用於生產腺伴隨病毒的細胞系的製作方法

2023-05-01 02:33:36 1

用於生產腺伴隨病毒的細胞系的製作方法
【專利摘要】本發明涉及在無動物組分的懸浮條件下生長的HEK293細胞系。該細胞系對於腺伴隨病毒（AAV）的快速和可擴大生產是理想的，並且支持所有AAV的血清型和嵌合體的生產。PTA-1327420121023
【專利說明】用於生產腺伴隨病毒的細胞系
[0001] 相關申請 本申請要求於2011年10月28日提交的美國臨時申請號61/552, 492的權益。本申請 的完整內容全部通過引用併入本文。 發明領域
[0002] 本發明涉及在無動物組分的懸浮條件下生長的HEK293細胞系。該細胞系對於腺 伴隨病毒（AAV)的快速和可擴大生產是理想的，並且支持所有AAV血清型和嵌合體的生產。
[0003] 發明背景 重組腺伴隨病毒（rAAV)載體已證實在體內具有很少毒性和炎症至無毒性和炎症的轉 導和長期基因表達。AAV的這些獨特特徵已導致其公認為用於基因治療應用的主導載體候 選物。許多利用AAV的I期和II期臨床試驗已在全世界執行（Aucoin等人，SiotecAfloi A/k !:73 (2008) ;Mueller 等人，25:858 (2008))。然而，許多臨床前研宄 和成功的臨床試驗已證實仍需要解決以支持rAAV的人基因治療使用的許多挑戰（Mueller 等人，7A858 (2008))。一個主要挑戰是依照現代優良生產實踐（cGMP)建立 大規模製造技術，以獲得擴展的臨床需要所需的純化載體數量。生成可擴大生產技術的成 功在很大程度上依賴理解AAV關於生成試劑的基礎生物學，例如細胞系、質粒或重組病毒 載體等，當一起使用時，其將密切模擬野生型AAV生產。
[0004] AAV已分類為細小病毒科中的依賴病毒屬，因為它需要與輔助病毒例如腺病 毒（Ad)或單純皰瘮病毒（HSV) -起共感染用於細胞培養中的生產性感染（productive infection) (Atchison 等人，5bi<9/7c〇7.4402(1980);51^￥&8七&￥&等人，7；1^>〇7.必 _:555(1983))。1丁1?是基因 組複製和包裝到衣殼內所需的唯一順式作用元件。四種複製蛋白質（Rep 78、68、52和40) 是多功能的，並且在受感染細胞的核內的轉錄、病毒DNA複製和DNA包裝到預形成的病毒衣 殼內起作用（Chejanovsky 等人，120 (1989) ;King 等人，%: 3282 (2001))。病毒衣殼由分別以1:1:8比的三種蛋白質Vpl、Vp2和Vp3構成。衣殼蛋白質由 相同可讀框（0RF)產生，但利用不同的翻譯起始位點。
[0005] 因為ITR是基因組複製和包裝所需的唯一順式作用元件，所以rep和cap基因可 被移出且克隆到單獨的質粒內，而無功能中的喪失。啟動子和由啟動子驅動的目的基因隨 後可克隆在ITR之間。因此，側翼為ITR的任何基因可有效包裝到AAV衣殼內，只要基因組 大小小於5.0kb(Dong等人，#〇乂 Tier.iASTUOlOXGrieger等人，J Z9:9933 (2005);Wu等人，#〇乂?er. 7及80(2010))。然而，AAV仍缺乏複製的能力。AAV的鮮明 特點之一是需要與輔助病毒例如Ad或HSV -起共感染。rAAV的生成習慣於需要載體和包 裝構建體轉染到受Ad感染的細胞內（Muzyczka，Ci/rr. Tb/7.始'croAio/.Immunol. 158\97 (1992))。在與Ad或HSV -起共感染後，AAV利用幾種輔助病毒早期基因以促進其自身復 制。Ad感染到生產細胞內以生成rAAV在生產rAAV中是有效的，但後果是它還產生過於充 足的Ad顆粒。Ad的完全去除已依賴物理技術例如CsCl梯度、柱層析和熱變性步驟，以滅活 可能仍存在的任何殘留Ad顆粒。雖然這些操作中的大多數已在不同程度上成功，但Ad汙 染的可能性是不必要的風險，並且Ad變性蛋白質的存在對於臨床使用是不能接受的。rAAV 生產發展中的顯著改進是三重質粒轉染（triple plasmid transfection)的引入（Xiao等 人，7； KirW. 72 2224 (1998))。該方法使用r印和cap質粒以及ITR質粒的變化，但消 除Ad感染的使用。將E1A、E1B、E4和E2A的Ad蛋白質以及VA RNA克隆到稱為XX680的單 個質粒內。在XX680質粒上供應Ad輔助基因消除在受轉染細胞中的Ad生產，僅獲得rAAV 載體。三重轉染方法仍是使用rAAV的大多數實驗室實驗中的標準生產方法。然而，該方法 已受限於貼壁細胞的使用。
