基於小鼠IgG的結合蛋白用於各種各樣的應用。例如，它們允許用於分離具有小鼠恆定結構域的雙特異性抗體的方法，其中所述修飾不幹擾或基本上不幹擾該抗體與一個或多個小鼠Fc受體的結合，從而該抗體可以參與例如ADCC或CDC，並且也結合兩個或更多個在相同或不同靶上的表位。在一個方面，提供了用於分離包含第一小鼠IgG CH區和第二小鼠IgG CH的結合蛋白的方法，其中修飾所述第一 IgG CH區(但不修飾所述第二 IgG CH區)以便減少或消除所述第一小鼠IgG CH區而不是所述第二小鼠IgG CH區的A蛋白結合親和力，並且其中所述結合蛋白包含結合第一表位的第一結合部分和結合第二表位的第二結合部分。在一個實施方案中，所述修飾不改變或基本上不改變所述結合蛋白與Fc受體的結合親和力。在一個實施方案中，所述結合蛋白包含增加或降低該結合蛋白與Fc受體的親和力的修飾。在一個實施方案中，相比於缺乏所述修飾的相應的結合蛋白而言，所述修飾不改變或基本上不改變所述結合蛋白在包含天然小鼠Fc γ R受體和/或天然小鼠Fcfoi的小鼠中的血清半壽期。在一個實施方案中，相比於缺乏所述修飾的相應的結合蛋白而言，所述修飾不改變或基本上不改變所述結合蛋白在包含天然小鼠高和低親和力Fc γ R受體和/或Fcfoi受體的替換的小鼠中的血清半壽期。在一個實施方案中，所述第一表位和所述第二表位是不同的，並且在不同的細胞上或在不同的蛋白質上。在一個實施方案中，所述第一表位和所述第二表位是不同的，並且在相同的細胞上或在相同的蛋白質上。在一個實施方案中，所述Fc受體選自高親和力Fc受體、低親和力Fc受體和 Fcfoi。在一個特別的實施方案中，所述Fc受體選自下列中的一個或多個小鼠Fcfoi、小鼠 Fc y R、小鼠Fc y RIIB、小 FcyRIII,小鼠Fc y RIV及其組合。在一個特別的實施方案中， 所述Fc受體選自下列中的一個或多個人Fcfoi、人Fc YR、人Fc yRIIB、AFcyRIIC、AFc y RIIIB、人 Fc y RIIIA、人 Fc y RIIA 及其組合。免疫原性本發明的許多實施方案的一個優點是能夠採用修飾來製備雙特異性抗體，所述雙特異性抗體不僅基於與A蛋白的差別結合而為可容易分離的，並且還在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。該特徵使得這樣的實施方案特別可用於製備用於人治療用途的雙特異性抗體中，和可用於製備免疫粘附素，其例如是非免疫原性的或基本上非免疫原性的(採用人結合部分，即人受體組分和/或人配體)。該特徵與這樣的雙特異性抗體相關，所述雙特異性抗體具有IgGl、IgG2和IgG3的具有H95R/Y96F (IMGT編號)修飾的CH3結構域， 和包含進一步修飾(其導致該位置被修飾從而反映不同IgG同種型的野生型序列)的那些 CH3結構域。因此，儘管在自然界中未發現所述修飾與特定的IgG同種型相關，但經修飾的序列局部地與不同IgG同種型的野生型序列相同，並且並不預期所述修飾是免疫原性的或基本上免疫原性的。還可能的是，即使其序列不與任何天然序列局部相同，修飾也是非免疫原性的；此類修飾將會是同樣有用的。如果是非免疫原性的，那麼最小的點突變H95R(IMGT 編號)因而將會是本發明的合適的實施方案。因此，提供了雙特異性抗體，所述雙特異性抗體關於其重鏈恆定結構域而言在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的，然而攜帶一個或多個重鏈恆定結構域的差別修飾，包括導致重鏈恆定結構域對於親和試劑(例如，A蛋白)的差別親和力的修飾。所述修飾包括本文中公開的那些。在一個特別的實施方案中，關於其CH3結構域而言在人中為非免疫原性的或基本上非免疫原性的，然而具有經差別修飾的重鏈的雙特異性抗體為包含有著下列修飾之一(或者，在另一個實施方案中，基本上由下列修飾之一組成)的CH3結構域的人 IgGl、IgG2 或 IgG4 :H95R，或者 H95R 和 Y96F(IMGT 編號)。預期所述雙特異性抗體相關於其中對於人IgGl、IgG2和IgG4同等型的耐受性尚未在任何大程度上被打破的人而言，是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。特別地，預期所述Fc Δ Adp修飾是免疫學上「不可見的」，因為MHC II類分子的結合溝容納包含由T細胞受體的可變環所識別的主要決定子的9-聚體，從而缺乏任何天然 9-聚體子序列的肽將看起來不可能引起免疫應答。