一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法
2023-05-01 02:17:16
一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，包括：步驟1）酵母目標突變體的獲得；步驟2）多重逆境篩選；步驟3）候選基因測序；步驟4）抗多重逆境檢驗。本發明根據異源功能互補、利用對各種逆境條件均敏感的酵母突變體，快速篩選出植物cDNA文庫中對多種逆境都具有抗性的抗逆基因。可在短時間內篩選出大量與植物多重逆境抗性相關的基因，且實驗成本低、操作程序簡單、穩定性好、效率高。
【專利說明】一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於遺傳工程領域，涉及一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，具體涉及一種根據異源功能互補、利用對各種逆境條件均敏感的酵母突變體，快速篩選出植物CDNA文庫中對多種逆境都具有抗性的抗逆基因的方法。
【背景技術】
[0002]近年來，由於環境變化加劇，對世界範圍內的作物生長帶來了巨大的影響。據統計，在世界範圍內，適於耕種的土地不足10%，大部分土地處於乾旱、高溫、低溫、鹽鹼、重金屬等逆境中。而且，因人口的不斷增長對糧食需求的壓力越來越大，迫切需要培育出能在各種非生物脅迫下生長的經濟作物。在植物抗逆性研究中，目的不僅在於從分子水平上解釋植物適應逆境的機制，而且更希望獲得各種抗逆基因，用於作物的抗逆育種。
[0003]目前，已獲得了許多與非生物脅迫抗性有關的基因，為植物抗逆性的生物工程提供了可靠的理論依據和實踐基礎。對植物抗逆性的分子機制研究表明，植物的抗逆性是由多基因控制的，而且植物生長在自然界中，往往處於多種逆境條件的共同脅迫下，多種非生物脅迫的同時出現對植物來說是最致命的，最有效應對的方法是找出調控逆境組合反應的基因。
[0004]目前，分離抗逆基因的方法很多，但或多或少都存在一些不足。如mRNA差異顯示方法，假陽性比例高；cDNA文庫的差示篩選，容易找到表達量高的基因，很難找到低拷貝數、低表達的基因；圖位克隆法，準確率高，但是代價昂貴，操作複雜。最主要的是，這些方法一般僅能得到與某種特定脅迫相關的若干基因，基因數量有限，並且只是針對那些遺傳背景和基因組信息齊全的植物。如果能夠快速篩選出非模式抗逆植物資源中的多重逆境抗性相關的大量基因，將具有非常重要的意義。
[0005]酵母作為研究高等真核生物的一種重要的模式生物，不僅在生物信息學方面發揮著重要的作用，其豐富的突變體在其他生物基因克隆和功能驗證等方面也發揮著重要的作用。多重逆境單細胞篩選酵母異源互補方法是利用對各種逆境組合敏感的酵母突變體，來建立異源功能互補篩選平臺，篩選植物體內控制逆境組合的新基因，將在植物抗逆基因的篩選中發揮重要作用，為高等真核生物的基因克隆提供了一種捷徑。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題在於提供一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，以克服現有技術的不足，快速篩選出抗11202、211(:12』(1(:12、似(:1及耐高溫、耐低溫的植物多重逆境抗性基因，該方法具有成本低、操作程序簡單、篩選效率高、穩定性好等優點。
[0007]為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案來實現。
[0008]一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步驟:
[0009]步驟I)酵母目標突變體的獲得[0010]將酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突變體庫的各種突變體,接種於YPD液體培養基中，30°C過夜培養，轉入新鮮YPD液體培養基，至分裂2代。收集處於對數生長期的細胞(OD6tltl=0.4~0.6)，10倍梯度稀釋5次，分別置於含0.5-2.0mmol/L H2O2,20-80mmol/L ZnCl2,50-250mmol/L CdCl2、150-350mmol/L NaCl 的 YPD 固體培養基中培養，及分別在高溫37°C、低溫15°C、正常條件(30°C)下置於YPD固體培養基中培養；從中篩選出對上述逆境條件均敏感的酵母菌株突變體AHogl,作為文庫篩選的宿主菌株。
