來源於鹽芥的一個耐鹽、抗旱基因及其編碼蛋白與應用的製作方法
2023-05-19 08:28:11 1
專利名稱：來源於鹽芥的一個耐鹽、抗旱基因及其編碼蛋白與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物中與抗脅迫相關的基因及其編碼蛋白與應用，特別涉及鹽芥中的一個與耐鹽、抗旱相關的基因及其編碼蛋白與其在培育耐鹽、抗旱性提高的植物中的應用。
背景技術：
研究表明，擬南芥的一些近親具有極強的耐逆性，並且較適宜進行遺傳操作。其中，鹽生植物-鹽芥與擬南芥極為相似，基因序列同源性可達70-90％，不僅具有遺傳學模式植物令人滿意的形態、生長特性及遺傳特點，還對海水的高鹽濃度具有較強的耐受能力。因此，鹽芥不但是一種可供研究植物自然耐鹽機制的優異遺傳模式植物，更是一種分離優異耐鹽、抗旱相關基因的資源植物。
發明內容
本發明的目的是提供一個鹽芥的耐鹽、抗旱基因及其編碼蛋白。
本發明所提供的耐鹽、抗旱基因，名稱為ST6-40，來源於十字花科植物鹽芥(Thellungiella halophila)，它是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交並洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由658個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第61-570位鹼基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列的蛋白質。
本發明耐鹽、抗旱基因所編碼的蛋白(ST6-40)，是具有序列表中的SEQ ID №2的胺基酸殘基序列的蛋白質。序列表中的SEQ ID №2由169個胺基酸殘基組成。
含有本發明基因的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
擴增ST6-40中任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內。
利用植物表達載體，將本發明的耐鹽、抗旱基因導入植物細胞，可獲得對高鹽、乾旱耐受力增強的的轉基因細胞系及轉基因植株。
所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3』端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它的可參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3』端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3』端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。
使用ST6-40構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、根部特異表達啟動子等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
攜帶有本發明ST6-40的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物細胞或組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是水稻、小麥等單子葉植物，也可以是擬南芥、大豆、油菜等雙子葉植物。
通過對轉化本發明所提供的耐鹽、抗旱基因ST6-40後所得到的轉基因擬南芥植株進行逆境脅迫試驗，證明該基因在轉入植物後可顯著提高植株的耐鹽、抗旱性。本發明為人為控制植物中抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物(特別是水稻、小麥、油菜等農作物)中發揮重要的作用。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
