用於增強蛋白生產的基因盒的製作方法

2023-05-19 05:07:36 2

專利名稱：用於增強蛋白生產的基因盒的製作方法
本申請要求於2004年5月18日提交的美國臨時序列號60/571,943的優先權，所述臨時申請整體引入本文作為參考。
背景技術：
1.發明領域本發明涉及基因表達和蛋白生產和/或累積的增強。更具體而言，本發明涉及賦予蛋白抗生素抗性及增加的生產的基因盒。本發明提供了用於增強靶基因表達和編碼的蛋白或肽等的生產和/或累積的基因盒以及將其導入宿主細胞的方法，以及它們在生物系統中的用途。
2.發明背景開發用於生產重組蛋白的表達系統對於開發用於研究或治療需要的給定蛋白的來源是重要的。關於原核細胞例如大腸桿菌(E.coli)以及關於真核細胞的基因表達系統已被開發，所述真核細胞包括酵母(例如，糖酵母屬物種(Saccharomyces spp.)、畢赤氏酵母屬物種(Pichia spp.)以及克魯維氏酵母屬物種(Kluyveromyces spp.))和哺乳動物細胞。哺乳動物細胞中的基因表達通常優選用於生產治療蛋白，因為在此類表達系統中的翻譯後修飾可能比發生在微生物(原核)表達系統中的翻譯後修飾類型更類似於那些在哺乳動物中發現的。
細菌大腸桿菌(Escherichia coli)是通過提取前細胞內蛋白的表達和/或累積來生產異源重組蛋白的最常用原核宿主之一。為了增加效率並降低重組蛋白生產的成本，已付出相當大的努力以增加每單位體積每單位時間的蛋白生產量。因此，本領域需要開發能極大增加重組蛋白容積得率的工具。
幾種美國專利和研究論文總體上描述異源重組蛋白基因表達和重組蛋白生產的方面(參見例如，美國專利號6,596,514、6,271,207、6,096,505、5,658,763和5,089,397；Menzella等，Biotechnol Bioeng.2003，82(7)809-17；Chao等，Biotechnol Prog.2002，18(2)394-400；以及Bhandari等，J Bacteriol.1997，179(13)4403-6)。
美國專利號6,596,514公開了當存在於表達載體中時在穩定的細胞庫中能將真核細胞中重組蛋白的表達從2倍提高到8倍的核苷酸序列。美國專利號6,271,207描述了提高轉基因表達最高達3倍的基因轉移方法。美國專利號6,096,505公開了通過將三個單獨元件共轉染到哺乳動物宿主細胞內來生產重組蛋白的方法，在所述宿主細胞中所述元件可操作地連接，從而使得選擇標記基因的表達必然要求目的基因的共表達。美國專利號5,658,763公開了通過將DNA序列轉染整合到基因組中來達到增強蛋白生產的方法，所述蛋白由非天然基因構建體表達。美國專利號5,089,397描述了利用由DNA序列轉化的CHO細胞重組產生所需蛋白的表達系統，所述DNA序列含有可操作地連接的增強子，所述增強子能夠提升生產和/或賦予毒性抗性的基因的水平，這能影響整個系統的擴增。
Menzella等(Biotechnol Bioeng.2003，82(7)809-17)通過使用基因工程改造的BL21品系以允許在補料分批培養中有效利用乳糖作為誘導物來獲得重組蛋白生產(最高達16mg/L)。Chao等(Biotechnol Prog.2002，18(2)394-400)公開了當被構建以攜帶與araBAD啟動子融合的T7基因1.0的染色體拷貝時，異源基因在大腸桿菌品系BL21中的高水平表達。Bhandari等(J Bacteriol.1997，179(13)4403-6)報導了在大腸桿菌品系BL21中用NaCl作為T7基因1.0的誘導物，構建質粒以獲得鹽誘導的基因超表達和單個靶基因產物的超量產生。
然而，上述公開內容無一能提供以相當大的量增強蛋白包括重組蛋白生產的系統或方法。此外，此類系統可以在實體上(physically)或結構上與用於增強目的基因表達的靶基因或重組分子(例如，天然或重組分子)分開。
因此，本領域需要開發利用標準的工業上使用的宿主細胞以及其他非常規宿主極大地增加靶基因表達並增強蛋白包括重組蛋白生產的系統或方法。該需要首次通過本發明得到了滿足。
發明概述本發明涉及基因表達/激活以及蛋白生產和/或累積的增強。本發明提供了用於增強靶基因表達和編碼的蛋白或肽等的生產和/或累積的基因盒以及將其導入宿主細胞的方法，以及它們在生物系統中的用途。
在一個方面，本發明提供了增強蛋白表達的方法，所述方法包括(a)將基因盒轉移到宿主細胞內，其中所述基因盒包含SEQ IDNO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸；以及(b)在適當的生長條件下培養細胞，從而允許蛋白生產和/或累積。
在另一方面，本發明提供了重建用於生產重組蛋白的宿主細胞的方法，所述方法包括(a)將基因盒轉移到宿主細胞內，其中所述基因盒包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸；(b)導入包含用於表達重組蛋白的重組基因的載體；以及(c)在適當的生長條件下培養細胞，從而允許重組蛋白生產和/或累積。
在另一方面，本發明提供了增強重組蛋白生產的方法，所述方法包括(a)將基因盒轉移到宿主細胞內，其中所述基因盒包含SEQID NO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸；(b)將包含用於表達重組蛋白的重組基因的載體導入宿主細胞；以及(c)在適當的生長條件下培養細胞，從而允許重組蛋白生產和/或累積。
在另一方面，本發明提供了用於增強蛋白生產的基因盒，其中所述基因盒包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸。
還在另一方面，本發明提供了基因盒，其中所述基因盒包含與SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2具有至少90-95％的序列同一性的多核苷酸。
再在另一方面，本發明提供了基因盒，其中所述基因盒包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽與SEQ ID NO3具有至少90-95％的序列同一性。
在本發明的再一方面，基因盒被插入到宿主細胞的基因組中。例如，在大腸桿菌細胞的情況下，所述盒被插入到yjaG基因或galR基因中。
在另一方面，該基因盒在實體上或結構上不與攜帶重組蛋白基因的載體連接，例如，該基因盒在實體上或結構上不與質粒、粘粒、噬茵體或病毒連接。
