杆狀病毒載體表達系統中蛋白質的表達的製作方法

2023-05-18 20:21:21 1

>樣品(hpi)V3降解的V3V8降解的V8044115139164.5191288306.5--++++++-----+++---+++++------+-『-』表示不能檢測到，』+』表示能檢測到在這一表中可以看到，在0和44hpi的樣品中，表位V3和V8仍然不能檢測到。這與E2-ELISA的結果對應良好。在115hpi以後的樣品中，檢測到了完整的E2，因為在E2帶檢測到了V3和V8。從191hpi以後，在凝膠上可見一較小的蛋白質的第二個帶。在兩個不同的印跡中V3和V8的免疫印跡表明降解產物含有V3表位，僅沒有V8表位。在印跡的任何其它地方都沒有檢測到V8，僅在完整的E2帶中檢測到了。這一測試清楚地表明E2蛋白質的降解是由於存在蛋白酶而發生的。事實上，這可能是大體積的E2抗原溶液的微過濾過程中觀察到的E2蛋白質含量的下降的原因。在這以後的過程中，在病毒失活開始之前除去細胞。所以，最可能的情況是，蛋白酶的存在引起了E2蛋白質的降解。7．MOI實驗的實施例目的目的是為了研究MOI(感染複數，每個細胞的病毒數)，最大細胞密度和E2的體積含量之間的關係。在一方面，在培養基耗盡之前整個細胞群體的感染必需完成，但另一方面，整個群體低細胞感染密度導致亞最佳蛋白質產量。物質和材料提到培養基，即指SF900Ⅱ培養基。在1000毫升的瓶中的444毫升SF900Ⅱ中稀釋76毫升細胞懸浮液並且輕輕混合。在即將稀釋培養物之前活細胞密度是3.41×106個細胞/毫升，死細胞密度是0.190×106，存活率是94.8％。稀釋後細胞的密度是±5×105個細胞/毫升。另外，加入的慶大黴素的最後濃度是10微克/毫升。將細胞懸浮液在250毫升的搖瓶中分成9個50毫升，過量的細胞丟棄。將第一個50毫升轉移到搖瓶1，最後的50毫升轉移到搖瓶5。1號和6號使用時MOI=0(空白)，2號和7號使用時MOI=0.000001，3號和8號使用時MOI=0.00001，4號和9號使用時MOI=0.0001，5號使用時MOI=0.001。如下製備病毒原液。稀釋的範圍是一個小瓶含有100倍稀釋的病毒懸浮液(小瓶含有0.8×105個噬斑形成單位(pfu)每毫升)。這一稀釋100倍的病毒原液製備如下。將總的種子病毒融化，在補充了10％的FBS的TC100培養基中稀釋100倍，以每份0.5毫升儲藏在-70℃。用3.6毫升SF900Ⅱ培養基將0.4毫升稀釋100倍的病毒溶液稀釋，得到稀釋倍數是10-1。將1毫升該溶液加入9毫升培養基，稀釋倍數是10-2，將1毫升該溶液加入9毫升培養基，稀釋倍數時10-3，將1毫升該溶液稀釋10倍，稀釋倍數是10-4。將3.1毫升培養基加入含有細胞培養物的搖瓶1號和6號(空白)。將10-2，10-3，10-4稀釋的3.1毫升病毒稀釋液分別加入搖瓶4和9，3和8，2和7。這些搖瓶中已經含有細胞培養物。在3.1毫升稀釋10-2的病毒稀釋液中，存在3.1×10-2×0.8×105=2.5×103個噬斑形成單位。在含有50毫升細胞懸浮液的搖瓶中，存在0.5×106×50=2.5×107個細胞。所以，在50毫升細胞懸浮液中加入3.1毫升稀釋10-2的病毒稀釋液得到的MOI是2.5×103/2.5×107=0.0001。對其它病毒稀釋液進行可比的計算，對加入50毫升細胞培養物的10-3和10-4稀釋倍數的病毒稀釋液得到的MOI數分別是0.00001和0.000001。最後在搖瓶5號加入2.85毫升10-1稀釋倍數的稀釋液，得到的MOI是0.00092而不是0.001。在加入病毒後馬上從每個搖瓶中取3.1毫升樣品。