然而，比9-聚體更長的肽(通常大約 13-至17-聚體)被MHC II類分子結合，並且可能的是，突出的區段可能潛在地影響結合。 因此，消除較長的非天然序列的額外修飾(在Fc AAdp修飾之外)可以進一步減少免疫原性的潛在性。一個特別的實例為修飾V422I(EU ；V82I，根據IMGT編號)，其在IgGlAAdp中將最小非天然肽的長度從14個殘基延伸至39個殘基，和在類似地定義的IgG2AAdp中延伸至43個殘基。另一個實例為IgG4AAdp中的修飾L445P(EU ；L105P，根據IMGT編號)，其將該長度從10個殘基延伸至14個殘基。藥物動力學對於A蛋白的結合位點與對於新生Fc受體(FcRN，其被認為負責賦予免疫球蛋白以延長的血清半壽期)的結合位點相重疊。因此，在A蛋白結合位點附近的修飾提高了這樣的可能性，即在本文中所提出的形式可以具有比IgGl、2和4更短的血清半壽期，假定人 IgG3(大約7天)具有比其他IgG亞類(大約21天)更短的血清半壽期。一些影響His435 的Fc突變體已顯示不結合FcRN，並且在小鼠中具有較短的半壽期。然而，藥物動力學分析已顯示，IgGlAA/IgGl異源二聚體的血清半壽期並非與IgGl同源二聚體的血清半壽期相當不同(參見，實施例2)。因此，IgGl AAdp突變具有去除A蛋白結合而同時仍然保留IgGl 的較長半壽期的優點。因此，在一個實施方案中，提供了包含如在本文中所描述的CH3結構域修飾的雙特異性抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白展示出與缺乏在CH3結構域處的修飾的相同的雙特異性抗原結合蛋白等價的藥物動力學特性曲線。在一個實施方案中，提供了包含 IgGl ΔΑ/IgGl異源二聚Fc的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體所具有的血清半壽期為在其他方面相同但包含IgG3 CH3結構域或者在其他方面相同但包含至少一個IgG3重鏈的雙特異性抗體的大約1. 5倍、大約2倍、大約2. 5倍或大約3倍。在一個實施方案中，提供了包含IgGl ΔΑ/IgGl異源二聚Fc的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體展示出與沒有該IgGl Δ A修飾的雙特異性抗體(即IgGl同源二聚雙特異性抗體)大致相同的血清半壽期。免疫球蛋白重鏈可以使用本領域中已知的任何方法來產生可以用於產生具有所希望的特徵(例如，所希望的特異性，所希望的親和力，所希望的功能性，例如阻斷、非阻斷、抑制、激活等) 的雙特異性抗體的免疫球蛋白重鏈可變區。然後，可以通過將包含可變區的核酸序列克隆到具有本文中所描述的所希望的重鏈恆定區的構建體中來構建所希望的重鏈。在一個實施方案中，第一重鏈包含由源自第一動物(其已用第一抗原進行免疫接種)的成熟B細胞基因組的核酸所編碼的可變區，並且第一重鏈特異性地識別第一抗原。在一個特別的實施方案中，第二重鏈包含由源自第二動物(其已用第二抗原進行免疫接種) 的成熟B細胞基因組的核酸所編碼的可變區，並且第二重鏈特異性地識別第二抗原。在一個實施方案中，第一動物和/或第二動物為包含未重排的人免疫球蛋白重鏈可變區的經基因改造的動物。在一個實施方案中，第一動物和/或第二動物為包含未重排的人免疫球蛋白重鏈可變區和人免疫球蛋白恆定區的經基因改造的動物。在一個實施方案中，第一動物和/或第二動物為包含未重排的人免疫球蛋白重鏈可變區的經基因改造的小鼠°免疫球蛋白重鏈可變區序列可以通過本領域中已知的任何其他方法(例如，通過噬菌體展示)來獲得，並且可以將由此所獲得的序列用於製備核酸構建體以用於連接至編碼任何合適的重鏈(例如，具有如在本文中所描述的經修飾的CH3結構域的重鏈)的核酸， 並置於表達構建體中和轉移至能夠產生重鏈(例如，在合適的輕鏈存在下)的細胞。免疫球蛋白輕鏈包含識別兩個不同表位(或兩個不同抗原)的兩條重鏈的雙特異性抗體更容易被分離，在它們可以與相同的輕鏈(即具有相同的可變結構域和恆定結構域的輕鏈)相配對時。在本領域中已知各種方法用於產生輕鏈，所述輕鏈可以與具有不同特異性的兩條重鏈相配對，而不幹擾或基本上不幹擾重鏈可變結構域與其靶抗原的選擇性和/或親和力。在一種方法中，輕鏈可以通過下述方式來選擇調查所有輕鏈可變結構域的使用統計學，鑑定出人抗體中最頻繁使用的輕鏈，並且將該輕鏈與具有不同特異性的兩條重鏈相配對。