千斤拔總黃酮提取物及其提取方法和其藥物用途的製作方法

2023-05-18 20:25:01 1

專利名稱：千斤拔總黃酮提取物及其提取方法和其藥物用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於中藥提取物製備方法及其藥物用途，具體涉及千斤拔總黃酮提取物及其提取方法和其藥物用途。
背景技術：
千斤拔隸屬於豆科(Leguminosac)蝶形花亞科(Papilionoideae),在我國廣泛分布於東南、中南、西南地區。千斤拔以根入藥，有祛風溼，強腰膝的功效，用於風溼性關節炎，腰腿痛，腰肌勞損，白帶，跌打損傷。《中藥大辭典》記載「千斤拔味甘辛，微苦，性溫平，無毒，具有祛風利溼、消瘀解毒之功效，可治療風溼痺痛，慢性腎炎、跌打損傷、癰腫、喉蛾等症」。國內外學者對該植物化學成分及其生物活性的研究報導很多，其化學成分含有黃酮類、香 豆素類、萜類、揮髮油、留醇類等，其中以黃酮類化合物為主，尤其是異戊烯基取代的異黃酮類化合物。現代藥理研究及臨床試驗表明千斤拔不僅對各種婦科炎症有顯著療效，具有類雌激素作用，還具有良好的抗血栓、抗炎鎮痛、抗氧化的作用，對神經系統的損傷也具有一定的保護作用。千斤拔含有大量的活性物質，其中的黃酮類化合物具有抗菌、消炎、抗氧化、降血月旨、降血栓、防治血管硬化和抗衰老等作用。國內外關於千斤拔的研究主要集中在化學成分、藥理作用和活性成分提取的研究。未見基於熱回流提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法提取，大孔樹脂樹脂純化，使千斤拔有效部位總黃酮含量大於50%的報導；未見關於千斤拔有效部位總黃酮含量大於50%提取物藥物用途的研究報導。

發明內容
本發明旨在提供一種蔓性千斤拔總黃酮提取物製備方法，該方法包括以下步驟
(1)將千斤拔藥材粉碎；
(2)用乙醇熱回流提取、超聲波輔助提取或微波輔助提取，合併提取液，過濾，濃縮，真空乾燥得千斤拔粗提物；
(3)將步驟(2)中的千斤拔粗提物加水沉澱後離心，上清液備用；
(4)將(3)得到的上清液上大孔樹脂柱；
(5)用水洗脫去雜後，用乙醇梯度洗脫；
(6)收集乙醇洗脫液減壓濃縮真空乾燥，粉碎後得到千斤拔總黃酮粗提物。其中步驟(I)中千斤拔粉碎後的粒度為30-60目。步驟(2)中乙醇的濃度為40%_85%。步驟(3)中加水量為浸膏重量的8-10倍。步驟(4)中所述大孔樹脂為AB-8型大孔樹脂，大孔樹脂與步驟⑴中所述千斤拔的重量比為O. 5-5:1。步驟(5)中洗脫溶劑採用與大孔樹脂體積比5-10的蒸餾水、10%、70%乙醇梯度洗脫，合併70%乙醇洗脫液。本發明的優點如下
(1)本發明採用溶劑提取結合大孔樹脂純化法對千斤拔中總黃酮進行純化，有效提高了提取物中總黃酮含量，經紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，測得提取物中總黃酮含量大於 50% ；
(2)超聲波輔助提取具有提取效率高、提取時間短、提取溫度低、適應性廣、提取藥液雜質少，有效成分易於分離、純化、提取工藝運行成本低，綜合經濟效益顯著、操作簡單易行，設備維護、保養方便的優點；
(3)微波輔助提取具有反應或萃取快、產率高，產品質量好、後處理方便、安全、無汙染、生產線組成簡單，節省投資的優點。
具體實施方式
I.千斤拔總黃酮的提取
(I)溶劑回流法50g千斤拔藥材粗粉，加入12倍量的40-85%乙醇，回流提取3次，每次分別為3h、2h、lh，合併提取液過濾，減壓濃縮，真空乾燥。(2)超聲波法50g千斤拔藥材粗粉，加入10倍量的50%乙醇，在60°C下進行超聲提取3次,每次分別為50min,30min, IOmin,合併提取液過濾,減壓濃縮,真空乾燥。(3)微波輔助提取法50g千斤拔藥材粗粉，加入12倍量的60%乙醇，在60°C下進行微波輔助提取3次，每次分別為30min，20min，lOmin，合併提取液過濾，減壓濃縮，真空乾燥。2.千斤拔總黃酮的含量測定
(1)對照品溶液的製備精密稱取蘆丁標準品5.Omg於50mL容量瓶中，以70%乙醇溶解，定容得濃度為O. lmg/mL的蘆丁對照品溶液；
(2)供試品溶液的製備精密稱取蔓性千斤拔總黃酮提取物20mg於25mL容量瓶中，力口入70%乙醇溶解，定容，搖勻即得；