樣品中的細胞放入15毫升的Falcon試管在IECCentraGP8R離心機中離心(10分鐘1000rpm)。為了防止病毒從高MOI感染的細胞懸浮液轉移到低MOI感染的細胞懸浮液，取樣品是從低MOI到高MOI。在離心後，0.45微米過濾樣品(除去可能仍然存在於上清液中的細胞)，分在3個Nalgene冷凍小瓶中，儲藏在-70℃下，以備以後測試。在病毒加入後馬上確定搖瓶1和搖瓶5的細胞密度。這些是第一個和最後接種細胞的搖瓶。為細胞密度幾乎相同，所以假定所有搖瓶中的細胞密度等於兩個細胞計數的平均值。起初的活細胞密度是0.423×106個細胞/毫升，而0.012×106個細胞是死的，存活率為97.3％。將所有搖瓶放置於Labotech300有軌搖床平臺上，在28℃的室中以75rpm攪拌。在23，95，125，144，173和194hpi(感染後的小時)時，在所有瓶中取樣。確定細胞密度的樣品的體積是3.3毫升，其中的0.2毫升用於確定細胞密度。留下的3.1毫升如上t=0的樣品同樣操作。沒有計數的培養物的樣品的體積是3.1毫升。確定194hpi時的細胞密度，終止實驗。將留下的細胞懸浮液(約30毫升)以每份1毫升儲藏在3個Nalgene冷凍小瓶中，每份約6毫升的儲藏在4個15毫升的Falcon管中。結果和結論結果顯示在MOI和最佳細胞密度之間，更重要的是，在MOI和E2蛋白質產量之間存在良好的相關性。這可以在以MOI0.001感染培養物中E2蛋白質的最大體積產量設定為100％的圖中看到。圖中顯示E2蛋白質的體積產量隨著MOI的下降而提高。當MOI達到0.0001時，在可獲得的細胞密度達到最大之前細胞被感染了。利用MOI0.00001或更小產生的結果是在培養物的感染完成之前培養基耗盡了，導致蛋白質的產量亞最佳。所以，可以得出結論，假如在感染過程和E2生產完成之前培養基沒有耗盡，利用的MOI越低，E2蛋白質產量越高。表達bFSHα/或bFSHβ的重組杆狀病毒構建了轉移載體pDW-α-9.1和pDW-β-3.1。利用pDW-α-9.1或pDW-β-3.1和從細胞外病毒顆粒中分離的野生型(wt)AcNPV/MO21DNA共轉染SF21細胞(PCT申請WO96/25696)。分離表達β半乳糖苷酶的多角體陽性噬斑，通過ELISA分析培養基中bFSHα或bFSHβ的表達。將一個噬斑純化的bFSHα病毒(AcNPVα3.4)和一個噬斑純化的bFSHβ病毒(AcNPVβ1.4)用於製備TCID50分別為107和108的病毒原液。根據如上所述的方法生產FSH，結果生產水平在17到33微克/毫升之間。PD95實驗測定在一次接種後能夠保護95％(PD95)的接種的豬抵抗100LD50的強毒CSFV毒株Brescia的攻擊需要的E2的劑量(微克)。動物將26個無特異致病原(SPF)的，6-7星期大的豬任意分成三個每組8個豬的組(A-C)和一個2個豬的組(D)。動物關在ID-DLO的大容量設備的豬圈B18，B19，B20和B21中。讓動物馴化3天。每天在含有完全食物小丸(HopeFarms)的水槽中餵動物一次，並且可以任意從膠管中喝水。接種和攻擊如上製備三個雙倍油包水佐劑疫苗，每個具有的不同E2抗原的濃度是，32.0，8.0和2.0微克/劑。在左耳後2釐米肌肉內接種豬一次，每個豬接受一劑(A2微克E2，B8微克E2，C32微克E2，D0微克E2)。對照組D只接種DOE佐劑，崗哨豬完全沒有接種。接種後三個星期時，除了崗哨豬，每個動物接受100個50％致死劑量(=100VaLD50)的CSFV毒株Brescia456610的鼻內攻擊。即將攻擊之前，將崗哨豬從組中分隔出來，24小時後返回。接種物的病毒含量是從返回豬圈後取的樣品的效價確定的。臨床觀察動物護理人員每天檢測這些豬，記錄不正常的發現，如果需要，報告高級畜牧醫生。