在另一種方法中，輕鏈可以通過下述方式來選擇觀察噬菌體展示文庫(例如，包含人輕鏈可變區序列的噬菌體展示文庫，例如人^Fv文庫)中的輕鏈序列，並且從該文庫中選擇出最經常使用的輕鏈可變區。在另一種方法中，輕鏈可以通過下述方式來選擇使用兩條重鏈的重鏈可變序列作為探針來對輕鏈可變序列的噬菌體展示文庫進行檢定。與兩個重鏈可變序列都相聯合的輕鏈被選擇作為用於所述重鏈的輕鏈，並且允許相關於兩個表位的結合和/或激活。在另一種方法中，輕鏈可以通過下述方式來選擇將已知的輕鏈與所希望的重鏈相組合，並且就結合特異性、親和力和/或激活能力來對所得到的雙特異性抗體進行檢定。在任何用於選擇輕鏈的方法中遇到困難(例如，所述輕鏈幹擾所述重鏈中的一條或兩條與其抗原的結合，或者所述輕鏈不能與所述重鏈中的一條或兩條令人滿意地相聯合)的情況下，可以將所述輕鏈與所述重鏈的關聯輕鏈進行比對，並且在所述輕鏈中產生修飾以便更接近地匹配對於該兩條重鏈的關聯輕鏈來說共同的序列特徵。如果免疫原性的機會需要被最小化，那麼所述修飾優選地導致在已知的人輕鏈序列中存在的序列，從而蛋白水解加工不可能產生T細胞表位，基於在領域中已知用於評估免疫原性的可能性的參數和方法(即，計算機測定法以及溼測定法)。抗體和結合蛋白所述組合物和方法在製備人雙特異性抗體(即包含人恆定結構域和可變結構域的雙特異性抗體)中是特別有用的。在一些實施方案中，人抗體包括具有源自人種系免疫球蛋白序列(在一些實施方案中，源自經體細胞突變的人免疫球蛋白序列(例如，在包含人免疫球蛋白基因序列的動物中產生的))的重鏈可變結構域和重鏈恆定結構域的那些抗體。在一些實施方案中，人可變區和/或恆定區可以包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基或者由於例如在CDR(特別是CDR3)中的重組和/或剪接而編碼的胺基酸殘基。人抗體並不想要包括其中已經將源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列嫁接到人構架序列上的抗體。那些抗體被稱為人源化的或嵌合的抗體。人抗體包括包含突變(例如，通過隨機或位點專一誘變而在體外引入的)的那些抗體，但是所述突變優選地在人中是非免疫原性的。所述方法和組合物可以用於製備嵌合抗體，其優選地在人中是非免疫原性的，或具有低免疫原性。嵌合抗體是其中重鏈可變區或構架區或⑶R或者重鏈恆定區或結構域之一來自不同物種(例如，人和小鼠，或者人和靈長類)的抗體。在一些實施方案中，嵌合抗體包括具有非人來源(例如，小鼠)的重鏈可變區和人來源的重鏈恆定區的抗體。在一些實施方案中，嵌合抗體包括具有人來源的重鏈可變區和非人(例如，小鼠)來源的重鏈恆定區的抗體。在各種實施方案中，小鼠來源的區域與具有或沒有體細胞高變的小鼠免疫球蛋白種系序列相同或基本上相同。嵌合抗體還包括這樣的抗體，所述抗體具有與人免疫球蛋白種系序列相同或基本上相同的輕鏈恆定區和非人(例如，小鼠)重鏈或嵌合的人/非人重鏈。嵌合抗體包括這樣的抗體，所述抗體具有與非人(例如，小鼠)免疫球蛋白種系序列相同或基本上相同的輕鏈恆定結構域和人重鏈或嵌合的非人/人重鏈。在一些實施方案中，所述組合物和方法用於製備經親和力成熟的抗體。在一些實施方案中，經親和力成熟的抗體在一個或多個CDR中包含一個或多個改變，其導致相比於缺乏所述改變的基本上相同的抗體而言更高的所述抗體對於其靶抗原的親和力(例如，在 nM或pM範圍內的Kd)。經親和力成熟的抗體可以通過本領域中已知的任何合適的方法來製備，例如，通過CDR和/或構架區的隨機或位點定向誘變，隨後為親和篩選、VH結構域改組等。在一些實施方案中，所述抗體為中和抗體。中和抗體包括能夠中和、抑制或阻止抗原的生物學活性的抗體。中和抗體包括在結合抗原後阻止或降低所述抗原在體內和體外作用於該抗原的天然靶的能力的那些抗體。中和抗體的實例包括針對生物學受體的蛋白質配體的抗體，其阻止所述配體結合所述受體，或者針對生物學受體的抗體，其阻止所述受體結合其配體，其中在不存在所述抗體的情況下的配體結合引起所述受體在細胞內產生變化。 確定一種抗體是否為中和抗體通常需要進行功能測定法，其中測量所述抗體對於所述抗原的生物學活性的影響。本發明的方法和組合物在各種關於抗體和其他結合蛋白的應用中也是有用的。本文提供了一些有用應用的簡短描述。可以製備包含針對腫瘤抗原和T-細胞抗原的結合特異性的雙特異性結合蛋白， 其靶向細胞上的抗原，例如⑶20，並且還靶向T-細胞上的抗原，例如⑶3。