[0011]步驟2)多重逆境篩選
[0012]用植物cDNA文庫轉化步驟I)中篩選出的突變體菌株AHogl得到酵母轉化子，並培養於含0.25-1.0mmol/L H2O2的營養缺陷型SD培養基上。挑取生長出的單克隆，培養於含
0.25-1.0mmol/L H2O2的營養缺陷型SD培養基上。將生長狀態良好的酵母轉化子分別培養於含 0.25-1.0mmol/L H202、5-15mmol/L ZnCl2,20-100mmol/L CdCl2、100-350mmol/L NaCl的營養缺陷型SD固體培養基上，及分別在高溫37°C、低溫15°C、正常條件(30°C)下置於營養缺陷型SD固體培養基中培養。
[0013]步驟3)候選基因測序
[0014]提取步驟2)中在上述各種逆境條件下都生長良好的酵母轉化子質粒，進行測序，所得植物基因進行抗多重逆性檢驗。
[0015]步驟4)抗多重逆性檢驗
[0016]選取缺失步驟3)中所得植物基因的植物突變體，與植物野生型同時培養於分別含有 1.0-15mmol/L H202、100_450umol/L ZnCl2、50-350mmol/L CdCl2、50-300mmol/L NaCl、的MS固體培養基，及在高溫37°C、低溫15°C、正常條件22°C下置於MS固體培養基。如果該植物突變體的生長狀態差於植物野生型，則步驟3)測序得到的基因即為該植物的多重逆境抗性基因。
[0017]進一步，所述植物為擬南芥，但不局限與該植物，水稻、二穗短柄草、小麥、大豆、楊樹等多種植物均可適用於該方法，從而篩選出這些植物中與多重逆境抗性相關的基因。
[0018]所述擬南芥中多重逆境抗性基因為富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。
[0019]所述植物的多重逆境抗性基因是指植物中與抗H2O2、ZnCl2、CdCl2、NaCl及抗高溫、低溫環境相關的基因。
[0020]優選地，步驟I)中，YPD固體培養基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl濃度分別為1.0-2.0mmol/L、30_60mmol/L、100-250mmol/L、200-350mmol/L。
[0021]更優選地，步驟I)中，YPD固體培養基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl濃度分別為 1.5mmol/L、50mmol/L、200mmol/L、300mmol/Lo
[0022]步驟2)中所述營養缺陷型SD培養基的缺失營養成分為亮氨酸。
[0023]優選地，步驟2)中，所述營養缺陷型SD培養基所加入H2O2濃度為0.5mmol/L,所述營養缺陷型SD固體培養基加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl濃度分別為0.25-0.75mmol/L、7.5-15mmol/L、40-lOOmmol/L、150-300mmol/L。
[0024]更優選地，步驟2)中，所述營養缺陷型SD固體培養基加入的H202、ZnCl2, CdCl2,NaCl 濃度分別為 0.5mmol/L、10mmol/L、60mmol/L、200mmol/L。
[0025]優選地，步驟4)中，所述MS固體培養基中加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl的濃度分別為 2.0-10mmol/L、200-400umol/L、100-300mmol/L、100-300mmol/L。[0026]更優選地，步驟4)中，所述MS固體培養基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl的濃度分別為 H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl 的濃度分別為 7.5mmol/L、350umol/L、250mmol/L、200mmol/
L0
[0027]本發明所用的YPD液體培養基、YPD固體培養基、SD液體培養基、SD固體培養基、MS固體培養基均為市售常規產品。
