一種鑑別連翹衍生品的方法
2023-04-30 23:59:56 2
一種鑑別連翹衍生品的方法
【專利摘要】本發明涉及一種鑑別連翹衍生品的方法，包括：1）取連翹衍生品直接作為含有活性成分組的連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物；2）對所述連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物進行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測，根據指紋圖譜得到特徵提取物中若干個活性成分特徵峰峰強度；並用相同方式測定出所述各活性成分相應標準參照品的特徵峰峰強度；3）通過定量分析手段得到所述標準參照品的絕對含量；4）利用所述特徵峰峰強度的比值和所述絕對含量，計算出連翹衍生品中各活性成分的含量及活性成分組的含量。本發明可以反映連翹衍生品中含有哪些木脂素類和苯乙醇苷類化合物以及它們之間的比例，達到對連翹衍生品質量鑑定的目的。
【專利說明】一種鑑別連翹衍生品的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於天然藥用植物的鑑別領域，具體地，涉及一種鑑別連翹衍生品的方法。【背景技術】
[0002]連翹是中國臨床常用傳統中藥之一，為木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物連翅(Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl)的乾燥果實,果實初熟尚帶綠色時採收稱為青翹，果實熟透顏色發黃時採收稱為老翹。連翹歸肺、心、小腸經，藥性微寒，味苦，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱的功效[國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部.中國醫藥科技出版社，159.]。其活性成分主要為木脂素類和苯乙醇苷類化合物，具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗氧化、降血酯、保肝等作用[王金梅，等.天然產物研究與開發2007，19:153.] ο
[0003]定性鑑別上述某類成分或定量測定其某種活性成分含量，已成為評價連翹衍生品質量的重要方法(例如中國藥典2010版是對連翹衍生品中木脂素類成分連翹苷和苯乙醇苷類成分連翹酯苷進行定性和定量分析)；這種針對單一成分進行定性、定量分析的質量檢測模式不能有效控制中藥提取物的內在質量，無法滿足當前對於客觀有效地評價和控制連翹及其製劑質量的迫切要求。
[0004]指紋圖譜是目前國際公認的控制中藥或天然藥物質量最有效的方式之一。人們憑藉實用的指紋圖譜不僅可確認該產品的真偽，同時能判斷其穩定性。目前，連翹衍生品的木脂素和苯乙醇苷類化合物的指紋圖譜研究工作，集中在HPLC指紋圖譜[①[國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部.中國醫藥科技出版社，381.②孫國祥，等.中成藥2007，29(2):161.]、毛細管電泳指紋圖譜(HPCE法)[孫國祥，等.色譜2006，24(2): 196.]、高效液相色譜-質譜聯用法(LC-MS) [Qu HH, et al.MICROCHEMICALJOURNAL, 2008;89(2):159]等。其中主流方法HPLC指紋圖譜由於受非色譜條件(如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等)影響較大和需用標準品等等原因，重複性和可行性均存在許多局限性；HPCE法雖以其高效、快速、簡便且柱不易受汙染而優於HPLC法，但仍存在重現性較差、線性範圍窄和靈敏度較低等不足；單一 LC-MS分析方法由於中藥複方的複雜性和缺乏標準品的現狀，MS還有離子化程度和基質幹擾等問題，通常不足以對多種成分進行準確的結構定性。
[0005]I⑶核磁共振碳譜偶聯(I⑶13C NMR coupling)指紋圖譜技術，也叫反門控去偶核磁共振碳譜偶聯指紋圖譜技術，該技術是在已研究多年的核磁共振氫譜(1H NMR)指紋圖譜技術[趙天增，等.1HNMR指紋法鑑定植物中藥，中草藥2000，31 (11) =868-870]的基礎上聯合其他技術(例如目前應用最廣泛的高效液相(HPLC)指紋圖譜技術[謝培山等，中藥色譜指紋圖譜，人民衛生出版社，2005])提出的一種新的非單一手段綜合指紋圖譜技術。目前為止，對於連翹衍生品及相關產品，並未見用I⑶核磁共振碳譜偶聯指紋圖譜技術進行鑑別的報導和技術內容的披露。