以這樣的方式， 所述雙特異性抗體靶向患者中的目的細胞(例如，淋巴瘤患者中的B細胞，通過CD20結合) 以及該患者的T-細胞。在各種實施方案中，對所述雙特異性抗體進行設計，以便在結合CD3 後激活T-細胞，從而將T-細胞激活與特定的、所選擇的腫瘤細胞相偶聯。也可以製備包含兩個結合部分的雙特異性蛋白，所述兩個結合部分中的每個針對在相同細胞的表面上的結合夥伴(即，每個針對不同的靶)。該設計特別適合於靶向在相同細胞的表面上表達該兩種靶的特定細胞或細胞類型。儘管靶可能獨個地出現在其他細胞上，但是對這些結合蛋白的結合部分進行選擇，從而使得每個結合部分以相對低的親和力 (例如，低μ Μ,或高ηΜ——例如，超過一百ηΜ的KD，例如500、600、700、800ηΜ)結合其靶。 以這樣的方式，僅在所述兩種靶在相同細胞上鄰近的情況下，才有利於延長的靶結合。可以製備包含結合相同靶的兩個結合部分的雙特異性結合蛋白，所述兩個結合部分中的每個在相同靶的不同表位處結合。該設計特別適合於使成功地用結合蛋白阻斷靶的可能性最大化。多個細胞外環(例如，跨膜通道或細胞表面受體的細胞外環)可以被相同的雙特異性結合分子所靶向。可以製備包含兩個結合部分的雙特異性結合蛋白，所述兩個結合部分簇集並激活免疫信號傳導的負調節物，從而導致免疫抑制。當所述靶在相同的細胞上時，可以實現順式阻抑；當所述靶在不同的細胞上時，可以實現反式阻抑。順式阻抑，例如可以用具有抗-IgGRnb結合部分和抗-FelDl結合部分的雙特異性結合蛋白來實現，從而使得IgGRnb 僅在!^elDl存在下才被簇集，以便下調對於!^elDl的免疫應答。反式阻抑，例如可以用具有抗-BTLA結合部分和特異性地結合組織特異性目的抗原的結合部分的雙特異性結合蛋白來實現，從而使得抑制性BTLA分子的簇集僅在所選擇的靶組織中發生，這潛在地處理自身免疫疾病。可以製備激活多組分受體的雙特異性結合蛋白。在該設計中，針對受體的兩個組分的兩個結合部分結合該受體，使該受體交聯，並激活從該受體的信號傳導。這可以例如使用具有結合IFNARl的結合部分和結合IFNAR2的結合部分的雙特異性結合蛋白來進行，其中結合使該受體交聯。這樣的雙特異性結合蛋白可以提供關於幹擾素治療的備選方案。可以製備轉運結合部分跨越半滲透性屏障(例如，血腦屏障)的雙特異性結合蛋白。在該設計中，一個結合部分結合可以越過特定的選擇性屏障的靶；另一個結合部分靶向具有治療活性的分子，其中該具有治療活性的靶分子通常不能穿過該屏障。這種類型的雙特異性結合蛋白對於將治療劑帶至否則治療劑將不會到達的組織是有用的。一些實例包括靶向PlGR受體以轉運治療劑進入腸或肺，或者靶向運鐵蛋白受體以轉運治療劑跨越血腦屏障。 可以製備轉運結合部分進入特定細胞或細胞類型的雙特異性結合蛋白。在該設計中，一個結合部分靶向容易地內在化到細胞中的細胞表面蛋白(例如，受體)。另一個結合部分靶向細胞內蛋白質，其中所述細胞內蛋白質的結合導致治療效應。結合吞噬免疫細胞的表面受體和感染性病原體(例如，酵母或細菌)的表面分子以將所述感染性病原體帶至吞噬免疫細胞附近從而促進所述病原體的吞噬的雙特異性結合蛋白。此類設計的一個實例可以為靶向CD64或CD89分子和也靶向病原體的雙特異性抗體。具有抗體可變區作為一個結合部分和具有非Ig部分作為第二個結合部分的雙特異性結合蛋白。所述抗體可變區實現靶向，而所述非Ig部分為與Fc相連接的效應子或毒素。以這樣的方式，配體(例如，效應子或毒素)被遞送至由該抗體可變區所結合的靶。具有兩個部分的雙特異性結合蛋白，所述兩個部分中的每個結合至Ig區(例如， 包含CH2和CH3區的Ig序列)，從而使得任何兩個蛋白質部分可以在Fc的情境下被帶至彼此附近。該設計的實例包括誘捕劑(trap)，例如，同源二聚或異源二聚的誘捕劑分子。核酸可以通過本領域中已知的任何合適的方法來獲得編碼單克隆抗體的核酸序列。用於獲得單克隆抗體(和其核酸序列)的合適方法的實例包括，例如，通過雜交瘤方法(參見，例如Kohler等人，(1975)Nature 256:495-497)或噬菌體抗體文庫(參見，例如，參見 Clackson 等人，(1991) Nature 352 :624-628) 在各種實施方案中，所述免疫球蛋白重鏈可變結構域源自經基因改造的動物或轉基因動物的核酸序列。在一些實施方案中，所述區域源自包含人免疫球蛋白小基因座 (minilocus)的動物。