表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株及在癌模型應用的製作方法
2023-05-18 22:58:56 1
專利名稱：表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株及在癌模型應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學研究領域，具體涉及將綠色螢光蛋白及螢火蟲螢光素酶導入細胞，建立表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株及在癌模型應用，用於胃癌基礎及臨床前研究。
背景技術：
根據世界衛生組織2008年統計，胃癌是僅次於肺癌的常見惡性腫瘤。而我國是胃癌的高發區，據統計，每年胃癌新發高達40餘萬人，死亡人數近30萬，為世界首位。在衛生部199(Γ1992年的全國第二次死因調查中，胃癌約佔到所有癌症死亡人數的四分之一。胃癌已日益成為影響人們健康的重大疾病，同時也為社會帶來了嚴重的經濟復負擔。近年來， 隨著各國政府對胃癌的重視，胃癌的治療和基礎研究得到了很大的發展，新興藥品和治療手段不斷湧現，但各種治療效果均有限，胃癌的死亡率和復發率仍依舊很高。因此，深入研究胃癌發生發展的機制，為胃癌治療開闢新手段，為胃癌診斷創造新思路，具有重大的現實意義。而胃癌的研究必須基於可靠、優良的生物研究平臺和方式，然而，目前國內外缺乏一種有效可靠的體外、體內胃癌研究平臺，嚴重製約了胃癌的基礎及臨床前研究。慢病毒感染較其他轉染方式有較強的優勢，具有感染譜廣、效率高，可感染非分裂細胞、並可使目的基因整合至基因組因而能夠長期表達、免疫反應小等特點，是一種高效的基因轉移工具。綠色螢光蛋白作為一種常見的報告基因已廣泛用於生命科學研究領域，它相比於其他標記物有其獨特的優點①螢光穩定。綠色螢光蛋白對光漂白有較強的耐受性，能耐受長時間的光照；綠色螢光蛋白在ΡΗ7 12範圍內也能正常發光，且對高溫(70°C)、鹼性、 除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數普通酶(鏈黴蛋白酶ftxmase除外)都有較強抗性。②檢測方便，簡單直觀。用螢光顯微鏡或肉眼就可以觀察到，且可進行活體觀察，不會損傷正在生長的細胞和組織。③對受體細胞基本無毒害。④不需任何反應底物和輔助因子。⑤可製成永久標本。可耐受福馬林的固定，因而可製成長期保存的標本。但是綠色螢光蛋白也有其缺陷①需要激發光。在激發綠色螢光蛋白產生螢光的過程中，生物體內很多物質也會發出螢光，產生的非特異性螢光會影響到檢測靈敏度。②綠色螢光蛋白發射波長局限於510nm 左右，當發光部位深藏於組織中時，由於組織的吸收，綠色螢光很難透過組織。基於螢火蟲螢光素酶的生物發光是近些年出現的成像方法，有別於其他光學成像方法，其特點在於①不需要激發光。因為生物發光採用的是底物發光的形式，因此不需要激發光。②高靈敏度，雖然生物發光強度弱於螢光，但是由於不需要激發光，組織自發螢光少， 因而信噪比高，靈敏度高。③穿透力強。由於螢火蟲螢光素酶發出的光在M(T600nm，組織吸收少，因此對有深部組織成像具有較高的優勢。④良好的相關性。光的強度與標記細胞的數目線性相關。其缺點在於，檢測不方便，需要底物；並且由於空間解析度低及檢測方式點的限制，因而無法觀察細胞的形態。因此，通過慢病毒轉染的方式將綠色螢光蛋白和螢光素酶基因導入胃癌細胞，便
4可充分利用螢光和生物發光在成像上的優勢，因而方便胃癌的基礎和臨床前研究。
發明內容
本發明的目的是提供人胃癌雙標細胞株的建立及應用，它通過慢病毒基因感染的方法，建立表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株及在癌模型應用，用於在胃癌臨床前研究中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株， 其特徵是以人胃癌細胞係為母細胞，採用慢病毒感染的方法，將綠色螢光蛋白(GFP)和螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase, LUC)帶入細胞，得到穩定表達綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶的細胞株。將所述的細胞株通過皮下，尾靜脈及原位注射的方式建立不同的胃癌動物模型。所述的慢病毒感染的方法是將外源基因導入，它的步驟是
a)大腸桿菌擴增慢病毒包裝質粒pWPT-GFP，pMD2. G，pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC, VSVg, pCMV-dR8. 91，並酶切鑑定，純化；