[0006]連翹衍生品的品質不在於某個單一成分，其療效是多個成分協同配比的結果。因此，建立不僅能控制連翹衍生品活性成分，而且能控制這些活性成分之比例的I⑶核磁共振碳譜偶聯指紋圖譜勢在必行。連翹衍生品核磁共振碳譜偶聯指紋圖譜的研究與應用，不僅可以解決我國連翹衍生品評價的難題，也為加強連翹衍生品內在成分研究的系統化與標準化，實現與國際接軌提供了科學的保證。隨著該技術在其他中藥提取物中的推廣應用，該技術的重大科學價值必將日趨突出。
【發明內容】
[0007]為了解決現有技術的問題，本發明的目的是提供一種鑑別連翹衍生品的方法。
[0008]為了實現上述目的，本發明提供的鑑別連翹衍生品的方法，包括以下步驟:
[0009]I)取連翹衍生品直接作為含有活性成分組(連翹木脂素和苯乙醇苷)的連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物；
[0010]2)對所述連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物進行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測，根據指紋圖譜得到連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中若干個活性成分特徵峰峰強度；並用相同方式(IGD核磁共振碳譜指紋圖譜)測定出所述各活性成分相應標準參照品的特徵峰峰強度；
[0011]3)通過定量分析手段得到所述標準參照品的絕對含量；
[0012]4)利用所述特徵峰峰強度(各活性成分特徵峰峰強度及相應標準參照品的特徵峰峰強度)的比值和所述標準參照品的絕對含量，計算出連翹衍生品中各活性成分的含量及該類活性成分的總含量，即活性成分組的含量。
[0013]其中，採用具有獲得清晰IGD核磁共振碳譜指紋圖譜的提取工藝作為所述連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物的提取方式。
[0014]其中，步驟2)中，對連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物進行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測，溶解連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物的溶劑為氘代甲醇(CD3OD)或氘代二甲基亞碸(DMS0-d6)，優選氘代二甲基亞碸；連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物和相應溶劑的質量體積比為55:1?65:1 (mg:mL),優選60:1。
[0015]其中，步驟2 )中，連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中，木脂素類活性成分的特徵峰為C-7吸收峰，其化學位移為δ c83.0?88.0。
[0016]優選地，選擇C-7'作為特徵峰進一步區別木脂素類活性成分中的連翹苷和表松脂素_4_ β -D-匍萄糖苷，它們的化學位移為δ c81.0?82.0。
[0017]連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中，苯乙醇苷類活性成分的特徵峰為C-9'吸收峰，其化學位移為δε165.0?170.0。
[0018]優選地，選擇C-1或C-6作為特徵峰進一步區別苯乙醇苷類活性成分中的連翹酯苷A和連翹酯苷H，它們的化學位移分別為δε119.0?120.0和δ。129.0?130.0。
[0019]其中，步驟2)中，根據特徵峰峰強度的大小和位置，對連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中若干個活性成分進行排序。
[0020]進一步地，步驟2)中，根據特徵峰峰強度的大小和位置，對連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中的活性成分:連翹苷、表松脂素_4-β -D-葡萄糖苷、松酯素-β -D-葡萄糖苷、連翹酯素、1-羥基-松脂素4" -O-葡萄糖苷、連翹酯苷Α、連翹酯苷H、連翹酯苷1、連翹酯苷F進行排序。[0021]其中，步驟2)中，所述峰強度可以採用峰高法、面積積分法或重量法計算。
[0022]其中，步驟3)中，所述定量分析手段為:高效液相(HPLC)法。
[0023]進一步地，當鑑別連翹木脂素類活性成分時，所述高效液相法的條件包括:
[0024]流動相為乙腈:水=(20~30): (70~80)，優選25:75 ;檢測波長為277nm。
[0025]進一步地，當鑑別苯乙醇苷類活性成分時，所述高效液相法的條件包括:
[0026]流動相為乙腈:冰醋酸溶液=(10~20): (80~90)，優選15:85 ;檢測波長為330nm。
[0027]其中，步驟3)中，所述標準參照品的絕對含量是指:用定量分析手段測定的標準參照品的質量百分含量。