在一些實施方案中，所述區域源自包含一個或多個染色體外核酸的小鼠，所述染色體外核酸包含一個或多個編碼免疫球蛋白序列的核酸。在各種實施方案中，所述動物可以具有一個或多個未重排的人免疫球蛋白核酸序列。在一些實施方案中，所述動物包含人輕鏈可變區核酸序列，在一些實施方案中，包含人重鏈可變序列，在一些實施方案中，包含重鏈和輕鏈可變序列，和在一些實施方案中，還包含人恆定區序列。在一個特別的實施方案中，所述核酸序列源自其中內源性小鼠重鏈可變區基因區段和輕鏈可變區基因區段已經被人重鏈可變區基因區段和輕鏈可變區基因區段替換的小鼠。在一些實施方案中，所述核酸序列源自這樣的動物的幼稚B細胞或T細胞。在其他實施方案中，所述核酸序列源自已用目的抗原進行免疫接種的動物的B細胞或T細胞。在各種實施方案中，所述核酸序列通過用引物(包括例如，成組的簡併引物，其包含一個或多個FR序列、連接序列或恆定序列)擴增它們而源自細胞。在各種實施方案中，所述免疫球蛋白可變結構域源自已用目的抗原進行免疫接種的動物的核酸。例如，用目的抗原對非人的轉基因或經基因改造的動物進行免疫接種(通過例如，使動物暴露於該抗原或者攜帶該抗原或編碼該抗原的可表達形式的核酸的細胞)， 從而允許所述動物經歷免疫應答，從所述動物中分離免疫細胞(例如，B細胞)，可選地使所述細胞永生化，和篩選所述細胞以鑑定與該抗原的反應性和/或鑑定和/或分離核酸序列， 所述核酸序列編碼當置於抗體的情境下時能夠識別該抗原的免疫球蛋白可變區。在一些實施方案中，所述細胞為B細胞。在一些實施方案中，使用經免疫接種的動物的B細胞來製備雜交瘤，並且鑑定表達特異性地識別所述抗原的表位的抗體的B細胞，以及鑑定和/或分離編碼識別所述表位的可變區胺基酸序列的核酸序列。在一些實施方案中，所述核酸源自人、非人靈長類(例如，猿類例如黑猩猩)、猴類 (例如，食蟹猴或恆河猴)、嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、倉鼠)、驢、山羊、綿羊等。在一些實施方案中，所述重鏈包含源自人細胞的序列。例如，在體外暴露於抗原並置於合適的宿主動物(例如，SCID小鼠)的人胎兒細胞。在一些實施方案中，使用載體將所述核酸引入到細胞中。載體包括，例如質粒、粘粒、反轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、植物病毒、YAC、BAC、EBV-衍生的附加體。在一些實施方案中，所述核酸存在於表達載體或表達構建體中。在一些實施方案中，所述表達載體或構建體為包含啟動子的載體，所述啟動子有效地連接至目的核酸序列， 從而使得該目的核酸序列能夠在合適的細胞中在合適的條件下進行表達。表達載體或構建體可以包含前導序列、增強子、增強轉錄或翻譯的啟動子元件、轉錄終止序列、剪接序列、增強轉錄的內含子、IRES元件、標記基因、選擇序列、重組酶識別位點、同源臂、病毒序列、操縱基因(例如，原核操縱基因)等。在一些實施方案中，所述表達載體包含允許誘導型表達的元件，例如，有效地連接至真核啟動子的原核操縱基因。在一些實施方案中，在添加表達誘導物後，誘導了表達。在其他實施方案中，在去除表達抑制物後，誘導了表達。在一些實施方案中，通過溫度變化來誘導表達。在一些實施方案中，一個或多個重鏈核苷酸序列在同一個載體上。在一些實施方案中，此處的重鏈核酸序列和輕鏈核酸序列在同一個載體上。在一些實施方案中，兩個重鏈核酸序列和輕鏈核酸序列在同一個載體上。在一些實施方案中，所述核酸在包含一個或多個來自病毒的核酸的細胞中表達。 在特別的實施方案中，所述病毒選自腺病毒、腺伴隨病毒、SV-40、EB病毒、反轉錄病毒、慢病毒、杆狀病毒、冠狀病毒、單純皰疹病毒、脊髓灰質炎病毒、塞姆利基森林病毒、新培斯病毒和痘苗病毒。宿主細胞為可以被轉化以表達目的核酸的細胞。在各種實施方案中，轉化包括改變細胞的核酸內容，從而使得它包含外源核酸(例如，在自然界中未在所述細胞中發現的核酸，或者一個或多個額外拷貝的相應於在自然界中在所述細胞中發現的核酸序列的核酸)。可以通過本領域中已知的任何合適的方法來改變細胞的核酸內容，例如，通過將核酸整合到細胞的基因組中或者通過將它以染色體外或基因組外的形式置於細胞中。在一些實施方案中，可以改變細胞的核酸內容從而使得所述細胞瞬時地表達目的核酸，或者可以改變核酸內容從而使得所述細胞穩定地表達目的核酸。在一些實施方案中，當細胞分裂時，細胞的基因內容的改變得到遺傳。分離雙特異性抗原結合蛋白一旦基於此處的信息而選擇了合適的成組修飾，就嘗試通過使用本領域中已知的方法來分離雙特異性抗原結合蛋白。在每種情況下，僅應用公開的方法並不提供令人滿意的分開。