b)用上述純化獲得的質粒按照一定比例，用脂質體法共轉染入細胞，以分別產生含有綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶慢病毒顆粒的上清；
c)以胃癌SGC7901為母細胞(亦可以其他胃癌細胞株為母細胞)，用上述病毒順次感
染；
d)擴增建系，並通過流式細胞分選技術及嘌呤黴素藥物加壓篩選技術，獲得穩定表達綠色螢光蛋白和螢光素酶的陽性克隆。所述的綠色螢光蛋白GFP及螢火蟲螢光素酶Firefly luciferase的測手段均為光學信號檢測方法，其中包括
a)體外檢測手段GFP檢測條件為螢光倒置顯微鏡，激發光波長為488士30nm,發射波長為509 士 30 nm;螢火蟲螢光素酶檢測手段為化學發光檢測手段，施加D-Iuciferin後，分別用多功能酶標儀器(Thermo kientific)，及小動物成像系統(Kinetics, Caliper Life Science)；
b)動物體體內檢測手段，動物體體內檢測均採用小動物體內成像系統(Kinetics， Caliper Life Science)；分別為螢光成像和生物發光成像。所選用的動物為裸鼠或SCID鼠。表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株在癌模型應用，其特徵是具體步驟為
1)慢病毒載體擴增將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G, pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC， VSVg, pCMV-dR8. 74常規轉化大腸桿菌，用氨苄抗生素篩選陽性克隆，37 ！搖菌擴增，用質粒純化提取試劑盒收集，純化慢病毒質粒；其中pWPT-GFP，質粒含有綠色螢光蛋白GFP基因，用於觀察和流式細胞分選；pLenti-CMV-puro-LUC含有螢光素酶基因及真核篩選標記嘌呤黴素(Puromycin)基因，用於生物發光成像和藥物加壓篩選；
2)含綠色螢光蛋白慢病毒包裝前一天將四31~細胞鋪於10cm培養板，培養於5 % CO2 37 0C恆溫培養箱；培養基為DMEM，血清選用進口小牛血清，待細胞密度長至6(Γ70 %時， 進行轉染；首先將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G，pSPAX2按照一定的比例與Opti-MEM混合，並將Iipofectamine 2000與Opti-MEM充分混合，室溫孵育5分鐘後，將上述2種液體充分混合孵育20分鐘後，加入細胞中；8小時後螢光顯微鏡觀察包裝效果，並收集病毒上清；收集的病毒上清經0. 2 ym濾器過濾分裝後於-80°C保存；
3)含螢光素酶慢病毒包裝前一天將細胞鋪於IOcm培養板，帶細胞密度長至 60-70%時，進行轉染；首先將慢病毒載體pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg, pCMV_dR8. 91按照一定的比例與Opti-MEM混合，並將Iipofectamine 2000與Opti-ΜΕΜ充分混合，室溫孵育 5分鐘後，將上述2種液體充分混合孵育20分鐘後，加入細胞中；8小時後熒收集病毒上清；收集的病毒上清經0.2 ym濾器過濾分裝後於-80 °C保存；
4)病毒感染感染前一天將SGC7901細胞鋪於M孔板，密度約2X105，培養於5% CO2 37 恆溫培養箱；培養基為DMEM，血清選用進口小牛血清將含有綠色螢光蛋白的病毒液加入，並加polybrene 4 μ g/ml增加感染效率；12小時後更換為完全培養基；48小時後，觀察感染效果；如果感染效果不佳，進行流式分選；之後將帶有綠色螢光的SGC7901按照密度再次鋪入M孔板，並加入上述含有螢光素酶的病毒液，並加入4 μ g/ml polybrene,於48小時後，加入篩選藥物Puromycin，加壓篩選2周後，獲得陽性克隆，並擴大培養；此時獲得雙標胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC ；
5)雙標細胞系體外發光驗證利用螢光顯微鏡觀察SGC7901綠色螢光效果，倒置螢光顯微鏡觀察條件為，激發條件為488 nm ；採用倍比稀釋的方法，採用用小動物活體成像儀鑑定在不同細胞數量下，螢光素酶及綠色螢光表達，並判斷其線性關係；其中生物發光成像條件為，加入底物D-Iuciferin 1分鐘後顯像，曝光時間設為自動；
