用於擴增產氫微藻萊茵衣藻插入突變基因側翼序列的引物及方法
2023-05-19 05:26:56
專利名稱：用於擴增產氫微藻萊茵衣藻插入突變基因側翼序列的引物及方法
技術領域：
本發明涉及一種用於擴增產氫微藻萊茵衣藻插入突變基因側翼序列的引物及方法。
背景技術：
萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是50多年來用於研究光合作用機理的模式生物。2007年全基因組序列信息的獲得，為從基因組水平研究萊茵衣藻各種生命活動特徵及分子調控機理提供了可以利用的高通量分子操作平臺。在全基因組序列信息的基礎上，如何確定各個基因的功能，研究基因與表型的關係是當前的主要問題。與其它的模式光合生物相比，萊茵衣藻基因組序列具有GC含量高、 重複序列多等特點，採用傳統的基因克隆方法不容易成功。所以研究單個基因與表型的關係具有一定難度。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於擴增萊茵衣藻插入突變基因側翼序列的引物及方法。本發明提供了序列表的序列I所不DNA(SpO)、序列表的序列2所不DNA(Spl)、兼併引物和序列表的序列8所示DNA (ACl)組成的引物組合物；所述兼併引物為針對萊茵衣藻的基因組DNA的兼併引物。所述兼併引物具體可為序列表的序列7所示DNA (LAD-5-RMD227)、序列表的序列3 所示DNA(LADl)、序列表的序列4所示DNA(LAD2)、序列表的序列5所示DNA(LAD3)或序列表的序列6所示DNA(LAD4)。本發明還保護一種獲得萊茵衣藻突變體的基因組DNA中巴龍黴素編碼基因的插入位點的方法，包括如下步驟(I)提取萊茵衣藻突變體的基因組DNA ；(2)以基因組DNA為模板，用序列表的序列I所示DNA和所述兼併引物作為引物進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產物；(3)以第一輪PCR擴增產物為模板，用序列表的序列2所示DNA和序列表的序列8 所示DNA作為引物進行第二輪PCR擴增，得到第二輪PCR擴增產物；(4)將第二輪PCR擴增產物進行測序，通過與野生型萊茵衣藻的基因組序列進行比對，得到萊茵衣藻突變體的基因組DNA中巴龍黴素編碼基因的插入位點；所述萊茵衣藻突變體是在萊茵衣藻中導入PSI103質粒得到的突變體。所述第一輪PCR擴增的反應條件具體如下(1)93°C2 分鐘;(2) 95 °C I 分鐘;
(3) 940C 30 #, 680C I 分鐘，72°C 3 分鐘，11 個循環；(4) 940C 30秒，25 0C 2分鐘，以0. 5度/秒的速度升溫至72 °C，72°C 3分鐘；(5) 94°C 20 #,68°C I 分鐘，72°C 3 分鐘，26 個循環；(6) 72 °C 5 分鐘。所述第二輪PCR擴增的反應條件具體如下(1)94。。20 #, 670C I 分鐘，72°C 3 分鐘，2 個循環；(2) 94 0C 20 秒，68 V I 分鐘，72 V 3 分鐘，94 V 20 秒，68 V I 分鐘，72 V 3 分鐘， 940C 20秒，500C I分鐘，720C 3分鐘，14個循環；(3) 72 °C 5 分鐘。巴龍黴素的蛋白序列具體可如序列表的序列15所不，其編碼基因具體可如序列表的序列16所示。野生型萊茵衣藻的基因組序列可以從NCBI (美國生物信息學中心)獲取，也可以從衣藻基因網站(http: / / genome. igi_Dsf.org/cgi_bin/runAlignment db = Chlre4&advanced = I)中獲取。所述引物組合物可用於獲得萊茵衣藻突變體的基因組DNA中巴龍黴素編碼基因的插入位點。所述引物組合物或所述方法可用於輔助鑑定萊茵衣藻的基因組DNA中各基因功倉泛。本發明還保護一種輔助鑑定萊茵衣藻的基因組DNA中各基因功能的試劑盒，包括 PSI103質粒和所述引物組合物。所述萊茵衣藻具體可為萊茵衣藻藻種CC400 (mt-)。本發明提供的方法，將設計的兩條特異性引物與TAIL-PCR所用的兼併引物(簡併引物)進行組合，在優化的PCR反應條件下，可高效特異的擴增插入萊茵衣藻基因組DNA的外源基因的側翼序列。因此，可以將外源DNA隨機插入萊茵衣藻的基因組DNA，得到各種突變株，再採用本發明的引物和方法確定外源基因的插入位點，通過比較突變株和野生株的表型差異輔助確定發生插入突變所在的基因的功能。採用本發明的引物和方法的主要優點有(1)高通量；如果採用96孔PCR儀，一次可完成數十個目的片段的擴增；(2)引物特異性強；採用本發明的引物進行PCR擴增，第二輪反應後就可以檢測到特異的條帶，與傳統方法相比特異性明顯提高；(3)操作簡便快速；只需在普通PCR儀上設定反應程序，在當天(一般約8小時內)就可完成一次擴增反應。本發明對高通量克隆萊茵衣藻基因、研究基因功能具有重要意義。