除非另有說明，本文所使用的以其各種語法形式存在的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義相同的含義。儘管與本文所述的那些相類似的方法和材料可以用於本發明的實踐或測試中，但下文還是闡述了優選的方法和材料。在衝突的情況下，以本說明書包括定義為準。此外，材料、方法和實施例僅是舉例說明的且不是限制性的。
本發明的進一步的特徵、目的和優點在隨後的權利要求和詳述中是顯而易見的。然而，應當理解，該詳述和具體實施例，儘管顯示本發明的優選方面，但僅為了舉例說明而給出，因為對於本領域技術人員而言，本發明精神和範圍內的各種改變和修改根據本詳述將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1描述了野生型品系MG1655(圖1A)及其衍生(重組)品系SK100(圖1B)的總細胞蛋白的二維蛋白凝膠，所述衍生品系SK100包含2.4kb的Tn21盒。
圖2的凝膠照片顯示Ni-NTA柱純化後，在表達質粒pExp66中攜帶6His-MalE-HupA克隆的野生型BL21和SK101中重組蛋白6His-MalE-HupA的表達概況。
圖3描述了以毫克/升相等細胞內容物的培養物體積形式表示的從BL21和SK101品系分離出的重組6His-MalE-HupA蛋白總量的圖示。
圖4的凝膠照片顯示Ni-NTA柱純化後，在載體pET15b中包含脫水酶基因的野生型BL21和SK101中6-His-碳酸酐酶的表達。
圖5的凝膠照片顯示在BL21和SK101品系的粗細胞裂解物中人抗-TAC VH蛋白表達。
圖6顯示了由pGFPuv質粒產生的GFPuv的比螢光強度的時程，所述pGFPuv質粒被導入到BL21和SK101品系中。
圖7的凝膠照片描述了野生型品系(MG1655)、在染色體的yjaG基因中包含2.4kb的Tn21盒的抗生素抗性重組品系(SK100)、在染色體的yjaG基因中只包含aadA1基因的抗生素抗性重組品系(SK102)以及在染色體的galR基因中包含aadA1基因的抗生素抗性重組品系(SK103)的總細胞蛋白概況。
圖8是如圖7中所述以μg/100ml包含約等量細胞的培養物體積表示的野生型和抗生素抗性重組品系的總細胞蛋白含量的圖示。
發明詳述定義表達載體術語「表達載體」是指已經過插入或整合蛋白或多肽基因序列處理的本領域已知的質粒、病毒或其他載體。使得載體適合增殖的這種DNA元件可以是在原核或真核細胞中起作用的複製起點。在原核細胞起作用的複製起點的實例有colE1 ori。重組載體還需要用於控制這些生物生長的選擇標記。適當的選擇標記包括當在細胞中作為蛋白表達時保護生物不受抗生素例如氨苄青黴素、鏈黴素、氯黴素的影響(抗生素抗性)，或在缺少化合物的環境條件(營養缺陷型生長條件)下提供生長的基因。
如本文所使用的，術語「表達」是指基因產物的生物合成。例如，在結構基因的情況下，表達涉及將結構基因轉錄成mRNA以及將mRNA翻譯成一個或多個多肽。
術語「克隆載體」是指在宿主細胞中具有自主複製能力的核酸分子，例如，質粒、粘粒或噬菌體。克隆載體一般包含(i)一個或少數限制性內切核酸酶識別位點，在所述位點上可以以可測定的方式插入外來DNA序列而不喪失載體的基本生物學功能，以及(ii)適合用於鑑定並選擇用克隆載體轉化或轉染的細胞的標記基因。標記基因包括提供例如四環素抗性或氨苄青黴素抗性的基因。
重組蛋白的表達重組表達載體包括編碼蛋白的合成的或cDNA-衍生的DNA片段，所述DNA片段與適當的衍生自哺乳動物、病毒或昆蟲基因的轉錄或翻譯調節元件可操作地連接。如本領域所述，此類調節元件包括轉錄啟動子、編碼適當的mRNA核糖體結合位點的序列以及控制轉錄和翻譯終止的序列。哺乳動物表達載體還可包括非轉錄元件，例如複製起點、與要表達的基因連接的適當的啟動子和增強子、其他5′或3′側翼非轉錄序列、5′或3′非翻譯序列例如必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點以及轉錄終止序列。還可整合賦予在宿主中複製的能力的複製起點以及促進轉化體識別的選擇基因。
當它們在功能上相互關聯時，DNA區為可操作地連接的。例如，如果它表達為參與多肽分泌的前體，則關於信號肽(分泌前導序列)的DNA與關於多肽的DNA可操作地連接；如果它控制序列的轉錄，則啟動子與編碼序列可操作地連接；或者如果它被這樣定位以便允許翻譯，則核糖體結合位點與編碼序列可操作地連接。一般地，可操作地連接是指鄰接的，且在分泌前導序列的情況下，鄰接且在讀框中。然而，在本發明的情況下，通過增強基因表達或通過增強蛋白生產，該基因盒與基因或攜帶目的基因的載體可以在實體上或結構上分開而仍然在功能上相關或可操作地連接。
通過病毒來源可以提供用於轉化脊椎動物細胞的表達載體中的轉錄和翻譯控制序列。例如，通常使用的啟動子和增強子來源於多瘤病毒(Polyoma)、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)以及人巨細胞病毒。病毒基因組啟動子、控制和/或信號序列可以用於驅動表達，前提是此類控制序列與所選擇的宿主細胞是相容的。可以如由Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.3280，1983)所公開的構建示例性的載體。非病毒的細胞啟動子也可以被利用(即，β-珠蛋白和EF-1α啟動子)，這取決於將在其中表達重組蛋白的細胞類型。
衍生自SV40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點、早期和晚期啟動子、增強子、剪接位點以及聚腺苷酸化位點，可以用於提供異源DNA序列表達所需的其他遺傳因子。早期和晚期啟動子是特別有用的，因為作為也包含SV40病毒複製起點的片段二者都易於從病毒獲得(Fiers等，Nature 273113，1978)。較小或較大的SV40片段也可以被利用，前提是包括從Hind III位點向位於病毒複製起點的BglI位點方向延伸的大約250bp的序列。
術語「可操作地連接」用於描述調節元件和基因或其編碼區之間的聯繫。即，基因表達一般置於某些調節元件的控制下，所述調節元件包括組成型或誘導型啟動子、組織特異性調節元件和增強子。此類基因或編碼區被稱為與調節元件「可操作地連接」或「有效地連接」或「可操作地關聯」，意思是該基因或編碼區受該調節元件的控制或影響。然而，當它們在功能上相互關聯或增強多肽生產時，DNA片段或基因可以被認為與另一基因或攜帶編碼多肽的基因的載體反式可操作地連接。