6)腫瘤皮下注射方法將胃癌亞系SGC7901-GFP-LUC消化後，用PBS重懸於200μ 1，在裸鼠左肩部皮下注射細胞2Χ 106，並通過小動物活體成像儀動態觀察細胞皮下增殖狀況；
7)腫瘤原位種植方法6 7周裸鼠購自第四軍醫大學動物中心，85mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，待麻醉穩定後，使裸鼠仰臥位，於左上腹部開3cm切口，依次剪開皮膚，腹膜，暴露胃組織；將胃癌亞系SGC7901-GFP-LUC消化後，重懸約5X106細胞於50 μ 1 DMEM中，用30G 注射器緩慢吸取，在體視顯微鏡的輔助下，注射於胃漿膜下；之後將胃還納，7-0手術縫線縫合連續縫合腹膜，4-0手術縫線間斷縫合皮膚；種植後每周，用小動物活體成像儀動態在體觀察生物發光信號，檢測條件為腹腔注射D-Iuciferin 10分鐘後，裸鼠用異氟烷麻醉後，取左側仰臥位，曝光時間5分鐘；
8)4周後，將荷瘤裸鼠處死，製作原位胃癌HE染色切片及冰凍切片，觀察胃癌原位模型建模效果。所述的胃癌原位模型的建立是通過癌細胞胃漿膜下注射的方式完成。所述的藥物加壓篩選所選用為嘌呤黴素Puromycin，篩選標記為螢光素酶。上述可用於體內實時監測腫瘤生長評價藥物療效。本發明的優點是國內外目前缺乏融合上述兩種成像方式的胃癌研究細胞，因此本發明基於綠色螢光蛋白和螢光素酶各自的優缺點，通過在同一種細胞內共表達這兩種光學標記，用螢光成像做體外生物學觀察，用生物發光成像進行動物體內的評價，建立針對胃癌的多功能影像學研究平臺，以滿足胃癌研究的需要。
下面結合實施例和實施例附圖對本發明作進一步說明，但不作為對本發明的限定。圖1慢病毒包裝質粒pWPT-GFP結構圖； 圖2慢病毒包裝質粒pMD2. G結構圖3慢病毒包裝質粒PSPAX2結構圖； 圖4慢病毒包裝質粒pLenti-CMV-puro-LUC結構圖； 圖5慢病毒包裝質粒pCMV-dR8. 91結構圖； 圖6慢病毒包裝質粒VSVg結構圖7胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC螢光顯微鏡下觀察綠色螢光效果； 圖8胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC倍比稀釋觀察生物發光效果及線性關係； 圖9胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC倍比稀釋觀察螢光效果及線性關係； 圖10活體成像系統觀察胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC在肺上的定植情況； 圖11利用活體成像系統動態監測胃癌細胞亞系在裸鼠皮下成長； 圖12裸鼠原位胃癌腫瘤構建過程大體視野，組織切片及冰凍切片； 圖13利用活體成像系統動態檢測胃癌裸鼠原位胃癌的發展。
具體實施例方式表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株，以胃癌SGC7901為母細胞，採用慢病毒感染的方法，將綠色螢光蛋白GFP和螢火蟲螢光素酶Firefly luciferase, LUC基因帶入細胞，得到穩定表達綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶的細胞株，將所述的細胞株通過皮下，尾靜脈及原位注射的方式建立不同的胃癌動物模型。所述的慢病毒感染的方法是將外源基因導入，它的步驟是
a)大腸桿菌擴增慢病毒包裝質粒pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2, pLenti- CMV-puro-LUC, VSVg, pCMV-dR8. 91，並酶切鑑定，純化；
b)用上述純化獲得的質粒按照一定比例，用脂質體法共轉染入細胞，以產生含有慢病毒的上清；
c)以胃癌SGC7901為母細胞，亦可以其他胃癌細胞株為母細胞，用上述病毒順次感染；
d)擴增建系，並通過流式細胞分選技術及嘌呤黴素藥物加壓篩選技術，獲得穩定表達綠色螢光蛋白和螢光素酶的陽性克隆。所述的綠色螢光蛋白GFP及螢火蟲螢光素酶Firefly luciferase的測手段均為光學信號檢測方法，其中包括，其中包括
a)體外檢測手段GFP檢測條件為螢光倒置顯微鏡，激發光波長為488士30nm,發射波長為509士30 nm ；螢火蟲螢光素酶檢測手段為化學發光檢測手段，施加D-Iuciferin後， 分別用多功能酶標儀器Varadiflash Scanner, Thermo Scientific,及小動物成像系統 kinetics, Caliper Life Science ；