在餵食時間和清洗豬圈之前和期間，每個組每天至少觀察15分鐘。要注意組或個別動物減少進食的現象。在接種後的9天和攻擊後的20天時，記錄體溫(直腸)。在攻擊後分析血液在攻擊後0，2，4，7，10和14天時收集EDTA血樣，檢測白細胞和凝血細胞數的變化。在血液中白細胞數下降(白細胞減少)和凝血細胞數下降(凝血細胞減少)是CSF的典型信號之一。在普通的豬中白細胞和凝血細胞的正常細胞數的範圍是11-23×109個/升，和320-720×109個/升。對於SPF豬，同樣的值偏低，為6-12×109個/升和300-700×109個/升。在各個豬中，上面提到的兩個範圍是有變化的。血液細胞分析是利用MedonicCA570計數器進行的。白細胞減少和凝血細胞減少定義為細胞/血小板數比上面提到的最小數低得很多優選地時間一天以上，。病毒傳播/分泌和病毒檢測崗哨豬的體溫，白細胞和凝血細胞數和血清轉變是用於檢測病毒從接種動物轉移到崗哨動物中的參數。在mortem組織後，從下面的器官扁桃體，脾，腎和迴腸收集組織樣品，並且通過直接免疫螢光技術測試了病毒抗原的存在。固定來自這些組織樣品的低溫恆溫切片(4微米厚，每個器官兩個)，並且用多克隆豬抗瘟病毒FITC綴合的血清保溫。在洗滌後，在螢光顯微鏡下看切片。將結果表示為陽性(=有螢光)或陰性(=沒有螢光)。血清學應答在接種後0，2和3星期和死亡時，收集所有豬的血清。將樣品儲藏在-20℃，在病毒中和測試(VNT)和Ceditest，檢測CSF特異抗體的ELISA中進行測試。在微滴板系統中確定了血清中CSFV的中和抗體的效價。將血清的二倍系列稀釋液與等體積的含有30-300TCID50的CSFV(毒株Brescia)懸浮液混合。在37℃的CO2溫育器中溫育一個小時後，在每個孔中加入約25.000PK15細胞。在4天後，如上處理微滴平板，並在顯微鏡下觀察。將CSFV中和效價表示為中和所有病毒的最高稀釋度的倒數。統計學評估95％的保護劑量是根據CSFV中和Ab效價≥50代表完全保護者一假設確定的。結果這一部分的動物編號參見表1或2。在接種後的臨床觀察接種對豬沒有任何不利的影響，進食和體溫都仍然正常。在接種後3天，觀察到在組A和C中，有中度的腹瀉，厭食和壓抑。在整個時期中，組A的一個豬(448號)一般性地嘔吐，並且生長落後。組B的438號豬嘔吐一次。434號豬(組C，崗哨豬)的體溫稍微升高，該動物遭受了右後腿上的金屬薄片。在接種和攻擊之間的時期進食使豬的體重每天每組增加了3到6公斤。在攻擊後的臨床觀察在攻擊後3天(59號)和6天(60號)，未接種的對照豬產生了CSF症狀在攻擊後10天，可以觀察到發燒，身體縮成一團，哆索，沒有食慾和壓抑直到死亡。另外，動物發生青紫，後部輕癱，腹瀉和嚴重嘔吐。瀕死時殺死這兩個動物。所有接種2微克E2(組A)的豬在攻擊後2-3天產生了疾病症狀，主要包括發燒，縮成一團，壓抑和厭食。發燒持續了2-10天，最高體溫(Tmax)在40.7-42.2C之間變化。豬443-446，在後面的第7天，不再發燒，進食增加到攻擊之前的量。但豬448號在第9天死亡，豬447發生急性CSF(抽搐，後部輕癱)，在同一天瀕死時殺死。兩個崗哨豬仍然正常，直到攻擊後7-9天，在此之後，它們發生了急性CSF，當第20天瀕死時殺死。在組B和組C的動物中，因為E2抗原的有效負載增加了，疾病的臨床症狀和持續時間更加適度。在組B中，發燒(435-439)持續到第27天，最大體溫在40.2和41.7℃之間。豬編號436能抵抗攻擊，臨床症狀非常微弱。在18天之後，一個豬(440號)死於急性CSF，瀕死時殺死。組B中留下的5個豬恢復了。兩個崗哨豬仍然正常，直到攻擊後11-12天時，之後，發生了急性CSF，在20天時殺死。