[0006] rAAV生產中的進展已在過去10年中取得，所述進展已允許大量實驗室拋棄使用 貼壁HEK293細胞的生產，並且轉向可擴大技術例如通過使用下述的基於感染的技術：重組 腺病毒（Gao 等人，#〇乂?er. 5:644 (2002);Gao 等人，及皿 9:2353 (1998); Liu 等人，#〇7. J?: 394 (2000) ;Liu 等人，fewe 6:293 (1999) ;Tessier 等人， 7； Kirol ZS^TSUOOl))、單純皰瘮病毒（Booth 等人，77:829(2004);Conway 等人，fewe Tier. 6:986 (1999) ;Hwang 等人，#〇7. Tier. S14 (2003) ;Kang 等人，fewe 76:229 (2009);Thomas等人，及皿 %:861 (2009))、杆狀病毒表達載體 系統（BEVS)(Aslanidi等人，/￥oc. 以?JcatZ5bi. 7你:5059(2009);Cecchini等 人，fewe 75:823 (2008);Kohlbrenner等人，#〇乂?er. 7J?: 1217 (2005);Negrete 等人，ifetA#〇乂沿o7. ^?J:79(2008);Negrete等人，7； 9:938(2007);Urabe 等k，Hum.GeneTher.7J: 1935 (2002);Urabe等人，7；Kiro乂卻:1874 (2006))、和懸浮HEK293細胞的瞬時轉染（Durocher等人，JifetA7?:32(2007);Hildinger等人， Biotechnol.Lett. 29..YIYiVZWrn'Yark等k，Biotechnol.Bioeng. 94.AV6 。 Park等人和Durocher等人證實使用其優化的無血清懸浮HEK293細胞生產系統分別生成大 約1.4xl04和3x10 4vg/細胞。這些研宄共同的是下述事實：載體產率繼續成為障礙，並且 顯著低於經由貼壁HEK293細胞轉染和rHSV生產系統生成的vg/細胞。
[0007] 氯化銫純化（CsCl)仍是最廣泛使用的AAV純化形式（Grieger等人， 7:1412 (2006) ;Grieger 等人，JoV. ?效:119 (2005))。使用 CsCl純化的利益是其相對低的成本、對於任何AAV血清型的相容性以及空顆粒和含基因組 顆粒的分離。然而，幾個缺點有損該方法用於臨床應用，包括：（1)在多重CsCl梯度純化運 行內鑑定含病毒級分所需的時間和努力；（2)所得到的病毒含有除銫之外的許多雜質；（3) 阻礙按比例放大；和（4)在純化過程中的眾多開放步驟（Brument等人，#〇/. 6:678 (2002);Chahal 等人，J Kz>o乂 ife7激:61 (2007) ;Hermens 等人，//應.fewe Tier. 70:1885 (1999);Kaludov 等人，及皿 7J: 1235 (2002);Smith 等人，7； Kz>o乂 Meth.774:115 (2003);Zolotukhin，//應? fewe 76:551 (2005))。由 Hermens 等人 和Zolotukin等人進行的實驗顯示在使用肝素親和層析進一步純化後，稱為碘克沙醇的密 度梯度介質在分離AAV2中是非常有效的（Hermens等人，//腫.7(9:1885(1999); Zolotukhin 等人，fewe 6:973 (1999);Zolotukhin 等人，忽:158 (2002))。 該系統需要注意的（The caveat of this system)是不能純化其他AAV血清型和嵌合衣殼 缺乏對於硫酸肝素的親和力，因此恢復rAAV對CsCl的純化。