宿主細胞轉化的宿主細胞是已轉化或轉染了表達載體的細胞，所述表達載體利用重組DNA技術構建並且含有編碼重組蛋白的序列。取決於所選擇的DNA，被表達的蛋白優選分泌到培養物上清液中，但也可沉積在細胞膜中。
宿主細胞可以是培養的細胞、外植體、體內細胞等。宿主細胞可以是原核細胞，例如大腸桿菌，例如品系BL21，或真核細胞，例如酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞，例如Vero、CHO、HeLa及其他。
各種哺乳動物細胞培養系統也可用於表達重組蛋白。適當的哺乳動物宿主細胞系的實例包括由Gluzman(Cell 23175，1981)所述的猴腎細胞COS-7系，以及其他能夠表達合適載體的細胞系，包括，例如CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)、L細胞、C 127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK細胞系。
「細胞系」是指無限增殖的且可以經歷傳代的培養的細胞。傳代是指將培養的細胞從一個培養室移至另一個培養室，從而使得培養的細胞可以繁殖到下一代。
「重組宿主」可以是包含克隆載體或表達載體的任何原核或真核細胞。這個術語還包括經過基因工程改造以在宿主細胞染色體或基因組中包含克隆的基因的那些原核或真核細胞。
宿主細胞的製備和轉化幾種轉化方案是本領域已知的，並在Kaufman，R.J.，Meth.Enzymology 185537(1988)中被綜述。所選擇的轉化方案取決於宿主細胞類型和目的基因特性，並且可以基於常規實驗法進行選擇。任何此類方案的基本要求是首先將編碼目的蛋白的DNA導入到適當的宿主細胞中，並隨後鑑定且分離已以穩定的可表達的方式整合了異源DNA的宿主細胞。
一個導入異源DNA的常用方法是磷酸鈣沉澱，例如，如由Wigler等所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567，1980)。通過這種方法導入到宿主細胞中的DNA經常經歷重排，從而使得這個方法可用於共轉染獨立的基因。
聚乙烯誘導的細菌原生質體與哺乳動物細胞的融合(Schaffner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772163，1980)是另一種導入異源DNA的有用方法。原生質體融合方案經常產生多個整合到哺乳動物宿主細胞基因組中的質粒DNA拷貝；然而，這個技術要求選擇和擴增標記與目的基因處於相同質粒上。
按照如Yu等(Yu等，Proc Natl Acad Sci U S A.2000，97(11)5978-83)描述的方法，可以以線性DNA的形式將基因盒或基因片段導入染色體中。
例如，如Potter等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.817161，1988)或Shigekawa和Dower(BioTechniques 6742，1988)所述，還可以利用電穿孔將DNA直接導入到宿主細胞的細胞質中。與原生質體融合不同，電穿孔不要求選擇標記和目的基因處於相同質粒上。
最近，用於將異源DNA導入到哺乳動物細胞中的幾種試劑已得到描述。這些試劑包括LipofectinRTM試劑和LipofectamineTM試劑(Gibco BRL，Gaithersburg，Md.)。這兩種試劑都是商業上可獲得的用於形成脂質-核酸複合物(或脂質體)的試劑，當應用於培養的細胞時所述試劑促進細胞攝入核酸。
擴增目的基因的方法同樣是重組蛋白表達所需要的，並且一般包括使用選擇標記(綜述於Kaufinan，R.J.，見上)。對細胞毒性藥物的抗性是最經常用作選擇標記的特性，並且可以是顯性性狀(例如，能夠不依賴於宿主細胞類型而使用)或隱性性狀(例如，用於對任何被選擇的活性都缺陷的特殊宿主細胞類型)的結果。幾種可擴增的標記均適用於本發明的表達載體(例如，如Maniatis，MolecularBiologyA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1989；pages 16.9-16.14所述)。
本領域已知的有用的調節元件也可包括在用於轉化哺乳動物細胞的質粒中。本文所選取的轉化方案以及所選擇使用的元件將取決於所使用的宿主細胞類型。本領域技術人員知道許多不同的方案和宿主細胞，並可以基於其細胞培養系統的需要來選擇合適的用於表達所需蛋白的系統。
術語「轉化的細胞」是指已通過例如重組DNA技術或病毒向其中(或向其前代或祖先)導入編碼本發明多肽的核酸分子的細胞。
轉座子Tn21轉座子Tn21是在質粒NR1(R100)中發現並從弗氏志賀氏菌品系(Shigella flexneri strain)(Nakaya等，Biochem.Biophys.Res.Commun.3654-659，1960)中分離出的約20kb的核酸分子(GenBank位置AF071413)(Nisen等，J.Mol.Biol.117975-998，1977)。Tn21是包含緊密相關元件的Tn3家族的亞組，所述元件主要負責革蘭氏陰性細菌中的多重抗生素抗性。Tn3家族的轉座因子可能是細菌中最成功的可移動DNA元件組存在許多不同但相關的成員並廣泛分布在革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌中。在腸桿菌科(Enterobacteriaceae)家族成員中許多編碼多重抗生素抗性的轉座子屬於Tn21亞組。已知轉座子Tn21賦予對鏈黴素、壯觀黴素、Sulfadimine、汞(Mercury)和卡那黴素的抗性(de la Cruz，F.，和J.Grinsted.J Bacteriol.151222-228，1982)。在轉座子Tn21及其許多最接近的相關物中攜帶被稱為整合子的潛在地獨立移動的DNA元件。該整合子編碼RecA-非依賴性的、位點特異的整合系統，所述整合系統負責獲得編碼抗生素抗性基因的被稱為基因盒的多個小移動元件。
基因盒術語「基因盒」是指包含下列物質的盒核酸分子(參見例如，SEQ ID NO.1)、氨基糖苷腺苷醯轉移酶(aadA1)基因(參見例如，SEQ ID NO.2，GenBank登錄號NC_003292，區36072-36863)、轉座子Tn21基因的衍生物、同源分子或其片段，所述盒可以被導入(例如，通過轉化或電穿孔)宿主細胞(原核的或真核的)以用於增強靶基因(例如，天然或重組分子)表達並增強編碼的蛋白或多肽的生產和/或累積。術語「基因盒」也指編碼包含氨基糖苷腺苷醯轉移酶活性的蛋白(參見例如SEQ ID NO.3，GenBank蛋白ID.NP 511224.1(aadA1))的核酸分子、其同源分子或片段。「基因盒」也可以賦予宿主細胞對氨基糖苷類抗生素例如壯觀黴素或鏈黴素的抗性。