圖I為TAIL-PCR擴增產物的電泳圖；1-1 :以第一個突變體的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-I進行第一輪擴增，用 Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；1-2 :以第一個突變體的基因組DNA為模板，用 SpO和LAD-2進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；1_3 以第一個突變體的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-3進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；1-4 :以第一個突變體的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-4進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；1-5 :以第一個突變體的基因組DNA 為模板，用SpO和LAD-5-RMD227進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；2-1 :以第二個突變體的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-I進行第一輪擴增，用 Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物'2-2 以第二個突變體的基因組DNA為模板，用 SpO和LAD-2進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；2_3 以第二個突變體的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-3進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；2-4 :以第二個突變體的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-4進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；2-5 :以第二個突變體的基因組DNA 為模板，用SpO和LAD-5-RMD227進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；3-1 以第三個突變體的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-I進行第一輪擴增，用 Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；3-2 以第三個突變體的基因組DNA為模板，用 SpO和LAD-2進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；3_3 以第三個突變體的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-3進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；3-4 :以第三個突變體的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-4進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；3-5 :以第三個突變體的基因組DNA 為模板，用SpO和LAD-5-RMD227進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；CC400-1 以萊茵衣藻藻種CC400 (mt-)的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-I進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；CC400-2 :以萊茵衣藻藻種 CC400 (mt-)的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-2進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；CC400-3 以萊茵衣藻藻種CC400 (mt-)的基因組DNA為模板，用 SpO和LAD-3進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；CC400_4 以萊茵衣藻藻種CC400 (mt-)的基因組DNA為模板，用SpO和LAD-4進行第一輪擴增，用Spl和 ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物；CC400-5 以萊茵衣藻藻種CC400 (mt-)的基因組DNA 為模板，用SpO和LAD-5-RMD227進行第一輪擴增，用Spl和ACl進行第二輪擴增的PCR擴增產物。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻種 CC400 (mt_),從美國杜克大學 (Chlamy center, http://www. chlamy. org/)購買。PSI103 質粒購自美國杜克大學(Chlamy center, http://www. chlamy. org/)； PSI103質粒中含有巴龍黴素抗性基因。正常TAP 培養液=NH4Cl 0. 4g/L ；MgS04 7H20 0. lg/L ；CaCl2 2H20 0. 05g/L ；K2HP040. 108g/L ；KH2P04 0 . 0 56g/L ;Trisbase 2. 423g/L ;亨特微量元素(Hunter，s traceelements) lml/L,冰乙酸 lml/L,其餘為水。固體TAP培養基在正常TAP培養液中加I. 