已存在不使用CsCl的純化的 幾種其他嘗試，包括具有表位的病毒衣殼的操作（Koerber等人，及皿7及367 (2007))和多種形式的層析（Brument 等人，#〇/. ?6?r. 6:678 (2002) ;Chahal 等人，J Kz>o7. ifetA 7激：61 (2007);Davidoff 等人，7； Kz>o7. ifetA 7^7:209 (2004);Gao 等}\,Hum.GeneTher.77:2079 (2000) ;Hermens 等人，及皿 fewe 7(9:1885 (1999); Kaludov 等人，//應.fewe Tier. 7J: 1235 (2002) ;Smith 等人，J Kz>o7. ifetA 774:115 (2003) ;Zolotukhin 等人，fewe 6:973 (1999) ;Zolotukhin 等人，從otfe 忽:158 (2002))。離子交換層析的使用已顯示成功純化幾種AAV血清型。Brument等人和Davidoff 等人使用二柱系統純化AAV血清型2、5和8 (feument等人，#〇乂?er.沒678 (2002); Davidoff 等人，J Kz>o乂 7Z/:209 (2004))。Zolotukhin 等人顯不使用碘克沙醇 加上利用Q-Sepharose柱的離子交換能夠純化血清型1、2和5 (Zolotukhin等人，ife從otfe 忽:158 (2002))。這些方法顯示在AAV純化中的極大希望，但僅對指定血清型有效。可純 化所有AAV血清型的通用方法仍有待鑑定。
[0008] 本發明提供了在無動物組分的懸浮條件下生長且可以用於AAV生產系統中的 HEK293細胞系，所述AAV生產系統是快速的、可放大的、產生高滴度、並且對於所有AAV血清 型和嵌合體均起作用。
[0009] 發明概述 本發明涉及用於AAV載體的可擴大製造方法的開發，所述製造方法有效生成高滴度、 高度純和有效數量的AAV載體。該方法的開發包括HEK293細胞系的生成，所述HEK293細 胞系在無動物組分的懸浮條件下生長。
[0010] 本發明的一個方面涉及保藏為ATCC編號PTA-13274的分離的HEK293細胞。
[0011] 本發明的另一個方面涉及生產AAV顆粒的方法，其包括：（a)向本發明的HEK293 細胞提供AAV表達系統；（b)在其中產生AAV顆粒的條件下培養細胞；和（c)任選分離AAV 顆粒。
[0012] 本發明的這些及其他方面在下文本發明說明書中更詳細地闡述。
[0013] 附圖簡述 圖1A-1B顯示三重轉染質粒比和轉染混合物（cocktail)體積的優化。（A)利用XX680、 AAV rep/cap輔助和TR質粒的不同質粒比，以測定rAAV載體生產的優化質粒比。（B)測試 不同轉染混合物體積，以測定用2:1的轉染試劑(化學品或脂質）與DNA比和溫育時間的優 化轉染條件。轉染混合物的體積百分比與最終細胞培養體積百分比有關。
[0014] 圖2A-2B顯示細胞密度轉染優化實驗，和細胞培養年齡（cell culture age)對載 體生產的影響。（A)l x 106和2 x 106活細胞/mL用1-2吒質粒DNA(2:1.5:1 XX680:AAV rep/cap輔助：TR質粒)轉染。（B)使用優化參數轉染低、中和高傳代細胞，以測定細胞培養 年齡是否影響轉染效率和rAAV生產。
[0015] 圖3A-3B舉例說明在柱層析後經由銀染色和負染色透射電子顯微鏡檢查（TEM)的 AAV洗脫峰級分的純度。
[0016] 圖4A-4B證實使用優化生產和純化條件，單鏈和自互補（self-complementary) rAAV血清型1-6、8和9的生產和純化。對於每個血清型轉染在搖瓶中的一升細胞培養物。 使用HeLaRC32細胞，對於每個血清型計算細胞裂解產物和純化後滴度加上vg:TU比(參見 方法)。（A)單鏈血清型1-6、8和9純化後的銀染色圖像。（B)自互補的rAAVl-6、8和9的 DNA印跡。從每個血清型衣殼中分離載體基因組且在鹼性瓊脂糖凝膠上運行。
[0017] 圖5顯示單鏈和自互補rAAV血清型1-6、8和9的負染色TEM圖像。基於負染色 TEM圖像測定每個血清型的實心與空心衣殼比。
[0018] 圖6顯示用lxlO11 vg的AAV6、8和9 CBA-Luc載體注射的小鼠的體內圖像。CBA-螢 光素酶載體經由尾靜脈注射施用到每隻小鼠內。由懸浮J1EK293細胞生成的CBA-Luc載體 經由不連續密度梯度/柱層析進行純化，並且由貼壁HEK293細胞生成的那些經由CsCl密 度梯度進行純化。小鼠在（A)-周和（B)-個月時進行成像。對照小鼠用PBS進行注射。 AAV8和9的光子範圍設為5xl0 6至1x10 8。AAV6設為5xl04至1x10 6。曝光時間對於AAV8 和9為1分鐘，並且對於AAV 6為5分鐘。