在組C中，在第4-6天，6個豬中有2個(430,431號)觀察到中度的發燒，最高體溫在40.5-41.2℃之間變化。沒有觀察到臨床症狀除了在攻擊後第6天有輕微的壓抑。在攻擊前，豬430號有嘔吐。兩個崗哨豬仍然正常直到實驗結束。在攻擊後的血液分析在組A中，只有一個豬(450號)，崗哨豬發生了明顯的白細胞減少和凝血細胞減少。豬445號和446號在攻擊後7和10天發生了凝血細胞減少，豬449在攻擊後10和14天發生了凝血細胞減少。組B的一個豬(440號)發生了白細胞減少和凝血細胞減少，其它仍然正常。兩個崗哨豬在14天時表現出發生凝血細胞減少的信號。在組C中，包括崗哨豬中沒有檢測到白細胞減少和凝血細胞減少。兩個對照動物(59和60號)在第7天後發生凝血細胞減少。在攻擊後檢測病毒傳播和病毒抗原在從穩定狀態中恢復後，接種物的回滴得到的病毒的效價是2.55TCID50/毫升。在組A和組B的對照和崗哨豬的所有選擇的組織樣品中檢測到CSFV病毒抗原(表1)。在組A和組B中，6個接種動物中有一個是陽性。在包括崗哨豬的組C中，沒有一個是陽性。血清學應答CSFV的血清轉變定義為在VNT中效價≥25。為了確定在VNT中利用的Brescia病毒的量，回滴的結果是41TCID50/毫升。在實驗中沒有對照(D)和崗哨動物發生血清轉變(表2)。在3個星期後，組A的6個動物中有2個發生了血清轉變。但在攻擊後，6個動物中的4個進行加強注射。組B和組C在接種後的21天發生了血清轉變。在攻擊後所有動物都加強免疫。後面的發現表明在動物中成功地複製了攻擊病毒。結論每個動物的PD95劑量確定為給予32微克2毫升DOE佐劑中的E2一次。在這一劑量下，在高毒性的CSFV毒株的攻擊後，疾病的臨床症狀仍然最小，沒有發生病毒傳播到接觸的動物。概括地說，分別用32(A)，8(B)，2(C)和0微克(D)2毫升佐劑(DOE)中的Ed經過肌肉內途徑接種4組每組6個豬(A-D)。在每個組(A-C)中保留2個非接種豬用於檢測引起感染(崗哨豬)的病毒分泌。在3個星期後，用100LD50的高毒性CSFV毒株Brescia，經過鼻內途徑攻擊這些動物。為了測定該E2亞單位疫苗的效率，測量臨床的，病毒學的和血清學的參數。如預期的，在組C中的動物能比其它組的動物更好地抵抗攻擊。在接種最高劑量的E2(32微克)的動物的組織樣品中沒有檢測到病毒抗原，在該組中沒有疾病。假設給出完全保護(沒有傳播病毒)的NPLA效價≥50(在接種後21天)，計算PD95的劑量。結果時PD95的劑量是32微克/動物。為了進一步測定在接種後2和3星期時抵抗100LD50毒性的CSFV攻擊的保護水平，用32微克E2，經過肌肉內途徑接種2組每組6個豬(A-B)。在每個組(A-B)中保留兩個非接種豬用於檢測引起接觸感染的接種豬的病毒分泌。在2星期(A)和3星期(B)後，用100LD50的高毒性CSFV毒株Brescia，經過鼻內途徑攻擊接種和對照動物。為了在接種後2和3星期測定E2亞單位疫苗的效率，測量了臨床，病毒學，以及血清學參數。正如預期的，組B抵抗攻擊的臨床症狀比組A少。只在組A中發生了病毒傳播到崗哨豬，在兩個組的所有動物的白細胞部分，檢測到了病毒。只有組B的一個動物在接種後14天發生血清轉變(414號)。同一組中，一個動物在21天後沒有血清轉變，但得到了保護，發燒只有2天，在攻擊後11天時血清轉變。只有對照和一個崗哨豬(組A)發生了白細胞減少和凝血細胞減少。在組A和B的動物的任何一個組織樣品中都沒有檢測到病毒抗原。結論是，在單劑量接種後的2和3星期時，所有動物都能夠抵抗攻擊。為了進一步測定在接種後3和6個月時，抵抗100LD50毒性的CSFV的攻擊的保護水平，用32微克E2，經過肌肉內途徑接種2組每組6個豬(A-B)。