b)動物體體內檢測手段，動物體體內檢測均採用小動物體內成像系統kinetics， Caliper Life Science ；分別為螢光成像和生物發光成像。所述的動物模型為裸鼠。其中胃癌原位模型的建立是通過癌細胞胃漿膜下注射的方式完成。
藥物加壓篩選所選用為嘌呤黴素Puromycin，篩選標記為螢光素酶。
用於體內實時監測腫瘤生長評價藥物療效。表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株在癌模型應用，具體步驟為
1)慢病毒載體擴增將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G, pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC， VSVg，pCMV-dR8.74常規轉化大腸桿菌，用氨苄抗生素篩選陽性克隆，37 V搖菌擴增，用質粒純化提取試劑盒收集，純化慢病毒質粒；其中pWPT-GFP，質粒含有綠色螢光蛋白GFP基因，用於觀察和流式細胞分選；pLenti-CMV-puro-LUC含有螢光素酶基因及真核篩選標記 Puromycin基因，用於生物發光成像和藥物加壓篩選(如圖1.慢病毒包裝質粒pWPT-GFP結構圖；圖2.慢病毒包裝質粒pMD2. G結構圖；圖3.慢病毒包裝質粒PSPAX2結構圖；圖4. 慢病毒包裝質粒pLenti-CMV-puro-LUC結構圖)；
2)含綠色螢光蛋白慢病毒包裝前一天將四31~細胞鋪於10cm培養板，培養於5 % CO2 37 0C恆溫培養箱；培養基為DMEM，血清選用進口小牛血清，待細胞密度長至60-70%時， 進行轉染；首先將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G，pSPAX2按照一定的比例與Opti-MEM混合， 並將Iipofectamine 2000與Opti-MEM充分混合，室溫孵育5分鐘後，將上述2種液體充分混合孵育20分鐘後，加入細胞中；8小時後螢光顯微鏡觀察包裝效果，並收集病毒上清；收集的病毒上清經0. 2 ym濾器過濾分裝後於-80°C保存；
3)含螢光素酶慢病毒包裝前一天將細胞鋪於10cm培養板，帶細胞密度長至 60^70 %時，進行轉染；首先將慢病毒載體pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg，pCMV-dR8. 91按照一定的比例與Opti-MEM混合，並將Iipofectamine 2000與Opti-ΜΕΜ充分混合，室溫孵育 5分鐘後，將上述2種液體充分混合孵育20分鐘後，加入細胞中；8小時後熒收集病毒上清；收集的病毒上清經0.2 ym濾器過濾分裝後於-80°C保存(如圖5.慢病毒包裝質粒 pCMV-dR8. 91結構圖；圖6.慢病毒包裝質粒VSVg結構圖)；
4)病毒感染感染前一天將SGC7901細胞鋪於M孔板，密度約2X105，培養於5% CO2 37。C恆溫培養箱；培養基為DMEM，血清選用進口小牛血清將含有綠色螢光蛋白的病毒液加入，並加polybrene 4 μ g/ml增加感染效率；12小時後更換為完全培養基；48小時後，觀察感染效果；如果感染效果不佳，進行流式分選；之後將帶有綠色螢光的SGC7901按照密度再次鋪入M孔板，並加入上述含有螢光素酶的病毒液，並加入4 μ g/ml polybrene,於48 小時後，加入篩選藥物Puromycin，加壓篩選2周後，獲得陽性克隆，並擴大培養；此時獲得雙標胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC(如圖7.胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC螢光顯微鏡下觀察綠色螢光效果；圖8.胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC倍比稀釋觀察生物發光效果及線性關係；圖9.胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC倍比稀釋觀察螢光效果及線性關係)；
5)雙標細胞系體外發光驗證利用螢光顯微鏡觀察SGC7901綠色螢光效果，倒置螢光顯微鏡觀察條件為，激發條件為488nm ；採用倍比稀釋的方法，採用用小動物活體成像儀鑑定在不同細胞數量下，螢光素酶及綠色螢光表達，並判斷其線性關係；其中生物發光成像條件為，加入底物D-Iuciferin 1分鐘後顯像，曝光時間設為自動；