如本文所使用的，「靶基因」是指被表達的基因，在其中基因表達水平或基因產物活性的調節增強其編碼的蛋白或多肽的生產和/或累積。靶基因可以是宿主細胞的天然基因或被導入細胞的重組分子。
一般而言，術語「基因」是指基因組上能夠被轉錄為RNA的區域，所述RNA具有調節功能、催化功能和/或編碼蛋白。真核基因一般具有內含子和外顯子，它們可以組織為產生不同的RNA剪接變體，所述變體編碼可變形式的成熟蛋白。熟練的技術人員將理解本發明包含了可以被發現的所有靶基因編碼的轉錄物，包括剪接變體、等位基因變體和由於可變啟動子位點或可變聚腺苷酸化位點而發生的轉錄物。因此「全長」基因或RNA包含任何自然發生的剪接變體、等位基因變體、其他可變轉錄物、通過重組技術產生的具有與自然發生的變體相同功能的剪接變體，以及由此產生的RNA分子。基因包括aadA1的「片段」，可以來自基因的任何部分，所述片段可代表或不代表功能結構域，例如催化結構域、DNA結合結構域等。片段可優選包括編碼至少25個鄰接胺基酸，且優選至少約30、40、50、60、65、70、75或更多鄰接胺基酸或在那附近或那之間的任何整數的核苷酸序列。
如下文所述，本發明的核酸分子，例如aadA1基因或其子序列，可以被插入到載體中，這將促進靶基因的表達。因此，包含本發明核酸的載體、用這些載體轉染的細胞、所表達的多肽以及所產生的針對整個多肽或其抗原性片段的抗體，是在本發明方面中的。
「被分離的DNA分子」是指已經從生物的染色體或基因組DNA中分離出的DNA片段。分離也定義為暗示與最初來源或環境分離的程度。例如，編碼aadA1基因的克隆的DNA分子是被分離的DNA分子。被分離的DNA分子的另一實例是沒有整合到生物基因組DNA中的化學合成的DNA分子或酶促生成的cDNA。可以對被分離的DNA分子實施本領域已知的方法以去除汙染物，從而使得該DNA分子被認為是純化的，即，接近更均一的狀態。
取決於情況，「被分離的核酸分子」可以指從基因或基因片段的5′和3′編碼序列中分離出的核酸分子，所述序列在生物自然發生的基因組中是鄰接的。術語「被分離的核酸分子」還包括非自然發生的核酸分子，例如，通過重組DNA技術生成的核酸分子。
術語「互補DNA」(cDNA)，通常被稱為「拷貝DNA(copyDNA)」，是通過逆轉錄酶從mRNA模板形成的單鏈DNA分子。一般地，利用與mRNA部分互補的引物啟動逆轉錄。本領域的技術人員也用術語「cDNA」指包含此類單鏈DNA分子及其互補DNA鏈的雙鏈DNA分子。
「核酸」是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。這個術語包括含有已知的核苷酸類似物或被修飾的主鏈殘基或鍵的核酸，所述核酸是合成的、自然發生的以及非自然發生的，所述核酸具有與參考核酸相似的結合特性，並且所述核酸以與參考核苷酸相似的方式進行代謝。此類類似物的實例包括，但不限於，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基化核糖核苷酸和肽-核酸(PNAs)。
除非另有說明，具體的核酸序列也含蓄地包括其保守修飾的變體(例如，簡併密碼子置換)和互補序列，以及明確說明的序列。具體地，通過產生這樣的序列可以實現簡併密碼子置換，在所述序列中一個和多個被選擇的(或所有的)密碼子的第三個位置被適當的混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基置換(Batzer等，Nucleic Acid Res，19081，1991；Ohtsuka等，J Biol.Chem.，2602600-2608，1985；Rossolini等，Mol.Cell Probes，891-98，1994)。術語核酸可以與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。
在兩個核酸或多肽序列上下文中的術語「序列同一性」包括提及當在具體的比較窗口以最大一致性比對時在兩個序列中相同的殘基，並可以考慮添加、缺失和置換。當序列同一性的百分比用於提及蛋白時，應當認識到不同一的殘基位置通常差別在於保守胺基酸的置換，其中用胺基酸殘基置換其他具有相似化學特性(例如，電荷或疏水性)的胺基酸殘基並因此不會不利地改變分子的功能特性。
如本文所述，序列同一性的百分比是指通過在比較窗口比較兩個最佳比對的序列而測定的值，其中對於兩個序列的最佳比對，與參考序列(它不包含添加、置換或缺失)相比，比較窗口中的多核苷酸序列部分可以包含添加、置換或缺失(即缺口)。通過如下方法來計算百分比，測定這樣的位置數目，在所述位置上相同的核酸鹼基或胺基酸殘基出現在兩個序列中以產生匹配的位置數目，用比較窗口中的位置總數目去除匹配的位置數目，並將結果乘以100以得出序列同一性的百分比。
在多核苷酸上下文中以其各種語法形式存在的術語「同源的」是指利用所述比對程序之一使用標準參數與參考序列相比較，多核苷酸包含具有所需同一性的序列，所述同一性例如至少60％的同一性，優選至少70％的序列同一性，更優選至少80％，再更優選至少90％並且甚至更優選至少95％。技術人員將認識到，通過考慮密碼子簡併性、胺基酸相似性、讀框定位等，可以適當調整這些值以測定由兩個核苷酸序列所編碼的蛋白的相應同一性。用於這些目的的胺基酸序列的相當大同一性通常指序列同一性為至少60％、更優選至少70％、80％、90％，並甚至更優選至少95％。
如果兩個分子在嚴格的雜交條件下互相雜交，則核苷酸序列也可以是基本上同一的。然而，如果它們編碼的多肽是基本上同一的，則在嚴格的雜交條件下不互相雜交的核酸仍然是基本上同一的。例如，當利用遺傳密碼所允許的最大的密碼子簡併性產生核酸拷貝時，這種情況就會發生。兩個核酸序列是基本上同一的一個指示是第一個核酸編碼的多肽與第二個核酸編碼的多肽有免疫學交叉反應，儘管此類交叉反應性不是認為兩個多肽基本上同一所必需的。