Lindhofer等人製備了具有異源二聚重鏈的雙特異性抗體(其中具有一條結合A蛋白的重鏈(小鼠IgG)和一條不結合A蛋白的重鏈(大鼠IgG))，並且用從中性至PH 5.8的pH階梯式梯度(以洗脫異源二聚體)，然後用從5. 8至3. 5的PHM 梯(以洗脫小鼠/小鼠同源二聚體)，成功地將大鼠/小鼠異源二聚雙特異性抗體與小鼠/小鼠和大鼠/大鼠二聚體的四源雜交瘤混合物相分開。(參見，Lindhofer等人， (1995)Preferential species-restricted heavy/light chainpairing in rat/mouse quadromas Implications for a single-steppurification of bispecific antibodies. J. Immunol. 155(1) :219-225)。當應用於將IgGl同源二聚體與具有兩條相同的但IgGl CH3結構域之一包含 H435R/Y436F 二肽修飾的IgGl重鏈的IgGl異源二聚體相分開時，Lindhofer方法不成功。 發明人發現，在線性PH梯度中，經二肽修飾的IgGl在大約pH 3. 9處洗脫，而IgGl同源二聚體在大約PH 3. 7處洗脫。該pH差異被認為不足以達到使用Lindhofer方法令人滿意地將異源二聚體與同源二聚體相分開。可預測地，該差異不是可重複的。在採用相對較大的離子強度(其由為了保持特定的PH階梯或梯度所需要的緩衝液強度所貢獻)的層析運行中觀察到層析行為的變化。但通過添加有機改性劑(ι-丙醇) 並未達到令人滿意的分開。然而，有些令人驚訝地，對於一些層析運行來說，添加0. 5M至 1. OM的離子改性劑(例如，NaCl)急劇地和出人意料地改善了同源二聚IgGl和異源二聚 IgGl的分開。離子改性劑的添加拓寬了用於洗脫的pH範圍(在具有離子改性劑時為1.2 個pH單位，但在沒有離子改性劑時為0. 2個pH單位)，從而使得pH階梯式梯度可以成功地分開所述兩個種類。但是，在其他的運行中，用僅大約150mM的NaCl濃度達到了令人滿意的分開(參見實施例4)。為了確保可以達到令人滿意的分開，在一個實施方案中，雙特異性抗原結合蛋白的分離在大約0. 5至大約1. OM的離子改性劑存在下進行。因此，在一個實施方案中，用於分離雙特異性抗原結合蛋白(其包含具有包含如在本文中所描述的修飾的一條鏈的異源二聚IgG)的方法包括在離子改性劑存在下採用pH 梯度的步驟。在一個實施方案中，所述離子改性劑以足以使IgG同源二聚體和如在本文中所描述的(即，具有CH3修飾的)IgG異源二聚體從A蛋白支持物上的洗脫之間的pH差異最大化的濃度存在。在一個特別的實施方案中，所述離子改性劑以大約0. 5至大約1. OM的濃度存在。在另一個特別的實施方案中，所述離子改性劑以大約0. 15至大約0. 5M的濃度存在。在一個實施方案中，所述離子改性劑為鹽。在一個實施方案中，所述離子改性劑為鹼金屬或鹼土金屬與滷素的鹽。在一個特別的實施方案中，所述鹽為鹼金屬或鹼土金屬的氯化物鹽，例如妝(1、1((1、1^(1、01(12、1%(12。在一個特別的實施方案中，所述鹽以大約 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9或1. 0的體積摩爾濃度存在。在一個實施方案中，所述pH梯度從大約pH 3.9至大約？!1 4. 5;在另一個實施方案中，從大約PH 4.0至大約pH 4.4 ；和在另一個實施方案中，從大約pH 4. 1至大約pH 4.3。在一個特別的實施方案中，所述梯度為線性梯度。在一個實施方案中，所述pH梯度為階梯式梯度。在一個實施方案中，所述方法包括給經平衡的A蛋白柱(例如，在PBS或另一種合適的緩衝液或液體中進行平衡)應用大約pH 3. 9，大約pH 4. 0，大約pH 4. 1，大約pH 4. 2，大約pH 4. 3，或大約pH 4. 4的階梯。在一個特別的實施方案中，所述階梯為大約PH 4.2。在一個實施方案中，包含異源二聚IgG CH3結構域的雙特異性抗體在一個或多個基本上沒有非異源二聚IgG的級分中從A蛋白支持物上洗脫。在一個特別的實施方案中， 洗脫出的雙特異性抗體級分包含少於總蛋白質的大約1重量％，0. 5重量％，或0. 1重量％ 的非異源二聚抗體。