5%的瓊脂粉。實施例I、各種突變體的獲得各種突變體均是將藻種CC400採用PSI103隨機插入方法獲得(Kindle，Journal ofApplied Phycology, Volume 6, Number 2, 231-238,1990)的，具體步驟如下(I)用限制性內切酶KpnI酶切PSI103質粒，得到線性化的質粒；(2)用玻璃珠法將線性化的質粒轉化萊茵衣藻藻種CC400(mt_)，在含有巴龍黴素的TAP培養基中進行篩選，得到若干抗巴龍黴素的突變株，即為突變體庫。(3)通過IMAGING-PAM在突變體庫中篩選Fv/Fm小於0. 5的突變株系，取其中的6 株突變體株系作為實施例3的實驗材料。FO :初始螢光，初始螢光是光系統II (PS II)反應中心處於完全開放時的螢光產量，它與葉片葉綠素濃度有關。Fm :最大突光產量(maximalfluorescence),是PS II反應中心處於完全關閉時的螢光產量，可反映經過PS II的電子傳遞情況，通常葉片經暗適應 20min後測得。Fv = Fm-FO :為可變螢光，反映了 QA的還原情況。Fv/Fm :是PS II最大光化學量子產量反映PS II反應中心內螢光能轉換效率或稱最大PS II的光能轉換效率，葉暗適應20min後測得；非脅迫條件下該參數的變化極小，不受物種和生長條件的影響，脅迫條件下該參數明顯下降。實施例2、TAIL-PCR引物設計在巴龍黴素基因的3』序列端設計特異性引物SpO和Spl，設計針對於萊茵衣藻的兼併引物LAD-5-RMD227，兼併引物中去除NotI酶切位點，降低引物合成成本。合成表I所示的各引物。其中LAD1、LAD2、LAD3、LAD4和LAD-5-RMD227均為兼併引物。表IPCR擴增所用弓I物序列
權利要求
1.序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、兼併引物和序列表的序列8所示DNA組成的引物組合物；所述兼併引物為針對萊茵衣藻的基因組DNA的兼併引物。
2.如權利要求I所述的引物組合物，其特徵在於所述兼併引物為序列表的序列7所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA或序列表的序列6所示DNA。
3.一種獲得萊茵衣藻突變體的基因組DNA中巴龍黴素編碼基因的插入位點的方法，包括如下步驟(1)提取萊茵衣藻突變體的基因組DNA；(2)以基因組DNA為模板，用序列表的序列I所示DNA和所述兼併引物作為引物進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產物；(3)以第一輪PCR擴增產物為模板，用序列表的序列2所示DNA和序列表的序列8所示 DNA作為引物進行第二輪PCR擴增，得到第二輪PCR擴增產物；(4)將第二輪PCR擴增產物進行測序，通過與野生型萊茵衣藻的基因組序列進行比對， 得到萊茵衣藻突變體的基因組DNA中巴龍黴素編碼基因的插入位點；所述萊茵衣藻突變體是在萊茵衣藻中導入PSI103質粒得到的突變體。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述第一輪PCR擴增的反應條件如下(1)93。。2分鐘；(2)95 0C I 分鐘；(3)940C 30 #, 680C I 分鐘，72°C 3 分鐘，11 個循環；(4)940C 30秒，25 0C 2分鐘，以0. 5度/秒的速度升溫至72 °C，72°C 3分鐘；(5)94。。20#,68°C I 分鐘，72°C 3 分鐘，26 個循環；(6)72 0C 5 分鐘。
5.如權利要求3或4所述的方法，其特徵在於所述第二輪PCR擴增的反應條件如下(1)94。。20#, 670C I 分鐘，72°C 3 分鐘，2 個循環；(2)940C 20 #, 680C I 分鐘，72°C 3 分鐘，94°C 20 秒，68°C I 分鐘，72°C 3 分鐘，94°C 20 秒，50 0C I分鐘，72 0C 3分鐘，14個循環；(3)72 0C 5 分鐘。
6.權利要求I或2所述引物組合物在獲得萊茵衣藻突變體的基因組DNA中巴龍黴素編碼基因的插入位點中的應用。
7.權利要求I或2所述的引物組合物在輔助鑑定萊茵衣藻的基因組DNA中各基因功能中的應用。
8.權利要求3或4或5所述方法在輔助鑑定萊茵衣藻的基因組DNA中各基因功能中的應用。
9.一種輔助鑑定萊茵衣藻的基因組DNA中各基因功能的試劑盒，包括PSI103質粒和權利要求I或2所述引物組合物。
全文摘要
本發明公開了一種用於擴增產氫微藻萊茵衣藻插入突變基因側翼序列的引物及方法。本發明提供了序列表的序列1、序列2所示DNA、兼併引物和序列表的序列8所示DNA組成的引物組合物；所述兼併引物為針對萊茵衣藻的基因組DNA的兼併引物。應用本發明提供的引物組合物可以獲得萊茵衣藻突變體的基因組DNA中巴龍黴素編碼基因的插入位點。本發明提供的方法，將設計的兩條特異性引物與TAIL-PCR所用的簡併引物進行組合，在優化的PCR反應條件下，可高效特異的擴增插入突變基因側翼序列。本發明對高通量克隆萊茵衣藻基因、研究基因功能具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102604937SQ20111002660
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月25日 優先權日2011年1月25日
發明者楊浩萌, 趙磊, 陳梅, 黃芳 申請人:中國科學院植物研究所