在Tiissen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，「Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)中可以找到關於核酸雜交的詳盡指導。示例性的嚴格雜交條件可以如下所述，例如50％甲醯胺，5x SSC和1％SDS，於42℃溫育，或5x SSC和1％SDS，於65℃溫育，伴隨於65℃在0.2x SSC和0.1％SDS中洗滌。可替代的條件包括，例如，至少與於68℃雜交20小時，隨後在2x SSC、0.1％SDS中洗滌，於55℃兩次30分鐘和於60℃三次15分鐘一樣嚴格的條件。另一可替代的條件設定為於約45℃在6x SSC中雜交，隨後於50-65℃在0.2x SSC、0.1％SDS中洗滌一次或多次。關於PCR，約36℃的溫度對於低嚴格性擴增是代表性的，儘管依賴於引物的長度，退火溫度可以在約32℃和48℃之間變動。對於高嚴格性PCR擴增，約62℃的溫度是代表性的，儘管取決於引物的長度和特異性，高嚴格性的退火溫度可以為約50℃到約65℃。關於高和低嚴格性擴增的一般循環條件包括90℃-95℃30秒-2分鐘的變性階段、持續30秒-2分鐘的退火階段以及約72℃1-2分鐘的延伸階段。
在數值和範圍上下文中的術語「約」或「大約」是指近似或接近於所列舉的值或範圍的值或範圍，從而使得本發明可以如技術人員從本文所含教導可以看出的那樣預期執行，例如在反應混合物中具有所需的核酸或多肽量。這至少部分是由於核酸組合物的變化特性、年齡、種族、性別、解剖學和生理學變量以及生物系統的不精密性。因此，這些術語包含由系統誤差產生的那些值以外的值。
本發明提供了基因盒，當轉移至宿主細胞，例如細菌細胞例如大腸桿菌時，所述基因盒誘導蛋白的生產和累積的增強。更具體地，該基因盒(轉座子Tn21的衍生物)賦予對氨基糖苷類抗生素例如壯觀黴素和鏈黴素的抗性。此外，該基因盒在受體(recepient)細胞內引起蛋白(細胞的、天然的和/或重組的)的增加。
當轉移至宿主細胞，例如原核細胞例如大腸桿菌品系BL21時，該基因盒以約5-約200倍或更多倍增加蛋白的生產。
依照本領域已知方法(例如，Yu等(Yu等，Proc Natl Acad SciU S A.2000，97(11)5978-83)，可以以線性DNA的形式將該基因盒或基因片段導入到宿主細胞的染色體中。依照類似方法還可以完成染色體中的所有後續插入。
根據本發明，通過導入該基因盒而增加的蛋白生產不受宿主細胞特性、載體、誘導系統、蛋白特性、用於將基因盒導入染色體中的方法或基因盒在染色體中的位置的限制。
本發明還提供了重建用於增加蛋白得率的宿主細胞例如細菌細胞(例如，大腸桿菌)的方法。
通過將基因盒(例如Tn21基因盒)導入到疫苗品系基因組中增加重組保護性抗原/蛋白的生產，本發明可以用於增強活的或減毒疫苗載體/品系的功效、潛能和免疫原性。
本文所公開的基因盒、方法和/或系統提供了超過本領域當前使用的標準或常規品系的明顯優點。優點包括增強產物得率、減少培養體積、更快的處理以及更低的生產成本。結果證明與在等基因的親本品系中觀察到的表達水平成對比，在本發明攜帶基因盒的品系中蛋白表達水平顯著增加(參見圖1-8)。因此，根據本發明的基因盒、方法和/或系統顯然為在製藥學和生物技術應用中的成功實施提供了增加的生產率和更少的處理時間的優點。
本發明提供了基因盒，當轉移至大腸桿菌品系時，所述基因盒誘導天然和/或重組蛋白生產和/或累積的激活/增強。將從轉座子Tn21(GenBank登錄號NC_003292)獲得的2.4Kb DNA盒插入大腸桿菌K12品系(MG1655和W3110)和大腸桿菌B品系(BL21)的yjaG基因中，所述基因盒賦予對氨基糖苷類抗生素例如壯觀黴素和鏈黴素的抗性。導入這個基因盒後，細胞中的總細胞蛋白含量有急劇的增加。圖1顯示了來自親本品系(MG1655)及其包含抗生素抗性盒的衍生品系(SK100)的二維蛋白凝膠概況。對來自等量細菌細胞的提取物分析它們的總蛋白含量。通過Bradford方法偶聯二維凝膠分析的總蛋白評價顯示SK100中總細胞蛋白含量相對於MG1655有5-10倍的增加。
研究了這個基因盒對細胞中重組蛋白表達的作用。為了這個目的利用了工業上通常用於生產外來蛋白的宿主大腸桿菌B，品系BL21，及其包含抗生素抗性盒的衍生品系(SK101)。選擇編碼6His-MalE-HupA融合蛋白的基於噬茵體T7的表達質粒作為模型重組蛋白，以證實來自兩種品系的表達水平的差異。圖2舉例說明了SK101的澄清裂解液以及純化級分中重組蛋白的累積和得率的相對於BL21中的顯著增加。圖3描述了來自SK101和BL21這兩種品系的重組蛋白總容積得率的定量評估。最終純化後，來自SK101品系的得率是來自BL21品系的得率的約140倍。在最高水平的表達系統中，重組蛋白的最大得率佔總細胞蛋白的20-30％。在SK101中，重組蛋白得率超過總細胞蛋白的60％。另一顯著特徵是，儘管重組蛋白的最終得率極大增加，但該蛋白還是保持其可溶性和功能活性，並且沒有聚集成無活性的內含體。
為了證實增加的蛋白得率不是對任何特別的啟動子或重組基因特異的，還測試了包含不同啟動子和不同重組基因的其他表達質粒。圖4和圖5中顯示了兩個此類實例。圖4顯示了來自SK101和BL21宿主細胞的大腸桿菌碳酸酐酶的總得率。圖5顯示了同樣來自SK101和BL21這兩種品系的人抗-TAC VH蛋白的得率。在每種情況下，SK101中的蛋白得率顯然更高，從而證實該基因盒或系統在增強重組蛋白生產中的潛在普遍性。在人抗-TAC VH蛋白的情況下，BL21中有少量至沒有蛋白表達，表明在目前使用的系統中非細菌蛋白表達的先天困難。因此，該盒的導入不僅巨大地增加了所表達蛋白的得率，還減輕了某些難控制的外來蛋白合成中的表達阻斷。
除了最終得率之外，重組蛋白的合成速率對於提高生產率並降低生產成本也是關鍵的。研究了基因盒系統對重組蛋白生產動力學的作用。圖6顯示BL21和SK101背景中的綠色螢光蛋白(GFPuv)合成的比速率。這個研究證實整合了該基因盒的系統中外來重組蛋白的合成速率也比常規品系中的速率更快。
儘管大多數實驗在BL21的衍生品系中進行，但通過本領域已知的簡單的基因技術也可以將該基因盒轉移至任何宿主細胞，包括大腸桿菌品系。因此，該基因盒系統的應用不受宿主、表達載體或誘導方法選擇的限制。
該基因盒的進一步研究揭示792bp的aadA1基因主要負責增加蛋白的生產。圖7顯示了包含完整的2.4kb基因盒的品系(SK100)(左起第3個泳道)、在染色體的相同位置處(在yjaG基因上)包含792bp的aadA1基因的品系(SK102)(左起第4個泳道)以及在染色體的不同位置處(在galR基因上)包含aadA1基因的品系(SK103)(左起第5個泳道)的總細胞蛋白概況。與野生型品系(MG1655)(左起第2個泳道)相比，包含完整的2.4kb盒的品系(SK100)和只包含792bp的aadA1基因的品系(SK102和SK103)中的總細胞蛋白含量都更高。包含完整基因盒的品系(SK100)產生的蛋白含量略高於只包含792bp的aadA1基因的品系(SK102和SK103)(參見圖8)。結果同樣顯示aadA1基因在染色體上的位置不是關鍵的，因為當被插入yjaG基因中或galR基因中時它對細胞蛋白含量有著幾乎相同的作用(參見圖8)。