在每個組(A-B)中保留了2個非接種豬，用於檢測接種豬引起接觸感染的分泌病毒。在3個月(A)和6個月(B)後，用100LD50的高毒性CSFV毒株Brescia，經過鼻內途徑攻擊已經接種的動物和對照動物。為了在這一時期後，測定E2亞單位疫苗的效率，測量了臨床的，病毒學的和血清學的參數。所有組A和B的動物抵抗攻擊，其臨床症狀很少。只有對照發生了白細胞減少和凝血細胞減少。沒有發生病毒轉移到崗哨豬。在兩個組中選擇的任何一個白細胞部分都沒有檢測到病毒。只有組B的一個動物在接種後28天發生了血清轉變(1983號)。在組A，B和崗哨動物的任何一個組織樣品中都沒有檢測到病毒抗原。結論是，在單劑量接種後3和6個月時，所有動物都能夠抵抗攻擊，並且沒有發生病毒轉移。利用BVDV毒株4800，150022和178003產生實驗性E2亞單位疫苗。在杆狀病毒表達系統中表達這些毒株的E2基因(Hulst等人，1993，病毒學雜誌，675435-5442)(P.A.vanRijn等人，1996，I)，病毒遺傳學，772737-2745)。利用草地夜蛾細胞系SF21繁殖重組杆狀病毒和生產E2蛋白質。在28℃，和無血清SF900培養基(GIBCOBRL)中生長SF21細胞。用重組杆狀病毒，以感染複數每細胞5TCID50(50％培養物感染劑量)感染SF21細胞的鋪滿單層。在4-5天後，培養物顯示80-90％的細胞致病效果。在1500×g下離心細胞10分鐘，收集含有杆狀病毒和E2的上清液，儲藏在-20℃。為了失活病毒，根據標準方法，進行2-溴乙基-溴化亞胺(BEI)處理。簡要地說，混合600微升的BEI和600微升的1MNaOH。在20℃下30分鐘後，加入150毫升上清液，在20℃攪拌24小時。然後加入20毫升25％的硫代硫酸鹽。上清液滴定SF21細胞的效價確定杆狀病毒是否失活。實驗性BVDV疫苗包括在雙倍水油乳化劑中含有E2的上清液。油中含有90％的Marco152(Esso)和10％的Montanide80(Seppic)。水部分(PBS+)含有98％的磷酸緩衝鹽水，2％的Montanox80(Seppic)和100ppm的乙基汞硫代水楊酸鈉。上清液，油和PBS+利用的比例是10∶11∶10。首先，乳化上清液和油，然後加入PBS+，乳化。同樣製備用野生型杆狀病毒感染的SF21細胞的上清液的對照疫苗。在製備後的疫苗是無菌的。我們的由於表達的蛋白質的可比較性，在3個疫苗中的抗原量是相似的初步假設是不準確的。在抗原量上的不同可能是昆蟲細胞中表達上的差異引起的。每劑量疫苗15002含有55微克E2且對2次接種(0和21天)的胎兒是有保護性的(Brusche等人，1997，出版中的疫苗)。疫苗4800和疫苗178003每劑量分別含有12微克和17微克的E2，對胎兒沒有保護性。這一結果暗示在E2蛋白質的量和胎兒保護性之間有相關性。但是，E2糖蛋白的不同的免疫原性和攻擊毒株不能穿過胎盤也可能是不同的攻擊結果的原因。沒有疫苗能夠保護抵抗異源BVDV的攻擊。這一研究的結果在進一步開發BVDV亞單位疫苗中是有前途的，因為我們已經看到用包膜糖蛋白E2接種可以實現保護胎兒。另外，它是一個標記疫苗，使得能區別接種動物和野外病毒毒株感染的動物。這在將來消除BVDV行動中是有優勢的。討論開發生產方法的目的是達到最佳生產插入杆狀病毒的基因編碼的異源蛋白質。杆狀病毒表達載體系統(BEVS)對不同的重組蛋白質的生產是非常合適的，因為準確的蛋白質摺疊和準確的翻譯後加工產生了用於動物和人的生物活性蛋白質。杆狀病毒含有2個非必需基因，它們是從非常有效的啟動子p10和多角體啟動子轉錄的。