實施例給出下列實施例以便給本領域普通技術人員描述如何製備和使用本發明的方法和組合物，但不意欲限制發明人認為是其發明的範圍。已作出了努力以確保關於所使用的數字(例如，量、溫度等)的準確度，但應當說明一些實驗誤差和偏差。除非另外指明，份是重量份，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，和壓力處於或接近大氣壓。實施例1 雙特異性IL-4Ra/IL-6Ra抗原結合蛋白發現兩個已知的人IgGl同種型抗體(一個針對IL_4Ra，和一個針對IL_6Ra)具有僅相差四個胺基酸的輕鏈。共表達實驗揭示了，抗_IL-4Ra抗體的輕鏈可以用來自IL-6Ra 的輕鏈替換並仍然保持對於IL_4Ra的高親和力結合，由此使得使用抗_IL-4Ra重鏈和抗-IL-6Ra重鏈以及相同的輕鏈來產生雙特異性抗體是可行的。因此，將IL-6Ra抗體的重鏈修飾為Fc AAdp形式(即CH3 二肽修飾H95R/Y96F，根據IMGT外顯子編號)。然後，將抗-IL-6I a輕鏈與抗_IL4I a/Fc重鏈和抗_IL6I a/Fc Δ Adp重鏈在CHO 細胞中共表達，並且使來自這些細胞的條件培養基經歷蛋白A層析。在用包含同源二聚體和異源二聚體的混合物的細胞上清液加載A蛋白柱後，用ρΗ階梯式梯度來進行洗脫，所述PH階梯式梯度通過改變兩種緩衝液(A :100mM檸檬酸鈉，150mM NaCl, pH6. 0 ； 和B :100mM檸檬酸鈉，150mM NaCl，ρΗ 3.0;參見，圖4)的組合以便產生分別在ρΗ 6.0、 ρΗ 4. 2和ρΗ 3.0處的三個相而產生。在圖4中，IL-4R表示抗-IL_4I a，和IL-6RΔ表示抗-IL-6Ra (IgGl AAdp)。就與IL_6Ra和IL_4Ra蛋白的結合來對所示的柱級分進行檢定 (參見，圖5)。進行階梯式洗脫，從而引起在ρΗ 4. 2處洗脫的一個峰，和在ρΗ 3.0處的第二個峰(圖4)。BIAC0RE 分析顯示，如所預期的，流過材料可以結合可溶性IL-6Ra，但不結合IL-4Ra(圖5)。相應於pH4. 2峰的級分可以結合大約相等量的IL_6Ra和IL_4Ra，這與異源二聚體相一致。在PH 3.0處洗脫的峰僅可以結合IL-4Ra，而不結合IL-6Ra，這相應於所預期的抗_IL-4Ra同源二聚體。這確立了，用簡單的ρΗ階梯式梯度，通過使用A蛋白層析可以有效地分離異源二聚雙特異性抗體。實施例2 =Fc Δ Adp蛋白的藥物代謝動力學為了測試Fc Δ Adp修飾是否影響包含異源二聚Fc/Fc Δ Adp的分子的藥物動力學， 給小鼠注射經純化的上面所描述的抗-IL-4Ra/抗-IL-6Ra的異源二聚種類，並且在28天的時間段內測量血清中人免疫球蛋白的濃度(圖6 ；表1)。所述異源二聚體的血清半壽期為大約10天，這與野生型的半壽期類似。這確立了，FcAAdp修飾對於血清半壽期沒有可檢測的影響。
權利要求
1.異源二聚雙特異性抗原結合蛋白，其包含a.第一多肽，其從N-末端至C-末端包含選擇性地結合第一表位的第一表位結合區、 包含第一 CH3區的免疫球蛋白恆定區，該第一 CH3區為選自IgGl、IgG2和IgG4的人IgG的 CH3區；禾口b.第二多肽，其從N-末端至C-末端包含選擇性地結合第二表位的第二表位結合區、 包含第二 CH3區的免疫球蛋白恆定區，該第二 CH3區為選自IgGl、IgG2和IgG4的人IgG的第二 CH3區，其中所述第二 CH3區包含減少或消除該第二 CH3結構域與A蛋白的結合的修飾。
2.權利要求1的雙特異性蛋白，其中所述第一多肽和所述第二多肽為人IgG重鏈。
3.權利要求1的雙特異性蛋白，其還包含免疫球蛋白輕鏈。
4.權利要求3的雙特異性蛋白，其中所述免疫球蛋白輕鏈為人免疫球蛋白輕鏈。
5.權利要求1的雙特異性蛋白，其中所述第一多肽和所述第二多肽中每一個為人IgGl重鏈。
6.權利要求1的雙特異性蛋白，其中所述修飾選自IMGT外顯子編號系統中的(a)95R， 和(b)95R和96F，或者EU編號系統中的(a，)435R，和(b，)435R和436F。
7.權利要求6的雙特異性蛋白，其還包含1至5個選自下列的修飾IMGT外顯子編號系統中的 16E、18M、44S、52N、57M和 821，或者 EU 編號系統中的!356E、358M、384S、392N、397M 和 4221。