[0028]進一步地，連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中，木脂素類活性成分和苯乙醇苷類活性成分的標準參照品為連翹苷或連翹酯苷A。
[0029]其中，步驟4)中，計算各活性成分的含量的偶聯公式為:
【權利要求】
1.一種鑑別連翹衍生品的方法，包括以下步驟: 1)取連翹衍生品直接作為含有活性成分組的連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物； 2)對所述連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物進行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測，根據指紋圖譜得到特徵提取物中若干個活性成分特徵峰峰強度；並用相同方式測定出所述各活性成分相應標準參照品的特徵峰峰強度； 3)通過定量分析手段得到所述標準參照品的絕對含量； 4)利用各活性成分特徵峰峰強度及相應標準參照品的特徵峰峰強度的比值和所述標準參照品的絕對含量，計算出連翹衍生品中各活性成分的含量及活性成分組的含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，採用具有獲得清晰IGD核磁共振碳譜指紋圖譜的提取工藝作為所述連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物的提取方式。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)中，對連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物進行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測，溶解連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物的溶劑為氘代二甲基亞碸或氘代甲醇。
4.根據權利要求1~3任意一項所述的方法，其特徵在於，步驟2)中，連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中，木脂素類活性成分的特徵峰為C-7吸收峰，其化學位移為δ c83.0~88.0 ;優選地，選擇C-7'作為特徵峰進一步區別木脂素類活性成分中的連翹苷和表松脂素-4-β -D-葡萄糖苷，它們的化學位移為δ c81.0~82.0 ; 連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中，苯乙醇苷類活性成分的特徵峰為C-9'吸收峰，其化學位移為δ c165.0~170.0 ;優選地，選擇C-1或C-6作為特徵峰進一步區別苯乙醇苷類活性成分中的連翹酯苷A和連翹酯苷H，它們的化學位移分別為δ c119.0~120.0和δ c129.0 ~130.0。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟2)中，根據特徵峰峰強度的大小和位置，對連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中若干個活性成分進行排序。
6.根據權利要求1~5任意一項所述的方法，其特徵在於，步驟3)中，所述定量分析手段為高效液相法。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，當鑑別連翹木脂素類活性成分時，所述高效液相法的條件包括流動相為乙腈:水=(20~30): (70~80)，優選25:75 ;檢測波長為277nm ； 當鑑別苯乙醇苷類活性成分時，所述高效液相法的條件包括流動相為乙腈:冰醋酸溶液=(10~20): (80~90)，優選15:85 ;檢測波長為330nm。
8.根據權利要求1~7任意一項所述的方法，其特徵在於，步驟3)中，所述標準參照品的絕對含量是指用定量分析手段測定的標準參照品的質量百分含量。
9.根據權利要求1~8任意一項所述的方法，其特徵在於，連翹木脂素和苯乙醇苷特徵提取物中的活性成分的標準參照品為連翹苷或連翹酯苷A。
10.根據權利要求1~9任意一項所述的方法，其特徵在於，步驟4)中，計算各活性成分的含量的偶聯公式為:
11.根據權利要求1~10任意一項所述的方法，其特徵在於，所述連翹衍生品包括:連翹提取物或連 翹天然藥物。
【文檔編號】G01N30/88GK103808749SQ201410044108
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月30日 優先權日:2013年1月30日
【發明者】董建軍, 張海豔, 趙天增, 郭唯, 李曉, 陳玲, 範毅, 常霞, 王建軍, 魏悅, 李倩 申請人:河南省科高植物天然產物開發工程技術有限公司