[0028]本發明所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法從多種酵母突變體中篩選出對各種逆境條件(抗H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl及抗高溫、低溫環境)均敏感的酵母突變體AHogl,將該酵母突變體作為宿主菌株，並根據異源功能互補，快速篩選出植物cDNA文庫中對多種逆境都具有抗性的抗逆基因，具體的篩選流程圖參見圖1。本發明以擬南芥為例，將擬南芥cDNA文庫轉化酵母突變體△ Hogl得到酵母轉化子，並將酵母轉化子進行多重逆境抗性檢測，研究發現轉化了擬南芥基因I的酵母轉化子對所述各種逆境處理均表現出抗性，對該基因I進行測序，通過比對，確認該基因I為擬南芥中富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620，從而快速篩選出擬南芥中抗H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl及抗高溫、低溫條件的多重逆境抗性基因為富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。
[0029]本發明的有益效果如下:
[0030]1.本發明利用的是單細胞系統-酵母，酵母菌為真核生物，與植物表達系統更為接近，也具有糖基化、二硫鍵形成以及蛋白質摺疊翻譯後加工等過程，從而使得篩選出的植物基因所編碼的蛋白功能正常發揮，多重逆境抗性基因假陽性的概率大大降低。
[0031]2.本發明可在短時間內篩選出大量與植物多重逆境抗性相關的基因，且實驗成本低、操作程序簡單、穩定性好、效率高 。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為本發明利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的篩選流程圖；
[0033]圖2為本發明實施例1酵母野生型和各種突變體在不同逆境條件下的生長情況圖，突變體1:AStel，突變體2:ABckl，突變體3:APbs2，突變體4:AMkkl，突變體5:△ Hogl，突變體 6:ASLT2，突變體 7: AMsn2 ；
[0034]圖3為本發明實施例1中擬南芥cDNA文庫轉化酵母突變體Λ Hogl後在含H2O2的營養缺陷SD培養基上的生長情況圖；
[0035]圖4為本發明實施例1中已經轉化了基因I的酵母轉化子在多重逆境條件下的生長情況圖；
[0036]圖5為本發明實施例1中富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620發生突變的擬南芥突變體在多重逆境條件下的生長情況圖。
【具體實施方式】
[0037]以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案，但所述實施例不限制本發明的保護範圍。應當說明的是，以下實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍中。[0038]如無特殊說明，本發明所述各實驗材料及生物用品均為市售常規產品，所用生物學手段均為本領域技術人員常用方法實施。
[0039]實施例1
[0040]1、多重逆境敏感性酵母菌株的獲得
[0041]將酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突變體庫中各種菌株接種於YPD液體培養基中，30°C過夜培養，轉入新鮮YPD培養基，至分裂2代。收集處於對數生長期的細胞(OD6tltl=0.4-0.6)，10倍梯度稀釋後，共梯度稀釋5次，置於分別含有1.5mmol/LH202、50mmol/L ZnCl2,200mmol/L CdCl2,300mmol/L NaCl 的 YPD 固體培養基，培養條件為 30°C、培養48h，並同時，在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置於將不含上述成分的YPD固體培養基培養，培養48h。
[0042]觀察酵母野生型和各種酵母突變體在不同逆境條件下的生長情況，篩選出對上述6種逆境條件均敏感的酵母突變體，各酵母突變體的生長情況以以下7種酵母突變體為例(突變體1: Λ Stel，突變2: Λ Bckl，突變體3: Λ Pbs2，突變體4: Λ Mkkl，突變體5: AHogl,突變體6:ASLT2，突變體7:AMsn2)，具體結果參看圖2。其中，其他的酵母突變體的生長情況均與圖2中突變體1-4及突變體6-7的生長情況類似，在此不再一一羅列。
[0043]從圖2可以看出突變體5即突變體AHogl對各種逆境條件均敏感，適合作為文庫篩選的宿主菌株。