8.權利要求6的雙特異性蛋白，其中所述雙特異性抗體的CH3結構域在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。
9.權利要求7的雙特異性蛋白，其中所述雙特異性抗體的CH3結構域在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。
10.製備雙特異性抗體的方法，其包括a.獲得核酸序列，其編碼包含識別第一表位的第一可變結構域的第一免疫球蛋白重鏈，其中所述第一免疫球蛋白重鏈包含IgGl、IgG2或IgG4同種型恆定結構域；b.獲得第二核酸序列，其編碼包含識別第二表位的第二可變結構域的第二免疫球蛋白重鏈，其中所述第二免疫球蛋白重鏈包含IgGl、IgG2或IgG4同種型恆定結構域，所述IgGl、 IgG2或IgG4同種型恆定結構域在其CH3結構域中包含根除或減少與A蛋白的結合的修飾；c.獲得第三核酸序列，其編碼與所述第一和第二免疫球蛋白重鏈配對的免疫球蛋白輕鏈；d.將所述第一、第二和第三核酸序列引入到哺乳動物細胞中；e.讓所述細胞表達雙特異性抗體；和f.基於該雙特異性抗體結合A蛋白的能力來分離所述雙特異性抗體。
11.權利要求10的方法，其中所述修飾選自IMGT外顯子編號系統中的(a)95R，和 (b)95R 和 96F，或者 EU 編號系統中的(a，)435R，和(b，)435R 和 436F。
12.權利要求11的方法，其還包括1至5個選自下列的修飾IMGT外顯子編號系統中的 16E、18M、44S、52N、57M 和 821，或者 EU 編號系統中的 356E、358M、384S、392N、397M 和 4221。
13.權利要求11的方法，其中所述雙特異性抗體的CH3結構域在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。
14.權利要求12的方法，其中所述雙特異性抗體的CH3結構域在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。
15.權利要求10的方法，其中在包含A蛋白的固體支持物上分離所述雙特異性抗體。
16.權利要求15的方法，其中所述固體支持物包括A蛋白親和柱，並且使用pH梯度來分離所述雙特異性抗體。
17.權利要求16的方法，其中所述pH梯度為包含一個或多個位於pH3和pH 5之間的 PH階梯的階梯式梯度。
18.分離雙特異性抗體的方法，其包括從破裂的細胞或抗體混合物中分離具有經差別修飾的IgGl、IgG2或IgG4 CH3結構域的雙特異性抗體，其中所述經差別修飾的CH3結構域在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的，並且其中所述修飾導致具有異源二聚重鏈恆定區的雙特異性抗體，所述異源二聚重鏈恆定區的單體具有對於A蛋白的差別親和力，並且所述雙特異性抗體基於其對於A 蛋白的親和力而從破裂的細胞或混合物中分離。
19.權利要求18的方法，其中所述異源二聚重鏈恆定區的一個單體為人IgGl，並且所述異源二聚重鏈恆定區的另一個單體為經修飾的人IgGl，該經修飾的人IgGl包含選自下列的修飾IMGT外顯子編號系統中的(a)H95R，和(b) H95R和Y96F，或者EU編號系統中的 (a，)H4!35R，和(b，)H4!35R 和 Y436F。
20.權利要求19的方法，其中所述經修飾的人IgGl還包含選自下列的修飾=IMGI^hI 子編號系統中的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I，或者EU編號系統中的D356E、L358M、 N384S、K392N、V397M 和 V422I。
全文摘要
提供了給予分離容易性的雙特異性抗體形式，其包含有在CH3結構域中經差別修飾的免疫球蛋白重鏈可變結構域，其中所述差別修飾就CH3修飾而言是非免疫原性的或基本上非免疫原性的，並且所述修飾中的至少一個導致所述雙特異性抗體對於親和試劑例如A蛋白的差別親和力，並且所述雙特異性抗體能夠基於其對於A蛋白的親和力而從破裂的細胞中、從培養基中或從抗體混合物中分離。
文檔編號C07K16/46GK102471378SQ201080032565
公開日2012年5月23日 申請日期2010年6月25日 優先權日2009年6月26日
發明者D·邁克多納德, E·史密斯, K·L·奧森, S·戴維斯 申請人:瑞澤恩製藥公司