通過下列實施例進一步描述本發明，所述實施例不以任何方式限制本發明。
實施例實施例I基因盒誘導的總細胞蛋白含量的增加。
將從轉座子Tn21(參見SEQ ID NO.1)獲得的2.4Kb DNA盒插入大腸桿菌K12品系(MG1655)和大腸桿菌B品系(BL21)的yjaG基因中。大腸桿菌細胞生長直到對數期中期(OD600nm-0.5)並從細胞中提取總蛋白。將來自相等OD的培養物的蛋白加載在凝膠上。分析來自等量細菌細胞的提取物的總蛋白含量。通過Bradford方法偶聯二維凝膠分析評價總蛋白。在包含2.4kb Tn21盒的品系中，對於多數蛋白，單個蛋白斑點的強度極大地增加。結果顯示SK100中總細胞蛋白含量相對於MG1655有5-10倍的增加(參見圖1)。由於加載在凝膠上的蛋白取自相等數目的野生型和重組細胞，所以這個實驗顯示在重組品系SK100中大部分細胞蛋白表達水平升高。圖1顯示了來自親本品系(MG1655)及其包含抗生素抗性盒的衍生品系(SK100)的二維蛋白凝膠概況。
實施例II基因盒對重組蛋白表達的作用。
大腸桿菌B，品系BL21，與其包含基因盒的衍生品系(SK101)一起使用。選擇編碼6His-MalE-HupA融合蛋白的基於噬菌體T7的表達質粒作為模型重組蛋白，以證實來自兩種品系的表達水平的差異。用重組克隆轉化BL21和SK101細胞後，將細胞用1mM IPTG在37℃誘導3小時。在誘導(I)後以及同樣在Ni-NTA柱純化(P)後的總細胞裂解液中檢查重組蛋白的表達。結果顯示在包含Tn21盒的SK101品系中重組蛋白的表達水平急劇增加(參見圖2)。來自這兩種品系(BL21和SK101)的重組蛋白的總容積得率的定量評價顯示來自SK101的得率為來自BL21的得率的約140倍(參見圖3)。
實施例III基因盒誘導的6-His-碳酸酐酶增強的表達。
測定了SK101和BL21中大腸杆茵碳酸酐酶的生產。通過1mMIPTG在37℃誘導重組蛋白生產3小時。在加載用於凝膠電泳之前利用Ni-NTA柱純化重組蛋白。這個實驗顯示在包含Tn21盒的SK101品系中6-His-碳酸酐酶的表達水平增加(參見圖4)。這個實驗還證實了該基因盒在包含Tn21盒的SK101品系中誘導增強的重組蛋白表達的普遍性，所述重組蛋白包括6-His-碳酸酐酶和6His-MalE-HupA(參見圖3和圖4)。
實施例IV基因盒誘導的真核蛋白增強的表達。
測定了BL21和SK101品系中人抗-TAC VH蛋白的表達。蛋白用1mM IPTG誘導3小時並將全部細胞裂解液加載到凝膠上以測定重組蛋白的表達。SK101中的蛋白得率顯然較高，從而證實該基因盒在誘導增強的重組蛋白生產中的潛在普遍性。在人抗-TAC VH蛋白的情況下，BL21中有少量至沒有蛋白表達(參見圖5)，從而表明工業上當前使用的品系BL21中非細菌蛋白表達的先天困難。因此，該基因盒的導入不僅巨大地增加了所表達蛋白的得率，而且還減輕了某些難控制的外來蛋白合成中的表達阻斷。這個實驗還證實攜帶基因盒的細胞中重組蛋白增加的生產不限於細菌蛋白，真核蛋白也可以更高水平被表達。
實施例V體內蛋白生產的動力學。
在用pGFPuv質粒轉化的BL21和SK101品系中研究了基因盒系統對重組蛋白生產動力學的作用。測定了BL21和SK101背景中的綠色螢光蛋白(GFPuv)合成的比速率。這個實驗結果顯示在包含Tn21盒的SK101品系中體內蛋白生產的動力學更高。來自BL21和SK101品系中的轉化的pGFPuv質粒的比螢光強度的時程顯示在重組品系SK101中以更快的速率生產蛋白(參見圖6)。該實驗證實含基因盒的系統中重組蛋白的合成速率也比常規品系中的速率更快。
實施例VI由792bp片段，aadA1基因誘導的增強的表達。
將從轉座子Tn21(參見SEQ ID NO1)獲得的2.4Kb基因盒，以及2.4Kb基因盒的792bp片段(aadA1基因，SEQ ID NO2)插入大腸桿菌K12品系(MG1655)和大腸桿菌B品系(BL21)的yjaG基因中。還將792bp片段插入大腸桿菌B品系(BL21)的galR基因中。大腸桿菌細胞生長直到對數期中期(OD600nm0.5)並從細胞中提取總蛋白。將來自相等OD的培養物的蛋白加載在凝膠上。分析來自等量細菌細胞的提取物的總蛋白含量。圖7顯示了包含被插入到大腸桿菌染色體yjaG基因中的完整的2.4kb基因盒的品系(SK100)(左起第3個泳道)、包含被插入到大腸桿菌染色體yjaG基因中的792bp的aadA1基因的品系(SK102)(左起第4個泳道)、包含被插入到大腸桿菌染色體galR基因中的792bp的aadA1基因的品系(SK103)(左起第5個泳道)、野生型品系(MG1655)(左起第2個泳道)的總細胞蛋白概況。包含2.4kb盒或792bp的aadA1基因的品系(品系SK100、SK102和SK103)中的總細胞蛋白含量高於野生型(WT)品系的含量(參見圖8)。再次，包含完整的2.4kb盒的品系(SK100)產生的蛋白含量略高於只包含aadA1基因的品系(SK102和SK103)(參見圖8)。結果顯示基因盒(例如792bp的aadA1基因)在宿主細胞(例如，BL21衍生的SK102或SK103)染色體上的插入位置可以改變。例如，在宿主染色體的yjaG基因或galR基因中包含基因盒的品系SK102和SK103產生約相同量的細胞蛋白含量(參見圖8)。
應當理解該說明書、具體實施例和數據儘管顯示了示例的實施方案，但卻是為了舉例說明而給出的並且不預期限制本發明。根據本文所包含的討論、公開內容和數據，本發明內的各種改變和修改對於技術人員將是顯而易見的，並因此被認為是本發明的一部分。
序列表SEQ ID NO.1包括792bp aadA1基因(以粗體顯示)的2,435bp基因盒。以粗體顯示的部分是aadA1基因的編碼序列(IncN質粒R46，完整序列登錄號NC_003292，區域36072-36863)。