[0019] 圖7A-7B顯示單鏈和自互補rAAV載體純化後的濃度。（A)濃縮前的rAAV載體和 (B)濃縮後的rAAV載體的負染色TEM圖像。
[0020] 圖8顯示使用在搖瓶和波浪（wave)生物反應器中生長且轉染的懸浮HEK293細胞 的rAAV載體生產的時間線。
[0021] 圖9顯示來自懸浮HEK293培養基的rAAV8和rAAV9的連續生產和收穫。總產率 代表所有培養基時間點和加在一起的120小時細胞沉澱產率。48小時細胞沉澱對照代表如 本文描述的來自在轉染後48小時的標準收穫的產率。
[0022] 發明詳述 本發明現在將參考附圖進行描述，在所述附圖中顯示了本發明的優選實施方案。然而， 本發明可以以不同形式體現，並且不應解釋為限制於本文所述的實施方案。相反，這些實施 方案這樣提供，使得本公開內容將是徹底和完整的，並且將本發明的範圍完全傳達給本領 域技術人員。
[0023] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域普 通技術人員通常理解相同的含義。在本文本發明說明書中使用的術語僅用於描述具體實施 方案的目的，並且不旨在是本發明的限制。本文提及的所有出版物、專利申請、專利及其他 參考文獻通過引用整體併入。
[0024] 除非另有具體說明，否則核苷酸序列在本文中僅通過單鏈、以5'至3'方向、從左 到右呈現。核苷酸和胺基酸在本文中以由IUPAC-IUB生物化學命名委員會（Biochemical Nomenclature Commission)推薦的方式，或(對於胺基酸）通過依照37 CFR § 1.822和確 定用法的單字母代碼或三字母代碼表示。參見例如fcerife/waA99-102 (1990 年11月）（美國專利和商標局）。
[0025] 除另有指示外，本領域技術人員已知的標準方法可以用於構建rAAV構建體，表達 AAV Rep和/或Cap序列的包裝載體，以及瞬時轉染和穩定轉染的包裝細胞。此類技術是本 領域技術人員已知的。參見例如SAMBR00K等人MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 第 2 版（Cold Spring Harbor，NY，1989) ;AUSUBEL 等人 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc.和 John Wiley & Sons，Inc.，New York)。
[0026] 此外，本發明還考慮在本發明的一些實施方案中，可以排除或省略本文闡述的任 何特點或特點組合。
[0027] 宙義 下述術語用於本文說明書和所附的權利要求中。
[0028] 除非上下文另有明確說明，否則單數形式的"一個（a) "和"一個（an) "旨在還包 括複數形式。
[0029] 此外，如本文使用的術語"約"當提及可測量值例如多核苷酸或多肽序列的長度、 劑量、時間、溫度等等的量時，意欲包含指定量的20%、10%、5%、1%、0. 5%或甚至0. 1%的變化。
[0030] 還如本文使用的，"和/或"指的是且包含相關列出項中的一個或多個的任何和所 有可能組合，以及在替代方案中解釋時組合的缺乏("或")。
[0031] 如本文使用的，過渡短語"基本上由……組成"應解釋為包含所述材料或步驟"以 及實質上不影響本發明的一個或多個基本和新型特徵的材料或步驟"(例如rAAV複製）。參 見 7/? re 你tz，537 F.2d 549,551-52，190 U.S.P.Q. 461，463 (CCPA 1976)(原文中的重 點）；還參見MPEP § 2111.03。因此，如本文使用的術語"基本上由……組成"不應解釋為 等價於"包含"。
[0032]如本文使用的術語"細小病毒（parvovirus) "包含細小病毒科， 包括自主複製細小病毒和依賴病毒。自主性細小病毒包括屬細小病毒屬紅 病毒屬（iZrj^Aro rirys)、濃核病毒屬（rirys)、重複病毒屬（Jtera rirys)和康特拉病 毒屬（的成員。示例性自主性細小病毒包括但不限於小鼠細小病毒、牛細小 病毒、犬細小病毒、雞細小病毒、貓泛白細胞減少症病毒、貓細小病毒、鶴細小病毒、H1細小 病毒、番鴨細小病毒、蛇細小病毒和B19病毒。其他自主性細小病毒是本領域技術人員已知 的。參見例如FIELDS等人VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven出版商)。