圖1為載體pCB2004的物理圖譜圖2A為在含OMm NaCl土壤中的ST6-40轉化體和野生型擬南芥的生長情況圖2B為在含200Mm NaCl土壤中經高鹽脅迫處理2周後的ST6-40轉化體和野生型擬南芥的生長情況圖2C為載體pCB2004-ST6-40的物理圖譜圖3為分別在含0Mm NaCl和含200Mm NaCl土壤中的ST6-40轉基因植株和野生型擬南芥生長10天後植株高度統計結果圖4為ST6-40轉基因擬南芥在含PEG的培養基上進行的耐旱模擬實驗結果圖5為ST6-40轉基因擬南芥在土壤中進行的乾旱脅迫實驗結果圖6為ST6-40轉基因植株ST6-40和野生型擬南芥的RT-PCR檢測結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、鹽芥耐鹽、抗旱基因ST6-40的獲得一、鹽芥cDNA文庫的構建提取鹽芥總RNA，反轉錄得到鹽芥全基因組的cDNA，採用高通量構建載體的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，鄭文嶺，馬文麗；通路克隆系統DNA重組技術的新進展.中國生物工程雜誌(2003)，第23卷第7期)，將鹽芥cDNA先重組克隆到pDONR207載體(Invitrogen公司)，得到Entry cDNA文庫，然後再以重組克隆將整個cDNA文庫穿梭至含有35S啟動子的植物過量表達雙元載體pCB2004(物理圖譜如圖1所示)中，得到鹽芥cDNA文庫。上述重組反應完全按照Invitrogen提供的實驗指南進行。
二、將鹽芥cDNA文庫轉化野生型擬南芥將步驟一構建的鹽芥cDNA文庫穿梭到雙元載體pCB2004中，電轉化至農桿菌C58，採用擬南芥花序浸花轉化的方法(floral dip method)(Steven J.Clough and AndrewF.BentFloral dipa simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant JournalVolume 16 Issue6 Page 735-December 1998)大規模轉化擬南芥。
三、擬南芥耐鹽轉化體的篩選1、擬南芥轉化體庫的創建在土壤中大規模播種步驟二獲得的轉化有鹽芥cDNA文庫的擬南芥轉化體的種子，在種子發芽後約5天，表面噴灑濃度為0.2％的除草劑(glufosinate ammonium，商用名為Liberty，法國Aventis作物科學公司)進行篩選，以野生型擬南芥為對照。約1周後可以觀察到轉化體植株和野生型植株具有明顯差別，野生型植株在0.2％除草劑glufosinate條件下不能存活，而轉化體植物不受影響，可以正常生長。以200株轉化體植株為一單位進行收種。
2、高通量方法初篩耐鹽轉化體植株下述各實驗中所用的種子均用如下方法進行表面滅菌處理用50％消毒液(廣州藍月亮有限公司)在室溫下滅菌15分鐘，再用經滅菌的純淨水衝洗4-5遍。
將經消毒的步驟1收穫的種子在4℃下放置3天，以使種子發芽一致。然後將種子播種於MS基本培養基(含2％蔗糖，1.5％瓊脂粉，pH值5.8，高溫蒸汽滅菌15分鐘)上使其發芽，種子發芽生長條件為22℃，光照培養。發芽後，再將其播種於含有220mM NaCl和25mg/L除草劑glufosinate的MS培養基上高通量篩選耐鹽轉化體，每個培養皿播3,000粒種子。待植株生長10天後，將存活下來的轉化體植株移栽到土中，並單株收種。
3、耐鹽轉化體的復篩對每一可能的耐鹽轉化體，選取其大約25至30粒種子用上述步驟2的方法進行表面滅菌後，播種於不同濃度的含鹽MS培養基上，鹽濃度在0-200mM NaCl之間。種子生長一周左右後進行觀察並記錄相應數據，觀察10天後，統計存活的植株數量，計算存活植株數量和死亡植株數量，兩者之間比例高於3∶1的符合分離比例，可能為耐鹽株系，將存活植株移入含有25mg/L除草劑glufosinate的MS培養基上，一周後觀察小苗存活情況。如果小苗全部存活，表明上述可能的耐鹽株系的耐鹽性狀和抗除草劑基因連鎖，符合篩選要求。最後，移栽以上耐鹽株繫到土壤中，單株收種，將種子保存備用。
四、耐鹽、抗旱基因ST6-40的獲得根據鹽芥cDNA在載體pCB2004中插入位點的上、下遊序列設計引物擴增cDNA序列，引物序列如下Omega5』TTTTTACAACAATTACCAACAACAACAA3』；attB25』-TACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTTT-3』提取步驟三篩選得到的耐鹽轉化體的基因組DNA，並以此為模板，在引物Omega和attB2的引導下進行PCR擴增，50uLPCR擴增體系為，0.25uL ExTaq聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司)，2uL基因組DNA，10*PCR緩衝液5uL，dNTPs100uM，上、下遊引物各25uM，再用雙蒸水將反應體系補充至50uL。用PCR技術擴增轉入的鹽芥cDNA。PCR反應條件為先95℃ 1min，再66℃ 1min，最後72℃ 2min，共40個循環。反應結束後，對PCR產物進行測序，測序結果表明該基因具有序列表中的SEQ ID№1的核苷酸序列，由658個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第61-570位鹼基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列的蛋白質。在網站TAIR(www.arabidopsis.org)上和擬南芥基因組基因組序列進行序列比對，比對結果表明該基因與擬南芥同源基因的同源性高達85％，將該耐鹽、抗旱基因命名為ST6-40。