[0044]2、擬南芥cDNA文庫轉化酵母突變體
[0045]2.1取適量過夜培養於YPD液體培養基的突變體Λ Hogl菌液，接種於300ml新鮮的YPD培養基，至OD600=0.2~0.3，30°C恆溫，250rpm振蕩培養至OD600=0.4~0.6。
[0046]2.2室溫離心5000rpm、5m`in，棄上清，加入25_50ml無菌水重懸洗滌酵母沉澱細胞，離心棄上清，重複洗滌一次，沉澱用1.5ml TE/LiAc重懸酵母細胞。
[0047]2.3取Iml用1.5ml TE/LiAc重懸的酵母感受態細胞，加入以下成分:cDNA文庫質粒lOOug，和10mg/ml的鮭魚精DNA200ul，振蕩混勻。
[0048]2.4 加入 6ml PEG/LiAc，劇烈振蕩，30°C恆溫，200rpm 振蕩培養 30min。
[0049]2.5加入700ul DMSO,緩緩倒置混勻(不能振蕩)，42°C水浴熱休克5min，迅速插入冰浴冷卻l-2min。
[0050]2.6室溫離心2500rpm、5min,儘量棄盡上清，以IOml無菌水重懸沉澱細胞,塗布於含0.5mmol/L H2O2的營養缺陷型SD培養基(不含亮氨酸)上，30°C倒置培養3_5天。結果參看圖3，從圖3可以看出平板上長出單克隆數量多，菌落密度大，說明轉化效率高，滿足植物cDNA文庫篩選要求。
[0051]挑取生長出的單克隆，培養於含0.5mmol/L H2O2的營養缺陷型SD培養基(不含亮氨酸)上。
[0052]3、利用多重逆境檢驗所得到的轉化子的抗逆性
[0053]將上述所得到的酵母轉化子和已經轉化了空載體pGADGH的空載體酵母轉化子，接種於營養缺陷型SD液體培養基(不含亮氨酸)中，30°C過夜培養，轉入新鮮營養缺陷型液體SD培養基(不含亮氨酸)，至分裂2代，收集處於對數生長期的細胞(0D_=0.4~0.6)，10倍梯度 3 次，置於含0.Smmol /T, H2O2、10mmol /T, ZnCl2、60mmol/L CdCl2、200mmol/LNaCl 的營養缺陷型SD固體培養基(不含亮氨酸)中，培養條件為30°C、培養48h，並同時在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C )下置於將不含上述成分的SD固體培養基中培養,培養48h。每個轉入文庫質粒的酵母轉化子做3個重複，其中轉化了基因I的酵母轉化子對上述各種逆境處理均表現出抗性，已經轉化了基因I的酵母轉化子在多重逆境條件下的生長情況如圖4所示。
[0054]4、對在多重逆境條件有抗性的質粒，進行測序
[0055]提取上述步驟3中在各種逆境條件下都生長良好的含基因I的酵母轉化子質粒，進行測序，測序結果如SEQ ID N0:1所示，具體如下:
[0056]TTTCTTTTCGGTGATGAGAACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGCTCAACCAAACCCACTAAATATCTACATTACCAAAAATGTTCACAAAATCTATCCTTTTGGCTTCTCTTCTTATCATCATCCTCGTCTCTGCAACTGAATCAGCTCGTCAAAAGAGCGGGAACGATGGTTTAGGATTCGGTGGTGTACCCGGATCCGGATTTATACCCGGGTTTGGAAACGGGTTTCCGGGGACTGGAGTTGGTGGTGGATACGGTGGAGGGTTTGGTGGTCCTAGCGGAGGGTTTGGGAAAGGAGGTGTGGTGAGACCAACGGTTACTTGCAAAGAGAAAGGACCTTGTAACGGCAAGAAGCTTAGGTGTCCTGCTAAGTGTTTCAAATCTTTTAGCCGCTCCGGGAAAGGATACGGCGGTGGAGGTGGCGGTGGAGGATGTACTATGGATTGTAAGAAGAAGTGTATCGCTTATTGTTAAGATATAATAAAGATCACATCATCTTTATAATATATAGTCATTATGATGGTTATGTATTTTCTATGTTATAGCCTATAGATTATGAGATCATGAGGATCCTTTTGTCTTGATTCGATTTGTAGCAGTTTTATATGCATAATATATGGTTGTGATGAATAAATGAGGGAACTTTACTGTTTTCTCTATTGTATGTTTGTGTAAGAGATTCTAAGTTAATTGTGATTTGATCTGTTTTATGCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGATCTATGAATCGTAGATACTGAAAAACCCCGCAAGTTCACTTCAACTGTGCATCGTGCACCATCTCAATTTCTTTCATTTATACATCGTTTTGCCTTCTTTTATGTAACTATACTCCTCTAAGTTTCAATCTTGGCCATGTAACCTCTGATC [0057]經比對(網址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得知該基因 I 為富含甘氨酸蛋白基因(AT4G21620)。
[0058]5、利用多重逆境檢驗富含甘氨酸蛋白基因的抗逆性。
[0059]根據測序結果，選取富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620發生突變的擬南芥突變體(即不再編碼出富含甘氨酸蛋白的擬南芥植株)。將擬南芥野生型(品種哥倫比亞)和突變體種子用75%酒精消毒lmin，無菌水洗3次，再用5%漂白粉消毒15min，播種於MS固體培養基。14天後，選取生長正常的植株，轉移至分別含7.5mmol/L H202、350umol/L ZnCl2,250mmol/L CdCl2,200mmol/L NaCl的MS固體培養基(培養條件為22°C、培養7天)及在高溫37°C、低溫15 °C、正常溫度22 °C條件下置於MS固體培養基培養(培養7天)，生長情況如圖5所示。從圖5可知，該基因發生突變的擬南芥突變體，在H202、NaCl、CdCl2、ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C等逆境條件下，相對於野生型，均表現出敏感，即擬南芥野生型有基因AT4G21620的正常功能，生長良好，擬南芥突變體喪失該基因功能，生長狀態較差。
[0060]綜上所述，說明富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620可提高擬南芥在!1202、NaCl,CdCl2, ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C的逆境條件下的抗逆性，在擬南芥多重逆境抗性方面具有重要作用。
[0061]實施例2
[0062]1、多重逆境敏感性酵母菌株的獲得
[0063]將酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突變體庫中各種菌株接種於YPD液體培養基中，30°C過夜培養，轉入新鮮YPD培養基，至分裂2代。收集處於對數生長期的細胞(OD6tltl=0.4-0.6)，10倍梯度稀釋5次，置於分別含有0.5mmol/L H202、20mmol/LZnCl2,50mmol/L CdCl2、150mmol/L NaCl 的 YPD 固體培養基，培養條件為 30°C、培養 48h，並同時，在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置於將不含上述成分的YPD固體培養基培養，培養48h。
[0064]觀察酵母野生型和各種酵母突變體在不同逆境條件下的生長情況，篩選出對上述6種逆境條件均敏感的酵母突變體，可以看出突變體AHogl對各種逆境條件均敏感，適合作為文庫篩選的宿主菌株。
[0065]2、擬南芥cDNA文庫轉化酵母突變體
[0066]2.1取適量過夜培養於YPD液體培養基的突變體Λ Hogl菌液，接種於300ml新鮮的YPD培養基，至OD600=0.2~0.3，30°C恆溫，250rpm振蕩培養至OD600=0.4~0.6。
[0067]2.2室溫離心5000rpm、5min，棄上清，加入25_50ml無菌水重懸洗滌酵母沉澱細胞，離心棄上清，重複洗滌一次，沉澱用1.5ml TE/LiAc重懸酵母細胞。
[0068]2.3取Iml用1.5ml TE/LiAc重懸的酵母感受態細胞，加入以下成分:cDNA文庫質粒lOOug，和10mg/ml的鮭魚精DNA200ul，振蕩混勻。
[0069]2.4 加入 6ml PEG/LiAc,劇烈振蕩，30°C恆溫，200rpm 振蕩培養 30min。
[0070]2.5加入700ul DMSO,緩緩倒置混勻(不能振蕩)，42°C水浴熱休克5min，迅速插入冰浴冷卻l-2min。