1 ACGCGATATC GAGCTGATAA AAGGGATCCA TCAGGCAACG41 ACGGGCTGCT GCCGGCCATC AGCGGACGCA GGGAGGACTT81 TCCGCAACCG GCCGTTCGAT GCGGCACCGA TGGCCTTCGC121 GCAGGGGTAG TGAATCCGCC AGGATTGACT TGCGCTGCCC161 TACCTCTCAC TAGTGAGGGG CGGCAGCGCA TCAAGCGGTG201 AGCGCACTCC GGCACCGCCA ACTTTCAGCA CATGCGTGTA241 AATCATCGTC GTAGAGACGT CGGAATGGCC GAGCAGATCC281 TGCACGGTTC GAATGTCGTA ACCGCTGCGG AGCAAGGCCG321 TCGCGAACGA GTGGCGGAGG GTGTGCGGTG TGGCGGGCTT361 CGTGATGCCT GCTTGTTCTA CGGCACGTTT GAAGGCGCGC401 TGAAAGGTCT GGTCATACAT GTGATGGCGA CGCACGACAC441 CGCTCCGTGG ATCGGTCGAA TGCGTGTGCT GCGCAAAAAC481 CCAGAACCAC GGCCAGGAAT GCCCGGCGCG CGGATACTTC521 CGCTCAAGGG CGTCGGGAAG CGCAACGCCG CTGCGGCCCT561 CGGCCTGGTC CTTCAGCCAC CATGCCCGTG CACGCGACAG601 CTGCTCGCGC AGGCTGGGTG CCAAGCTCTC GGGTAACATC641 AAGGCCCGAT CCTTGGAGCC CTTGCCCTCC CGCACGATGA681 TCGTGCCGTG ATCGAAATCC AGATCCTTGA CCCGCAGTTG721 CAAACCCTCA CTGATCCGCA TGCCCGTTCC ATACAGAAGC761 TGGGCGAACA AACGATGCTC GCCTTCCAGA AAACCGAGGA801 TGCGAACCAC TTCATCCGGG GTCAGCACCA CCGGCAAGCG841 CCGCGACGGC CGAGGTCTTC CGATCTCCTG AAGCCAGGGC881 AGATCCGTGC ACAGCACCTT GCCGTAGAAG AACAGCAAGG921 CCGCCAATGC CTGACGATGC GTGGAGACCG AAACCTTGCG961 CTCGTTCGCC AGCCAGGACA GCCCTGCCTC GACTTCGCTG1001 CTGCCCAAGG TTGCCGGGTG ACGCACACCG TGGAAACGGA1041 TGAAGGCACG AACCCAGTGG ACATAAGCCT GTTCGGTTCG1081 TAAGCTGTAA TGCAAGTAGC GTATGCGCTC ACGCAACTGG1121 TCCAGAACCT TGACCGAACG CAGCGGTGGT AACGGCGCAG1161 TGGCGGTTTT CATGGCTTGT TATGACTGTT TTTTTGGGGT1202 ACAGTCTATG CCTCGGGCAT CCAAGCAGCA AGCGCGTTAC1241 GCCGTGGGTC GATGTTTGAT GTTATGGAGC AGCAACGATG1281 TTACGCAGCA GGGCAGTCGC CCTAAAACAA AGTTAAACAT1321 CATGAGGGAA GCGGTGATCG CCGAAGTATC GACTCAACTA1361 TCAGAGGTAG TTGGCGTCAT CGAGCGCCAT CTCGAACCGA1401 CGTTGCTGGC CGTACATTTG TACGGCTCCG CAGTGGATGG1441 CGGCCTGAAG CCACACAGTG ATATTGATTT GCTGGTTACG1481 GTGACCGTAA GGCTTGATGA AACAACGCGG CGAGATTTGA1521 TCAACGACCT TTTGGAAACT TCGGCTTCCC CTGGAGAGAG1561 CGAGATTCTC CGCGCTGTAG AAGTCACCAT TGTTGTGCAC1601 GACGACATCA TTCCGTGGCG TTATCCAGCT AAGCGCGAAC1641 TGCAATTTGG AGAATGGCAG CGCAATGACA TTCTTGCAGG1681 TATCTTCGAG CCAGAAACGA TCGACATTGA TCTGGCTATC1721 TTGCTGACAA AAGCAAGAGA ACATAGCGTT GCCTTGGTAG1761 GTCCAGCGGC GGAGGAACTC TTTGATCCGG TTCCTGAACA
1801 GGATCTATTT GAGGCGCTAA ATGAAACCTT AACGCTATGG1841 AACTCGCCGC CCGACTGGGC TGGCGATGAG CGAAATGTAG1881 TGCTTACGTT GTCCCGCATT TGGTACAGCG CAGTAACCGG1921 CAAAATCGCG CCGAAGGATG TCGCTGCCGA CTGGGCAATG1961 GAGCGCCTGC CGGCCCAGTA TCAGCCCGTC ATACTTGAAG2001 CTAGACAGGC TTATCTTGGA CAAGAAGAAG ATCGCTTGGC2041 CTCGCGCGCA GATCAGTTGG AAGAATTTGT CCACTACGTG2081 AAAGGCGAGA TCACCAAGGT AGTCGGCAAA TAATGTCTAA2121 CAATTCGTTC AAGCCGACGC CGCTTCGCGG CGCGGCTTAA2161 CTCAAGCGTT AGATGCACTA AGCACATAAT TGCTCACAGC2201 CAAACTATCA GGTCAAGTCT GCTTTTATTA TTTTTAAGCG2241 TGCATAATAA GCCCTACACA AATTGGGAGA TATATCATGA2281 AAGGCTGGCT TTTTCTTGTT ATCGCAATAG TTGGCGAAGT2321 AATCGCAACA TCCGCATTAA AATCTAGCGA GGGCTTTACT2361 AAGCTTGCAT GCCCCTTAGG GCAGACCTGC GTGAGGCGGG2401 TGAGAGCAAT ATTGGTATAA TTTTTCAGCA ATAAG
SEQ ID NO.2aadA1核苷酸序列。
NC_003292.IncN plasmid R46，...[gi17530571]LOCUS NC_003292792bpDNADEFINITIONIncN plasmid R46，complete sequence.