實施例2、ST6-40轉基因擬南芥在土壤中的耐鹽實驗用實施例1的方法構建ST6-40的過量表達載體，將ST6-40克隆入含有35S啟動子的過量表達雙元載體pCB2004中，得到ST6-40的過量表達載體，命名為pCB2004-ST6-40(物理圖譜如圖2C所示)。經測序鑑定正確後，將pCB2004-ST6-40用電轉化法轉入農桿菌，再用花序轉化方法(floral dip method)將轉化有ST6-40過量表達載體的農桿菌重組子轉化野生型擬南芥植株，然後對轉基因植株進行耐鹽實驗，具體方法為選擇其中一株轉基因植株(命名為ST6-40)，將ST6-40轉基因植株ST6-40和野生型擬南芥的種子播種於土壤中，在相同條件下培養，待生長至兩星期大小時，將兩種擬南芥植株各分為兩組，分別移至含OmM NaCl(對照)和含200mMNaCl的土壤中繼續進行培養，觀察並記錄其生長情況，經鹽脅迫處理2周後的植株的生長情況如圖2A和圖2B所示(圖中ST6-40為ST6-40轉基因植株，WT為野生型擬南芥)，無鹽脅迫處理時，ST6-40轉基因植株與野生型植株的生長無明顯差異；在200mM鹽濃度脅迫下，ST6-40轉基因植株的生長顯著優於野生型。經上述鹽脅迫處理10天後，測量ST6-40轉基因植株與野生型植株的植株大小(蓮苔直徑)，結果如圖3所示，ST6-40轉基因植株的個體顯著大於野生型個體。
實施例3、ST6-40轉基因擬南芥在含PEG的培養基上進行的耐旱模擬實驗將ST6-40轉基因植株ST6-40和野生型擬南芥(對照)的種子各分三組，分別播種於含0，5％和10％PEG的MS固體培養基上，在相同條件下培養，待小苗生長7天後觀察轉基因植株與野生型植株之間的生長差異。結果如圖4(圖中縱坐標Biomass即生物量)所示，在5％和10％PEG的培養基上生長的轉基因植株和野生型植株的生長均受到了不同程度的抑制，但ST6-40轉基因植株比野生型植株對乾旱脅迫的耐受力要強。
實施例4、ST6-40轉基因擬南芥在土壤中進行的乾旱脅迫實驗將ST6-40轉基因植株ST6-40和野生型擬南芥(對照WT)的種子播種於土壤中，在相同條件下培養，待生長至10天大小時，實施乾旱脅迫，連續20天不澆水。結果如圖5所示，野生型植株出現萎焉，而轉基因植株只出現輕微的萎焉現象，表明ST6-40在擬南芥中表達，不但可增強其耐鹽性，還可增強其耐旱性。
實施例5、RT-PCR檢測ST6-40在擬南芥的表達情況提取ST6-40轉基因植株ST6-40和野生型擬南芥(WT)的RNA，並分別以兩種RNA為模板，在引物attB15』-acaagtttgtacaaaaaagcaggct-3』和引物attB25』-tacaagaaagctgggtttttttttttt-3』的引導下，進行RT-PCR檢測，以Tubulin為參照(擴增Tubulin的引物序列為β-tubulinP15』-CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC-3』和β-tubulinP25』-CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC-3』)，結果如圖6所示，轉基因植株ST6-40可擴增出ST6-40，表明ST6-40轉入擬南芥後可在35S啟動子作用下過量表達。
序列表16022101211658212DNA213十字花科植物鹽芥(Thellungiella halophila)4001ggaagacgag aagtagtagg cagaagaaga agacgactaa gaaattatcg gtttgcttcg 60atggcgatga cagtagcagc ttcgtcctct gtggcggtga tgattacacg agtacccgcc120gtctccgccc gctgctccgc cgttccttac cttcctccgc ttcctcctcg ctcttttggc180cgatcctctc tcactgttcc gctgaagctt gttgcaggga atggttcgca gaaggttgaa240ttgatgaaga cgagagcttc