(3)標準曲線的繪製精密吸取標準液0、l、2、3、4、5mL，分別置IOmL容量瓶中，各加70%乙醇溶液使成7mL，精密加入5%亞硝酸鈉O. 3mL,搖勻，放置6min，精密加入10%硝酸鋁溶液O. 3mL,搖勻，放置lOmin，加入lmol/L氫氧化鈉溶液2mL，分別用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置lOmin，置比色皿中，在510nm處測吸光度，測3次取平均值，繪製標準曲線，得回歸方程A=8. 5038C-0. 0054，R=O. 9997 ；
(4)提取物中總黃酮含量的測定精密吸取供試品溶液lmL，置IOmL容量瓶中，加60%乙醇溶液使成7mL，精密加入5%亞硝酸鈉O. 3mL,搖勻，放置6min，精密加入10%硝酸鋁溶液
O.3mL,搖勻，放置lOmin，加入lmol/L氫氧化鈉溶液2mL，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置lOmin，置比色皿中，在510nm處測吸光度，測3次取平均值，根據蘆丁標準曲線計算提取物中總黃酮含量。3.千斤拔總黃酮的純化
(I)樹脂的預處理及裝柱取新購的AB-8大孔樹脂，以95%乙醇浸泡24h後裝柱(2. 5cmX 20cm)，裝柱過程應該讓樹脂緩緩沉下，柱床緊實且無氣泡，95%乙醇衝洗樹脂柱，至流出液與蒸餾水1:1混合不再出現渾濁為止，繼續以蒸餾水衝洗樹脂柱，至無醇味為止；(2)上樣用恆流泵將濃度為O.42mg/mL O. 89mg/mL的千斤拔總黃酮提取液進行上柱，控制流速為lmL/min ；
(3)收集以5mL為單位體積分步收集流出液，精密吸取ImL流出液，測定吸光度；
(4)飽和吸附量計算當流出液濃度達到上樣液濃度1/10時，即為上樣終點。將流出液合併，通過測定流出液吸光度，計算出流出液濃度，飽和吸附量=[(上樣液濃度X上樣液體積)-(流出液體積X流出液濃度)];
(5)洗脫用5倍柱床體積(50mL)的70%乙醇溶液洗脫，以5mL為單位體積分步收集洗脫液，控制流速為lmL/min，用薄層色譜法確定洗脫終點；
(6)含量測定用Al(NO3)3-NaNO3-NaOH顯色法測定洗脫液中千斤拔總黃酮的濃度；
(7)總黃酮純度計算洗脫液合併，減壓回收溶劑，濃縮物真空乾燥，稱重。總黃酮純度=[(總黃酮濃度(mg/mL) X洗脫液體積(mL))/乾燥物重量(mg)]；·
(8)樹脂除了吸附目標化合物外，還會吸附雜質，而這些雜質會汙染樹脂，所以每次使用後，樹脂必須再生，每次層析後，將樹脂倒出，用95%乙醇衝洗數次，待顏色較淺後加5%Na0H溶液衝洗，待顏色較淺後改用蒸餾水洗至中性，繼續用5%HC1溶液衝洗，待顏色較淺後改用蒸餾水洗至中性，樹脂即可再次使用。本發明的藥物用途可通過下面藥效學實驗進一步驗證，千斤拔總黃酮提取物中總黃酮含量大於50%,以下簡稱為DLP。實驗例I DLP對聞脂I旲型小鼠血脂的影響實驗。一、實驗材料
1.動物Wistar大鼠，120隻，雌雄各半，體重180-210g。購自吉林大學基礎醫學院動物實驗中心，動物合格證號SCXK-(吉)-2007-0003 ；
2.藥品與試劑千斤拔總黃酮提取物(總黃酮含量62%,性狀淺棕色粉末,氣微,味微澀，微苦。批號20100601)，吉林化工學院藥學系提供；血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司生產，產品批號20100206 ;非諾貝特，法國利博福尼製藥公司生產，批號1026396 ;膽固醇，規格生化試劑，天津市光復精細化工研究所，批號100516 ;膽酸鈉，規格生化試劑，北京化學試劑公司，批號20100525 ;豬油，由吉林化工學院藥學系教研室提供；血清總膽固醇(TC)含量測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號100501 ；甘油三酯(TG)含量測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號101831 ；
3.儀器iMark-680酶標儀，美國BIO-RAD伯樂公司產品。二、實驗方法