p10基因的缺失變異(vanOers等人，病毒遺傳學雜誌，74563-574；1993)表明該啟動子在細胞培養中的病毒複製中不是必須的，但p10在細胞溶解中起作用，缺乏p10蛋白引起感染的細胞仍然完整，阻止了多角體從感染細胞中釋放，從而減少了再感染率但不是感染力本身。基因產物(p10(或原纖蛋白)和多角體蛋白)是在感染期後期表達的。用需要的蛋白質基因替代這些基因在理論上可以使昆蟲細胞培養物的總蛋白質產物的產量高達50％(在多角體蛋白啟動子的情況中)，導致的表達水平在每升培養物中有1克以上的多角體蛋白(Maiorella等人，(1988)昆蟲細胞培養物大規模生產重組蛋白質。生物/技術，6，1406-1410)。對於最佳的蛋白質生產，感染複數(MOI，每升病毒密度和每升細胞密度的比例)是關鍵的參數。低感染複數感染的明顯的原因是病毒接種物儘可能小。如果感染時，50升的發酵罐中，細胞密度是2百萬細胞/毫升，MOI是0.1，那麼需要1×1010個病毒。這將需要1升左右的接種物。另外，製造這樣的接種物需要特別的生產步驟。上面的培養的兩個主要的缺點是培養基的利用效率低，和氧限制。由於氧在水狀液體中的可溶性相當低，氧作為單層培養的細胞的底物是受限制的。決定靜態培養物中的最大細胞密度的因子是可得表面。一旦表面覆蓋了單層細胞，細胞的生長將停止。這樣產生的細胞密度約1×106個細胞/毫升培養基。在懸浮培養物中，不存在氧限制，其它底物的可得性是細胞密度的限制因子。這一限制在細胞密度比氧限制更高時發生，所有細胞密度比靜態培養物中更高。利用氧電極檢測溶解的氧的濃度可以防止氧限制。一旦溶解氧的濃度降低到一定值時，氧就自動加入到懸浮液，可以通過噴氣或通過發酵罐的上面的空間加入。適度地攪拌懸浮液保證了均一地培養，沒有堆積起底物梯度，細胞也沒有經受太高的剪切力。另外，攪拌使病毒有效的從感染細胞轉移到非感染細胞，使病毒感染細胞的效率更高。由於，最初只有約0.1-0.3％的細胞感染，剩下的99.7-99.9％的細胞是允許生長和增倍的。在感染細胞中生產的病毒顆粒是在感染後12-20小時時釋放的(Dee,K.U.和Shuler,M.L.1997，生物技術過程，13，14-24)。每個細胞釋放的病毒顆粒數是100-200，這些細胞可以在新的循環中感染未感染的細胞。在產生足夠的病毒顆粒之前，感染培養物中存在的所有細胞需要幾個循環。目的是在培養基耗盡和所有代謝過程停止之前，完成最後的感染過程中的蛋白質生產。在細胞密度亞最佳時達到完全感染也是不需要的，因為然後培養基將不能有效地利用，導致異源蛋白質的體積產量較低。病毒感染的整個過程是可以肉眼檢查的，因為多角體基因仍然存在。病毒感染可以觀察到為密集的蛋白質顆粒積累在細胞核中。為了防止剪切破壞細胞，在培養基中加入了最後濃度為0.2％的PluronicF-68。另外，如果需要可以加入抗泡沫劑A防止過量的泡沫，泡沫也可以導致細胞死亡。50升的培養物中加入的抗泡沫劑A的總量平均是20毫升。感染細胞的最佳病毒密度是可以計算的。這一密度取決於細胞的生長速度，感染後新病毒顆粒釋放的時間，每個感染細胞產生的新病毒顆粒的數目。說明本發明提供的方法的是瘟病毒E2蛋白質的生產。雖然已知這一蛋白質是潛在的抗原，但用E2(片段)生產疫苗或用於診斷測試並不總是成功的。儘管(當利用特殊的免疫原E2片段時)，PD50低至2微克，怎樣以有市場吸引力的方法增加足夠量的疫苗劑量中的足夠的抗原量以便能夠在大群體動物的每個動物的單次接種中達到保護性接種仍然是一個問題。這與CSFV接種關係密切。當應用CSFV接種時，通常是在已經發生CSFV爆發的區域的大行動的過程中進行的。這需要在相當短的時期快速接種大量的動物。在這樣的大行動中，迫切需要快速達到適當的保護水平(保護抵抗野生型病毒感染的豬的數目)。為了達到保護，在第一次接種後等待幾個星期進行第二次接種大大妨礙和延遲了疾病的控制。