[0071]2.6室溫離心2500rpm、5min,儘量棄盡上清，以IOml無菌水重懸沉澱細胞,塗布於含0.5mmol/L H2O2的營養缺陷型SD培養基(不含亮氨酸)上，30°C倒置培養3_5天。從生長結果看出平板上長出單克隆數量多，菌落密度大，說明轉化效率高，滿足植物cDNA文庫篩選要求。
[0072]挑取生長出的單克隆，培養於含0.5mmol/L H2O2的營養缺陷型SD培養基(不含亮氨酸)上。
[0073]3、利用多重逆境檢驗所得到的轉化子的抗逆性
[0074]將上述所得到的酵母轉化子和已經轉化了空載體pGADGH的空載體酵母轉化子，接種於營養缺陷型SD液體培養基(不含亮氨酸)中，30°C過夜培養，轉入新鮮營養缺陷型SD液體培養基(不含亮氨酸)，至分裂2代，收集處於對數生長期的細胞(0D_=0.4~0.6)，10倍梯度稀釋 3 次，置於含 0.25mmol/L H2O2,5.0mmol/L ZnCl2,20mmol/L CdCl2'100mmol/LNaCl的營養缺陷型SD固體培養基(不含亮氨酸)中，培養條件為30°C、培養48h，並同時在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置於將不含上述成分的SD固體培養基中培養，培養48h。每個轉入文庫質粒的酵母轉化子做3個重複，其中轉化了基因I的酵母轉化子對上述各種逆境處理均表現出抗性。
[0075]4、對在多重逆境條件有抗性的質粒，進行測序
[0076]提取上述步驟3中在各種逆境條件下都生長良好的含基因I的酵母轉化子質粒，進行測序，測序結果如SEQ ID NO:1所示。
[0077]經比對(網址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得知該基因 I 為富含甘氨酸蛋白基因(AT4G21620)。
[0078]5、利用多重逆境檢驗富含甘氨酸蛋白基因的抗逆性。[0079]根據測序結果，選取富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620發生突變的擬南芥突變體(即不再編碼出富含甘氨酸蛋白的擬南芥植株)。將擬南芥野生型品種哥倫比亞和突變體種子用75%酒精消毒lmin，無菌水洗3次，再用5%漂白粉消毒15min，播種於MS固體培養基。14天後,選取生長正常的植株,轉移至分別含1.0mmol/L H202> 100umol/L ZnCl2、50mmol/LCdCl2,50mmol/L NaCl的MS固體培養基(培養條件為22°C、培養7天)及在高溫37°C、低溫15°C、正常溫度22°C條件下置於MS固體培養基培養(培養7天)。從其生長情況可知，該基因發生突變的擬南芥突變體，在H202、NaCl, CdCl2, ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C等逆境條件下，相對於野生型，均表現出敏感，即野生型有基因AT4G21620的正常功能，生長良好，突變體喪失該基因功能，生長狀態較差。
[0080]綜上所述，說明富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620可提高擬南芥在!1202、NaCl,CdCl2, ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C的逆境條件下的抗逆性，在擬南芥多重逆境抗性方面具有重要作用。
[0081]實施例3
[0082]1、多重逆境敏感性酵母菌株的獲得
[0083]將酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突變體庫中各種菌株接種於YPD液體培養基中，30°C過夜培養，轉入新鮮YPD培養基，至分裂2代。收集處於對數生長期的細胞(0D600=0.4-0.6)，10倍梯度稀釋5次，置於分別含有2.0mmol/L H202、80mmol/LZnCl2,250mmol/L CdCl2,350mmol/L NaCl 的 YPD 固體培養基，培養條件為 30°C、培養 48h，並同時，在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置於將不含上述成分的YPD固體培養基培養，培養48h。
[0084]觀察酵母野生型和各種酵母突變體在不同逆境條件下的生長情況，篩選出對上述6種逆境條件均敏感的酵母突變體，可以看出突變體AHogl對各種逆境條件均敏感，適合作為文庫篩選的宿主菌株。
`[0085]2、擬南芥cDNA文庫轉化酵母突變體