ttcatcagaa gagacctcaa cgtccattga cactaacgaa300ctcatcacag acttgaagga aaagtgggat ggtcttgaga acaagtcgac agttcttatt360tatggaggag gagccattgt tgctgtttgg ttatcttcca ttgttgttgg tgccataaac420tctgttcctc tgcttccgaa agttatggaa cttgtcggtc tcgggtacac aggatggttc480gtctacagat accttctctt caagtcaagc agaaaggaat tggctgagga cattgattcc540ttggagaaga agatcgcagg gaccgaatag attcattgca aaaacaaaac aaaaaccagt600ttactttatg aggttttcct gtaagatgat tattatacaa tttctctgtt tcgccata 6582102211169212PRT213十字花科植物鹽芥(Thellungiella halophila)4002Met Ala Met Thr Val Ala Ala Ser Ser Ser Val Ala Val Met Ile Thr1 5 10 15Arg Val Pro Ala Val Ser Ala Arg Cys Ser Ala Val Pro Tyr Leu Pro20 25 30
Pro Leu Pro Pro Arg Ser Phe Gly Arg Ser Ser Leu Thr Val Pro Leu35 40 45Lys Leu Val Ala Gly Asn Gly Ser Gln Lys Val Glu Leu Met Lys Thr50 55 60Arg Ala Ser Ser Ser Glu Glu Thr Ser Thr Ser Ile Asp Thr Asn Glu65 70 75 80Leu Ile Thr Asp Leu Lys Glu Lys Trp Asp Gly Leu Glu Asn Lys Ser85 90 95Thr Val Leu Ile Tyr Gly Gly Gly Ala Ile Val Ala Val Trp Leu Ser100 105 110Ser Ile Val Val Gly Ala Ile Asn Ser Val Pro Leu Leu Pro Lys Val115 120 125Met Glu Leu Val Gly Leu Gly Tyr Thr Gly Trp Phe Val Tyr Arg Tyr130 135 140Leu Leu Phe Lys Ser Ser Arg Lys Glu Leu Ala Glu Asp Ile Asp Ser145 150 155 160Leu Glu Lys Lys Ile Ala Gly Thr Glu16權利要求
1.鹽芥的一個耐鹽、抗旱基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的耐鹽、抗旱基因，其特徵在於所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.權利要求1所述耐鹽、抗旱基因的編碼蛋白，是具有序列表中的SEQ ID №2的胺基酸殘基序列的蛋白質。
4.含有權利要求1或2所述耐鹽、抗旱基因的表達載體。
5.含有權利要求1或2所述耐鹽、抗旱基因的轉基因細胞系。
6.含有權利要求1或2所述耐鹽、抗旱基因的宿主菌。
7.一種培育耐鹽、抗旱植物的方法，是利用植物表達載體將權利要求1或2所述的耐鹽、抗旱基因導入植物細胞，獲得對高鹽和乾旱耐受力增強的的轉基因細胞系及轉基因植株。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述被轉化的植物宿主為水稻、小麥、擬南芥、大豆或油菜。
全文摘要
本發明公開了來源於鹽芥的一個耐鹽、抗旱基因及其編碼蛋白。該基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。該基因的編碼蛋白具有序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列。本發明的耐鹽、抗旱基因將在培育耐鹽性增強的植物(特別是水稻、小麥等農作物)中發揮重要的作用。
文檔編號C12N15/82GK1727483SQ20051008303
公開日2006年2月1日 申請日期2005年7月12日 優先權日2005年7月12日
發明者杜金, 向成斌 申請人:中國科學技術大學