甚至當比較杆狀病毒中表達的E2(片段)時，生產重組表達的E2蛋白質的各種方法之間也是存在差異的。在E2蛋白質生產培養的早期報導中，E2蛋白質(片段)的產量在20-90微克/毫升之間變化(Hulst等人，病毒學雜誌，5435-5442，1993；Hulst和Mormann，細胞技術學20271-279，1996)，另外需要用單克隆抗體免疫親和純化以便獲得單次接種必須的和相關的E2抗原量。另一個方法(利用EP0389034中敘述的E2片段)利用了從沒有進一步沒有親和純化的昆蟲細胞上清液中收穫的E2，獲得了在滿意的(保護)免疫應答之前注射兩次的基於E2的疫苗。在起始物質例如製備疫苗的細胞培養物中的E2蛋白質(片段)的情況中，在眾多問題中，這些問題涉及低濃度的相關抗原物質。在理論上，通過本領域已知的純化和濃縮方法是可以進一步積累抗原量的，但是這不會導致具有商業吸引力的疫苗生產，而是引起每個劑量的價格高。利用本發明提供的方法進行生產，通常可以在50升的發酵罐中產生200-300微克/毫升CSFVE2蛋白質片段，在理論上每次培養足夠接種100，000個動物了。在細胞密度為0.5到1.5×106個細胞/毫升時，利用1-10毫升約含有107TCID50/毫升的病毒接種物就能夠感染細胞了。優選地，在50-80％的細胞顯示CPE時收穫培養物。這時大約在感染後100-150小時。早期的E2蛋白質生產培養物中，細胞是用MOI＞1(同步)感染的，產生的蛋白質產量比本發明提供的方法低3倍。在本發明提供的方法中，用在5升發酵罐中生長的5升細胞懸浮液或在10升發酵罐中生長的10所有10升細胞懸浮液接種50升的發酵罐。最初的細胞密度約為3×105個細胞/毫升。生長細胞並在懸浮液中加入病毒之前計算細胞密度。下面的步驟是從微過濾除去細胞和多角體開始的。將一個中空的纖維微過濾裝置與發酵罐連接，將物質泵過孔大小為0.22微米的過濾裝置。將滯留的流體再循環到發酵罐，透過的流體收集在100升的容器中。當完成過濾時，在100升的容器中失活仍然含有感染的杆狀病毒但無細胞的抗原溶液失活。通常，在懸浮液中加入最後濃度為8-12毫摩爾/升的2-溴乙基-溴化胺(BEA)。加入2M的NaOH將pH提高到5.8到8.2-8.7。這一pH轉變將BEA轉化成BEI(2-溴乙基-溴化亞胺)。這是DNA失活劑。小心檢測pH，調節到6-10，保持溫度為34-39。在失活6小時後，將抗原溶液轉移到第二個失活容器。這保證了所有容器中的物質與BEI接觸，從而失活。在第一個容器中的液滴可能含有病毒而不含有BEI，但第二個容器不會。104-107pfu/毫升的杆狀病毒的濃度下降到小於10-7pfu/毫升(每10升中不超過1個病毒顆粒)的值。這是用於基於能夠感染寄主動物的病毒的病毒疫苗(如FMD)的同樣標準。豬不是杆狀病毒寄主。將失活的抗原物質儲藏在不高於-20℃下直到它用於配製水一油一水乳劑。在接種後2星期到至少6星期中，含有32微克E2(劑量體積2毫升)的單個劑量是於得到抵抗典型豬熱病的保護(＞PD95)。以如下方法設計生產過程，直接大規模生產，可以利用250升或更大的發酵罐。也可以直接大規模靜態培養生產；只需要利用更多的組織培養瓶。但是，在50升發酵罐中通常獲得的總蛋白質產量需要約7000個T175組織培養瓶。在發酵罐中可以檢測細胞生長和感染並可以調節得更好，因為存在氧和pH電極。在組織培養瓶中，瓶與瓶之間可能存在差異，但不能定量。如靜態培養生產檢測失活並調節得準確的多。如果用本發明提供的方法生長細胞，在BEVS(在我們研究所)表達的其它蛋白質的體積生產水平也相當大地提高了。例如，利用10升的發酵罐，牛FSH的產量增加的3-4倍。在細胞密度為1.1×106個/毫升和每兩個重組杆狀病毒的MOI為0.003時，細胞共感染。