6)腫瘤皮下注射方法將胃癌亞系SGC7901-GFP-LUC消化後，用PBS重懸於200μ 1， 在裸鼠左肩部皮下注射細胞2 X 106，並通過小動物活體成像儀動態觀察細胞皮下增殖狀況 (如圖10.活體成像系統觀察胃癌細胞亞系SGC7901-GFP-LUC在肺上的定植情況；圖11.利用活體成像系統動態監測胃癌細胞亞系在裸鼠皮下成長)；7)腫瘤原位種植方法6 7周裸鼠購自第四軍醫大學動物中心，85mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，待麻醉穩定後，使裸鼠仰臥位，於左上腹部開3 cm切口，依次剪開皮膚，腹膜，暴露胃組織；將胃癌亞系SGC7901-GFP-LUC消化後，重懸約5X IO6細胞於50 μ 1 DMEM中，用30G 注射器緩慢吸取，在體視顯微鏡的輔助下，注射於胃漿膜下；之後將胃還納，7-0手術縫線縫合連續縫合腹膜，4-0手術縫線間斷縫合皮膚；種植後每周，用小動物活體成像儀動態在體觀察生物發光信號，檢測條件為腹腔注射D-Iuciferin 10分鐘後，裸鼠用異氟烷麻醉後，取左側仰臥位，曝光時間5分鐘(如圖12.裸鼠原位胃癌腫瘤構建過程大體視野，組織切片及冰凍切片)；
8)4周後，將荷瘤裸鼠處死，製作原位胃癌HE染色切片及冰凍切片，觀察胃癌原位模型建模效果(如圖13. 8)4周後，將荷瘤裸鼠處死，製作原位胃癌HE染色切片及冰凍切片， 觀察胃癌原位模型建模效果。所述的胃癌原位模型的建立是通過癌細胞胃漿膜下注射的方式完成。所述的藥物加壓篩選所選用為嘌呤黴素Puromycin，篩選標記為螢光素酶。穩定表達綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶的胃癌細胞株的應用，可用於體內實時監測腫瘤生長及評價藥物療效。用於體內實時監測腫瘤生長評價藥物療效。
權利要求
1.表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株，其特徵是以人胃癌細胞係為母細胞， 採用慢病毒感染的方法，將綠色螢光蛋白(GFP)和螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase, LUC)基因帶入細胞，得到穩定表達綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶的細胞株。
2.根據權利要求1所述的表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株，其特徵是將所述的細胞株通過皮下，尾靜脈及原位注射的方式建立不同的胃癌動物模型。
3.根據權利要求1所述的表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株，其特徵是所述的慢病毒感染的方法是將外源基因導入，它的步驟是a)大腸桿菌擴增慢病毒包裝質粒pWPT-GFP，pMD2. G, pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC, VSVg, pCMV-dR8. 91，並酶切鑑定，純化；b)用上述純化獲得的質粒按照一定比例，用脂質體法共轉染入細胞，以分別產生含有綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶慢病毒顆粒的上清；c)以人胃癌細胞係為母細胞，用上述病毒順次感染；d)擴增建系，並通過流式細胞分選技術及藥物加壓篩選技術，獲得穩定表達綠色螢光蛋白和螢光素酶的陽性克隆。
4.根據權利要求1所述的表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株，其特徵是所述的綠色螢光蛋白(GFP)及螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase)的測手段均為光學信號檢測方法，其中包括a)體外檢測手段GFP檢測條件為螢光倒置顯微鏡，激發光波長為488士30nm,發射波長為509 士 30 nm;螢火蟲螢光素酶檢測手段為化學發光檢測手段，施加D-Iuciferin後，分別用多功能酶標儀器及小動物成像系；b)動物體內檢測手段，動物體體內檢測採用小動物體內成像系統分別為螢光成像和生物發光成像。
5.根據權利要求1所述的表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株，其特徵是所述的動物模型為裸鼠或SCID鼠。