[0086]2.1取適量過夜培養於YPD液體培養基的突變體Λ Hogl菌液，接種於300ml新鮮的YPD培養基，至OD600=0.2~0.3，30°C恆溫，250rpm振蕩培養至OD600=0.4~0.6。
[0087]2.2室溫離心5000rpm、5min，棄上清，加入25_50ml無菌水重懸洗滌酵母沉澱細胞，離心棄上清，重複洗滌一次，沉澱用1.5ml TE/LiAc重懸酵母細胞。
[0088]2.3取Iml用1.5ml TE/LiAc重懸的酵母感受態細胞，加入以下成分:cDNA文庫質粒lOOug，和10mg/ml的鮭魚精DNA200ul，振蕩混勻。
[0089]2.4 加入 6ml PEG/LiAc,劇烈振蕩，30°C恆溫，200rpm 振蕩培養 30min。
[0090]2.5加入700ul DMSO,緩緩倒置混勻(不能振蕩)，42°C水浴熱休克5min，迅速插入冰浴冷卻l-2min。
[0091]2.6室溫離心2500rpm、5min,儘量棄盡上清，以IOml無菌水重懸沉澱細胞,塗布於含0.5mmol/L H2O2的營養缺陷型SD培養基(不含亮氨酸)上，30°C倒置培養3_5天。從生長結果可以看出平板上長出單克隆數量多，菌落密度大，說明轉化效率高，滿足植物cDNA文庫篩選要求。
[0092]挑取生長出的單克隆，培養於含0.5mmol/L H2O2的營養缺陷型SD培養基(不含亮氨酸)上。[0093]3、利用多重逆境檢驗所得到的轉化子的抗逆性[0094]將上述所得到的酵母轉化子和已經轉化了空載體pGADGH的空載體酵母轉化子，接種於營養缺陷型SD液體培養基(不含亮氨酸)中，30°C過夜培養，轉入新鮮營養缺陷型SD液體培養基(不含亮氨酸)，至分裂2代，收集處於對數生長期的細胞(0D_=0.4~0.6)，10 倍梯度稀釋 3 次，置於含 1.0mmol/L H202、15mmol/L ZnCl2、100mmol/L CdCl2,350mmol/LNaCl的營養缺陷型SD固體培養基(不含亮氨酸)中，培養條件為30°C、培養48h，並同時在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置於將不含上述成分的SD固體培養基中培養，培養48h。每個轉入文庫質粒的酵母轉化子做3個重複，其中轉化了基因I的酵母轉化子對上述各種逆境處理均表現出抗性。
[0095]4、對在多重逆境條件有抗性的質粒，進行測序
[0096]提取上述步驟3中在各種逆境條件下都生長良好的含基因I的酵母轉化子質粒，進行測序，測序結果如SEQ ID NO:1所示。
[0097]經比對(網址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得知該基因 I 為富含甘氨酸蛋白基因(AT4G21620)。
[0098]5、利用多重逆境檢驗富含甘氨酸蛋白基因的抗逆性。
[0099]根據測序結果，選取富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620發生突變的擬南芥突變體(即不再編碼出富含甘氨酸蛋白的擬南芥植株)。將擬南芥野生型品種哥倫比亞和突變體種子用75%酒精消毒lmin，無菌水洗3次，再用5%漂白粉消毒15min，播種於MS固體培養基。14天後,選取生長正常的植株,轉移至分別含15mmol/L H202、450umol/L ZnCl2、350mmol/LCdCl2,300mmol/L NaCl的MS固體培養基(培養條件為22°C、培養7天)及在高溫37°C、低溫15°C、正常溫度22 °C條件下置於MS固體培養基培養(培養7天)。從其生長情況可知，該基因發生突變的擬南芥突變體，在11202、似(:1、0(1(:12、211(:12、高溫371:、低溫15°C等逆境條件下，相對於擬南芥野生型，均表現出敏感，即擬南芥野生型有基因AT4G21620的正常功能，生長良好，突變體喪失該基因功能，生長狀態較差。
[0100]綜上所述，說明富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620可提高擬南芥在!1202、NaCl,CdCl2, ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C的逆境條件下的抗逆性，在擬南芥多重逆境抗性方面具
有重要作用。
【權利要求】