在搖瓶中的懸浮培養物中，BVDV的不同的E2蛋白質和Erns蛋白質或BVDV和/或CSFV的產量增加了3倍。這一方法也可以用於其它重組蛋白質。表1．利用免疫螢光技術檢測不同組織的冷凍切片的病毒抗原-=沒有檢測到螢光+=檢測到螢光-=沒有數據*=在實驗20dpc結束時動物被殺死表2病毒中和測試的結果-=沒有數據權利要求1．提高在昆蟲細胞培養物中生產的重組蛋白質的產量的方法，包括選擇編碼所述蛋白質的重組杆狀病毒，在培養容器的生長培養基中生長昆蟲細胞，和用至少一個杆狀病毒的接種物以感染複數小於0.01感染細胞。2．根據權利要求1的方法，包括在體積足夠含有2升，更優選地10升，更優選地50升生長培養基，更優選地250升生長培養基的培養容器中生長細胞。3．根據權利要求1或2的方法，包括在細胞密度為1×105到5×106個細胞/毫升，更優選地5×105到1.5×106個細胞/毫升時感染細胞。4．根據權利要求1，2或3的方法，包括以≤0.005的感染複數感染細胞。5．根據權利要求4的方法，感染複數≤0.003。6．根據權利要求1-5任何一項所述的方法，包括選擇在p10啟動子控制下表達需要的蛋白質的重組杆狀病毒。7．根據權利要求1-6任何一項所述的方法，包括優選地在培養容器如能夠適當攪拌的發酵罐中懸浮生長昆蟲細胞。8．根據權利要求1-7任何一項生產重組瘟病毒E2或Erns蛋白或其片段的方法。9．增加在昆蟲細胞培養物中生產的重組瘟病毒E2或Erns蛋白或其片段的方法，特徵是收穫時生長培養基中的所述蛋白質(片段)的最後濃度至少100微克/毫升。10．根據權利要求9所述的方法，其中濃度大於120微克/毫升，或至少150微克/毫升，更優選地至少200微克/毫升。11．根據權利要求1-10任何一項所述的方法在生產抗原物質中的用途。12．根據權利要求11所述的用途，其中抗原物質是瘟病毒蛋白質(片段)，更優選地是典型性豬瘟病毒蛋白質(片段)。13．含有利用權利要求1-10任何一項方法獲得的抗原物質的疫苗。14．含有重組瘟病毒E2或Erns蛋白或其片段的疫苗，特徵是它不是免疫親和純化的，並且優選地在單劑量接種一次後賦予PD95水平的抵抗瘟病毒感染的保護性。15．根據權利要求14所述的疫苗，其中瘟病毒感染是典型性豬瘟感染。16．根據權利要求13-15的任何一項所述的疫苗，另外還含有佐劑，所述的佐劑優選地含有雙倍油包水乳劑。17．生產在生長培養基中收穫時濃度至少為15微克/毫升的重組促卵泡激素，α單位和/或β單位和其複合物和片段的方法。18．根據權利要求17所述的方法，其中濃度至少為20微克/毫升，更優選地至少25微克/毫升。19．根據權利要求17或18所述的方法，包括用在培養物中表達α單位的一個杆狀病毒和表達β單位的另一個杆狀病毒感染昆蟲細胞培養物。20．根據權利要求1-7或17-19任何一項所述的方法在生產激素類物質中的用途。21．根據權利要求20所述的用途，用於生產激素類物質摻入藥物組合物治療生殖疾病。全文摘要本發明涉及增強杆狀載體病毒表達系統中的蛋白質表達的方法。本發明提供了在昆蟲細胞培養物中生產重組蛋白質的方法,包括選擇表達所述蛋白質的重組杆狀病毒,在足夠體積的至少含2升生長培養基的培養容器中生長昆蟲細胞,並且用至少一種杆狀病毒的接種物以感染複數<0.01感染細胞密度為1×10文檔編號C12P21/02GK1295620SQ98813684公開日2001年5月16日申請日期1998年12月17日優先權日1997年12月18日發明者迪特馬爾·克雷茨多恩,迪爾克·弗朗西斯庫斯·馬裡納斯·范德維爾,亞伯拉罕·約翰尼斯·德斯米特,羅伯特茨·雅各布斯·瑪麗亞·莫爾曼,埃裡克·謝斯·阿曼申請人:動物育種及動物保健基金研究所,拜耳股份公司