6.表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株在癌模型應用，其特徵是具體步驟為1)慢病毒載體擴增將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G, pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC， VSVg, pCMV-dR8.74常規轉化大腸桿菌，用氨苄抗生素篩選陽性克隆，37°C搖菌擴增，用質粒純化提取試劑盒收集，純化慢病毒質粒；其中PWPT-GFP，質粒含有綠色螢光蛋白GFP基因，用於觀察和流式細胞分選；pLenti-CMV-puro-LUC含有螢光素酶基因及真核篩選標記嘌呤黴素基因，用於生物發光成像和藥物加壓篩選；2)含綠色螢光蛋白慢病毒包裝將四31~細胞鋪於10cm培養板，培養於5 % CO2 37 °C 恆溫培養箱；待細胞密度長至6(Γ70%時，進行轉染；首先將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G，pSPAX2按照比例混合，並與脂質體充分混合併孵育後，加入細胞中；螢光顯微鏡觀察包裝效果，並收集病毒上清；過濾分裝後於-80°C保存；3)含螢光素酶慢病毒包裝前一天將細胞鋪於10cm培養板，待細胞密度長至 60 70%時，進行轉染；首先將慢病毒載體pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg, pCMV_dR8. 91按照一定的比例並與脂質體充分混合併孵育後，加入細胞中；收集病毒上清過濾後分裝後於-80 °C保存；4)病毒感染感染前一天將人胃癌細胞鋪於細胞培養板，將含有綠色螢光蛋白的病毒液加入；後更換為完全培養基；觀察感染效果，並進行流式分選；之後將帶有綠色螢光的胃癌細胞按照密度再次鋪入細胞板，並加入上述含有螢光素酶的病毒液，於48小時後，加入篩選藥物，加壓篩選後，獲得陽性克隆，並擴大培養；此時獲得穩定綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶基因的；5)雙標細胞系體外發光驗證利用倒置螢光顯微鏡觀察雙標胃癌細胞亞系綠色螢光效果；亦可採用倍比稀釋的方法，採用用小動物活體成像儀鑑定在不同細胞數量下，螢光素酶及綠色螢光表達，並判斷其線性關係；6)腫瘤皮下注射方法將雙標胃癌細胞消化後，用PBS重懸於，在裸鼠右肩部皮下注射細胞2X 106，並通過小動物活體成像儀或卡尺動態觀察細胞皮下增殖狀況；7)腫瘤原位種植方法裸鼠麻醉穩定後，取仰臥位，於上腹部開手術切口，依次剪開皮膚，腹膜，暴露胃組織；將雙標胃癌細胞消化後，重懸於適量培養基中，用注射器緩慢吸取， 注射於胃漿膜下；之後手術縫線縫合縫合腹膜及皮膚；種植後每周，用小動物活體成像儀動態在體觀察生物發光信號；8)4周後，將荷瘤裸鼠處死，製作原位胃癌HE染色切片及冰凍切片，觀察胃癌原位模型建模效果。
7.根據權利要求6所述的穩定表達綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶在癌模型應用， 其特徵是所述的胃癌原位模型的建立是通過癌細胞胃漿膜下原位注射的方式完成。
8.根據權利要求6所述的表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株在癌模型應用， 其特徵是所述的藥物加壓篩選所選用為嘌呤黴素(Puromycin)。
9.根據權利要求6所述的表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株在癌模型應用，其特徵是用於體內實時監測腫瘤生長及評價藥物療效。
全文摘要
本發明涉及生物醫學研究領域，具體涉及將綠色螢光蛋白及螢火蟲螢光素酶導入細胞，建立表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株及在癌模型應用，其特徵是以人胃癌細胞係為母細胞，採用慢病毒感染的方法，將綠色螢光蛋白(GFP)和螢火蟲螢光素酶(Fireflyluciferase,LUC)基因帶入細胞，得到穩定表達綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶的細胞株；將所述的細胞株通過皮下，尾靜脈及原位注射的方式建立不同的胃癌動物模型。它提供了人胃癌雙標細胞株的建立及應用，它通過慢病毒基因感染的方法，建立表達綠色螢光蛋白和螢光素酶胃癌細胞株及在癌模型應用，用於在胃癌臨床前研究中的應用。
文檔編號A61K49/00GK102399748SQ201110332648
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者吳開春, 殷繼鵬, 聶勇戰, 胡皓 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學