ACCESSION NC_003292 REGION36072..36863VERSION NC_003292.1 GI17530571gene 1..792/gene＝″aadA1″/db_xref＝″GeneID1263126″CDS1..792/gene＝″aadA1″/protein_id＝″NP_511224.1″/db_xref＝″GI17530626″/db_xref＝″GeneID1263126″1ATGAGGGAAG CGGTGATCGC CGAAGTATCG ACTCAACTAT CAGAGGTAGT TGGCGTCATC61GAGCGCCATC TCGAACCGAC GTTGCTGGCC GTACATTTGT ACGGCTCCGC AGTGGATGGC121GGCCTGAAGC CACACAGTGA TATTGATTTG CTGGTTACGG TGACCGTAAG GCTTGATGAA181ACAACGCGGC GAGCTTTGAT CAACGACCTT TTGGAAACGT CGGCTTCCCC TGGAGAGAGC241GAGATTCTCC GCGCTGTAGA AGTCACCATT GTTGTGCACG ACGACATCAT TCCGTGGCGT301TATCCAGCTA AGCGCGAACT GCAGTTTGGA GAATGGCAGC GCAATGACAT TCTTGCAGGT361ATCTTCGAGC CAGCCACGAT TGACATTGAT CTGGCTATCT TGCTGACAAA AGCAAGAGAA421CATAGCGTTG CCTTGGTAGG TCCAGCGGCG GAGGAACTCT TTGATCCGGT TCCTGAACAG481GATCTATTTG AGGCGCTAAA TGAAACCTTA ACGCTATGGA ACTCGCCGCC CGACTGGGCT541GGCGATGAGC GAAATGTAGT GCTTACGTTG TCCCGCATTT GGTACAGCGC AGTAACCGGC601AGAATCGCGC CGAAGGATGT CGCTGCCGAC TGGGCAATGG AGCGCCTGCC GGCCAGTATC661AGCCCAGTCA TACTTGAAGC TAGACAGGCT TATCTTGGAC AAGAAGAAGA TCGCTTGGCC721TCGCGCGCAG ATCAGTTGGA AGAATTTGTT CACTACGTGA AAGGCGAGAT CACCAAGGTA781GTCGGCAAAT AASEQ ID NO.3aadA1蛋白序列。
NP_511224. aminoglycoside (3...[gi17530626]LOCUS NP_511224 263 aaDEFINITION aminoglycoside adenylyltransferase [IncN plasmid R46].
ACCESSION NP_511224VERSIONNP_511224.1 GI17530626CDS 1..263/gene＝″aadA1″/coded_by＝″NC_003292.136072..36863″/db_xref＝″GeneID1263126″1MREAVIAEVS TQLSEVVGVI ERHLEPTLLA VHLYGSAVDG GLKPHSDIDL LVTVTVRLDE61TTRRALINDL LETSASPGES EILRAVEVTI VVHDDIIPWR YPAKRELQFG EWQRNDILAG121IFEPATIDID LAILLTKARE HSVALVGPAA EELFDPVPEQ DLFEALNETL TLWNSPPDWA181GDERNVVLTL SRIWYSAVTG RIAPKDVAAD WAMERLPASI SPVILEARQA YLGQEEDRLA241SRADQLEEFV HYVKGEITKV VGK
權利要求
1.一種增強蛋白表達的方法，其包括(a)將基因盒轉移到宿主細胞中，其中所述基因盒包含SEQ IDNO.1和/或SEQ ID NO.2的多核苷酸；以及(b)在適當的生長條件下培養所述細胞，從而允許所述蛋白生產和/或累積。
2.一種重建用於生產重組蛋白的宿主細胞的方法，其包括(a)將基因盒轉移到所述宿主細胞中，其中所述基因盒包含SEQID NO.1和/或SEQ ID NO.2的多核苷酸；(b)導入包含用於表達所述重組蛋白的重組基因的載體；以及(c)在適當的生長條件下培養所述宿主細胞，從而允許所述重組蛋白生產和/或累積。
3.一種增強重組蛋白生產的方法，其包括(a)將基因盒轉移到宿主細胞中，其中所述基因盒包含SEQ IDNO.1和/或SEQ ID NO.2的多核苷酸；(b)將包含用於表達所述重組蛋白的重組基因的載體導入所述宿主細胞；以及(c)在適當的生長條件下培養所述細胞，從而允許所述重組蛋白生產和/或累積。
4.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述宿主細胞是原核細胞。
5.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
6.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述宿主細胞是BL21。
7.根據權利要求5或6的方法，其中所述基因盒被插入到所述宿主細胞的yjaG基因或galR基因中。
8.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述宿主細胞是真核細胞。
9.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒被插入到所述宿主細胞的基因組中。
10.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒賦予氨基糖苷類抗生素抗性。
11.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒賦予壯觀黴素抗性。
12.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒賦予鏈黴素抗性。
13.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒以約5-約200倍增強所述蛋白的生產和/或累積。
14.根據權利要求2或3的方法，其中所述基因盒在實體上或結構上不與所述載體連接。
15.根據權利要求2或3的方法，其中所述載體為質粒、粘粒、噬菌體或病毒。
16.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒包含與SEQID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少95％的序列同一性的多核苷酸。
17.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒包含與SEQID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。
18.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒包含編碼SEQ ID NO.3的多肽的多核苷酸。
19.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽與SEQ ID NO.3具有至少90％的序列同一性。
20.一種用於增強蛋白生產的基因盒，其中所述基因盒包含SEQID NO.1和/或SEQ ID NO.2的多核苷酸。
21.根據權利要求20的方法，其中所述基因盒包含與SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2具有至少95％的序列同一性的多核苷酸。
22.根據權利要求20的方法，其中所述基因盒包含與SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。
23.根據權利要求20的方法，其中所述基因盒包含編碼SEQ IDNO.3的多肽的多核苷酸。
24.根據權利要求20的方法，其中所述基因盒包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽與SEQ ID NO.3具有至少90％的序列同一性。
25.權利要求20的基因盒，其中所述盒賦予氨基糖苷類抗生素抗性。
26.權利要求20的基因盒，其中所述盒賦予壯觀黴素抗性。
27.權利要求20的基因盒，其中所述盒賦予鏈黴素抗性。
28.權利要求20的基因盒，其中所述盒以約5-約200倍增強所述蛋白的生產和/或累積。
29.權利要求20的基因盒，其中所述盒被插入到所述宿主細胞的基因組中。
30.權利要求20的基因盒，其中所述宿主細胞是原核細胞。
31.權利要求20的基因盒，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
32.權利要求20的基因盒，其中所述宿主細胞是BL21。
33.權利要求20的基因盒，其中所述宿主細胞是真核細胞。
34.權利要求20的基因盒，其中所述盒的執行不依賴於任何具體的載體類型、誘導系統或蛋白特性。
全文摘要
公開了用於基因表達和增強蛋白生產和/或累積的方法和組合物。本發明提供了用於增強靶基因表達和編碼的蛋白或肽等的生產和/或累積的基因盒以及將其導入宿主細胞的方法。
文檔編號C12N15/70GK1984995SQ200580023731
公開日2007年6月20日 申請日期2005年5月17日 優先權日2004年5月18日
發明者S·卡, S·L·阿迪亞 申請人:美國政府衛生與公眾服務部