1.一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步驟: 步驟1)酵母目標突變體的獲得 將酵母野生型和各種酵母突變體，接種於Yro液體培養基中，30°c過夜培養，轉入新鮮YPD液體培養基，至分裂2代。收集處於對數生長期的細胞(0D_=0.4~0.6)，10倍梯度稀釋 5 次，分別置於含 0.5-2.0mmoI/L H202、20-80mmol/L ZnCl2、50-250mmol/LCdCl2、150-350mmol/L NaCl的YPD固體培養基中培養，及分別在37°C、15°C、30°C條件下置於YPD固體培養基中培養；從中篩選出對上述逆境條件均敏感的酵母菌株突變體AHogl，作為文庫篩選的宿主菌株； 步驟2)多重逆境篩選 用植物cDNA文庫轉化步驟I)中篩選出的突變體菌株AHogl得到酵母轉化子，並培養於含0.25-1.0mmoI/L H2O2的營養缺陷型SD培養基上；挑取生長出的單克隆，培養於含0.25-1.0mmoI/L H2O2的營養缺陷型SD培養基上；將生長狀態良好的酵母轉化子分別培養於含 0.25-1.0mmol/L H202、5-15mmol/L ZnCl2,20-100mmol/L CdCl2、100-350mmol/L NaCl的營養缺陷型SD固體培養基上，及分別在37°C、15°C、30°C條件下置於營養缺陷型SD固體培養基中培養； 步驟3)候選基因測序 提取步驟2)中在上述各種逆境條件下都生長良好的酵母轉化子質粒，進行測序，所得植物基因進行抗多重逆性檢驗； 步驟4)抗多重逆性檢驗 選取缺失步驟3)中所得多重逆境抗性基因的植物突變體，與植物野生型同時培養於含1.0-15mmol/L H202、100_450umol/L ZnCl2、50-350mmol/L CdCl2、50-300mmol/L NaClJAMS固體培養基及在37°C、15°C、22°C條件下置於MS固體培養基；如果該植物突變體的生長狀態差於植物野生型，則步驟3)測序得到的植物基因即為該植物的多重逆境抗性基因。
2.根據權利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特徵在於，所述植物為擬南芥。
3.根據權利要求2所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特徵在於，所述擬南芥中多重逆境抗性基因為富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。
4.根據權利要求1或3所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特徵在於，所述多重逆境抗性基因是指植物中與抗H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl及抗高溫、低溫環境相關的基因。
5.根據權利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特徵在於，步驟I)中，YPD固體培養基中加入的H2O2、ZnCl2、CdCl2、NaCl濃度分別為1.0-1.5mmol/L、30_60mmol/L、100-250mmol/L、200-350mmol/L。
6.根據權利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特徵在於，步驟2)中所述營養缺陷型SD培養基的缺失營養成分為亮氨酸。
7.根據權利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特徵在於，步驟2)中，所述營養缺陷型SD固體培養基加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl濃度分別為0.25-0.75mmol/L、7.5-15mmol/L、40_lOOmmol/L、15Q-300mmol/L。
8.根據權利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特徵在於，步驟4)中，所述MS固體培養基中加入的H202、ZnCl2.CdCl2.NaCl的濃度分別為2.0-10mmol/L、200-400umol/L、100_300mmol/L、100_300mmol/L。
【文檔編號】C12N15/81GK103509876SQ201310509029
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】儲昭慶, 李鵬 申請人:上海辰山植物園