[0033]屬依賴病毒屬（含有腺伴隨病毒（AAV )，包括但不限於AAV 1型、 AAV 2 型、AAV 3 型(包括 3A 和 3B 型)、AAV 4 型、AAV 5 型、AAV 6 型、AAV 7 型、AAV 8 型、 AAV 9 型、AAV 10 型、AAV 11 型、AAV 12 型、AAV 13 型、禽 AAV、牛 AAV、犬 AAV、山羊 AAV、 蛇AAV、馬AAV和綿羊AAV。參見例如FIELDS等人VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版， Lippincott-Raven 出版商）；和表 1。
[0034] 如本文使用的，術語"腺伴隨病毒"（AAV)包括但不限於AAV 1型、AAV 2型、AAV 3 型(包括 3A 和 3B 型）、AAV 4 型、AAV 5 型、AAV 6 型、AAV 7 型、AAV 8 型、AAV 9 型、AAV 10 型、AAV 11 型、AAV 12 型、AAV 13 型、蛇 AAV、禽 AAV、牛 AAV、犬 AAV、馬 AAV、綿羊 AAV、山 羊AAV、蝦AAV及任何其他目前已知或以後發現的AAV。參見例如FIELDS等人VIROLOGY， 第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven出版商)。許多相對新的AAV血清型和進化枝 已得到鑑定（參見例如 Gao 等人，7； 78:6381 (2004) ;Moris 等人，33:375 (2004);和表 1)。
【權利要求】
1. 分離的HEK293細胞，其保藏為ATCC編號PTA-13274。
2. 生產AAV顆粒的方法，其包括： (a) 向權利要求1的HEK293細胞提供AAV表達系統； (b) 在其中產生AAV顆粒的條件下培養所述細胞；和 (c) 任選分離所述AAV顆粒。
3. 權利要求2的方法，其中所述細胞是懸浮培養的。
4. 權利要求2或3的方法，其中所述細胞在無動物組分的條件下培養。
5. 權利要求2-4中任一項的方法，其中步驟（c)包括從所述細胞中分離所述AAV顆粒。
6. 權利要求2-4中任一項的方法，其中步驟（c)包括從所述細胞在其中培養的培養基 中分離所述AAV顆粒。
7. 權利要求2-6中任一項的方法，其中所述細胞在搖瓶中培養。
8. 權利要求2-6中任一項的方法，其中所述細胞在生物反應器中培養。
9. 權利要求2-8中任一項的方法，其中所述方法能夠生產所有AAV的血清型、嵌合體和 雜交物。
10. 權利要求2-9中任一項的方法，其中所述AAV選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 和 AAV13 或由 AAV1-13 2. 5、2i8、9. 45 及其他 嵌合或雜交衣殼構成的嵌合AAV。
11. 權利要求2-10中任一項的方法，其中所述AAV表達系統包括包含轉基因的重組 AAV質粒、含re/7-ca/?的包裝質粒和腺病毒輔助質粒。
12. 權利要求11的方法，其中所述轉基因是報導分子、治療、免疫原性或診斷基因。
13. 權利要求2-12中任一項的方法，其中所述方法提供純化前每細胞至少約4 X 10 4 含載體基因組的顆粒。
14. 權利要求2-13中任一項的方法，其中所述方法提供純化前每細胞至少約I X IO5 含載體基因組的顆粒。
15. 權利要求2-14中任一項的方法，其中所述方法提供每升細胞培養物至少約I X 1〇12純化的含載體基因組的顆粒。
16. 權利要求2-15中任一項的方法，其中所述方法提供每升細胞培養物至少約I X 1〇13純化的含載體基因組的顆粒。
【文檔編號】C12N7/00GK104520421SQ201280064466
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2012年10月26日 優先權日:2011年10月28日
【發明者】格裡格 J., J. 薩穆斯基 R. 申請人:北卡羅來納-查佩爾山大學