1.高脂飼料配製方法在88.7%的基礎飼料中加10%豬油、1%膽固醇和O. 3%膽酸鈉。將豬油加溫溶化，加入膽固醇和膽酸鈉，攪拌均勻後倒入飼料中，拌勻，加適量溫水拌勻，平鋪在方盤中，厚度約I. 5cm，用壁紙刀劃成2cmX 3cm大小的小塊，放置80°C恆溫乾燥箱中烘乾;
2.配藥方法分別根據各組給藥劑量、動物體重、給藥天數計算出所需要量，精密稱定，先加少量蒸餾水，研磨均勻，再加蒸餾水至所需濃度即可；
3.對照組的設立動物購入後適應環境3天，按體重隨機分為正常對照組；高脂模型組；陽性對照藥血脂康膠囊組(240mg/kg);陽性對照藥非諾貝特組(40mg/kg);千斤拔總黃酮提取物高劑量組(400mg/kg)、中劑量組(200mg/kg)和低劑量組(100mg/kg)共8組,每組12隻，雌雄各半；
4.動物飼養及取樣實驗過程中，正常對照組動物飼以常規飼料，其他各組動物均飼以聞脂詞料。實驗動物每天上午灌胃給藥I次，灌胃體積均為20mL/kg。正常對照組及聞脂模型組動物灌胃蒸餾水，給藥組分別給予相應的藥物溶液。連續給藥2周，最後I次給藥當晚，動物禁食不禁水16小時，次日眼球取血O. 5ml，離心(3000r/min)分離血清；採用酶比色法測定血清總膽固醇(TC)含量、採用酶比色法測定血清甘油三酯(TG)含量。指標數據以均數加減標準差(x±s)表示，統計學處理方法採用組間t-檢驗。三、實驗結果
小鼠在連續飼以高脂飼料造模2周後，模型組動物的血清TC、TG含量均較正常對照組明顯升高，TC含量正常對照組為3. 14±0. 46mmol/L，模型組為6. 55±0. 85mmol/L(P<0. 01)； TG含量正常對照組為O. 68±0. 24mmol/L，模型組為O. 85±0. 26mmol/L (P〈0. 05)，表明高血脂症動物模型成立；給藥兩周後，DLP高劑量組動物血清TC和TG含量均低於高脂模型組(P〈0. 01),表明千斤拔總黃酮可明顯降低高脂模型小鼠血清TC和TG含量。表I千斤拔總黃酮提取物(DLP)對實驗性高脂血症小鼠血脂含量的影響
權利要求
1.在一種千斤拔總黃酮提取物，其特徵在於由下述方法製備得到 (1)取千斤拔藥材20g，粉碎，用60%-85%乙醇作為溶劑加熱回流提取3次，每次分別為3h、2h、Ih,合併提取液，過濾，濃縮，真空乾燥即得千斤拔總黃酮粗提物； (2)取千斤拔藥材20g，粉碎，用60%-85%乙醇浸泡l_6h，常壓下，以功率200-900W進行微波輔助提取3次，每次分別為30min，20min, IOmin,提取液過濾，濃縮，真空乾燥即得千斤拔總黃酮粗提物； (3)取千斤拔藥材20g，粉碎，用60%-85%乙醇浸泡2-4h，常壓下，以頻率為200-700W，進行超聲輔助提取3次，每次分別為50min，30min，lOmin，提取液過濾，濃縮，真空乾燥即得千斤拔總黃酮粗提物； (4)將(1)、(2)或(3)得到的千斤拔總黃酮粗提物精密稱量，溶解，經AB-8大孔樹脂純化，收集洗脫液，回收乙醇得浸膏，真空乾燥至恆重即得本發明的千斤拔總黃酮提取物，其中總黃酮含量>50%。
2.如權利要求I所述的千斤拔總黃酮提取物的製備方法，其特徵在於乙醇可用甲醇代替。
3.如權利要求I所述的千斤拔總黃酮提取物的製備方法，其特徵在於大孔樹脂可用聚醯胺樹脂代替。
4.如權利要求I所述的千斤拔總黃酮提取物在製備降血脂、降血栓藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種千斤拔總黃酮提取物及其提取方法和其醫藥用途，屬於中藥的有效藥用部位中的提取物及其提取方法和其藥物用途。將中藥千斤拔乾燥粉碎後用40-85％乙醇回流提取、微波輔助提取或超聲波輔助提取，過濾、濃縮、乾燥得千斤拔總黃酮粗提物，經AB-8大孔樹脂分離純化，收集洗脫液，回收溶劑即得用於中藥新藥研究的千斤拔總黃酮提取物，採用紫外分光光度法測定其中總黃酮含量大於50%。本發明提取純化的千斤拔總黃酮提取物具有治療高血脂、血栓等疾病的作用。
文檔編號A61K36/48GK102940667SQ201210533249
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者陳帥, 王慧竹, 王曉林, 薛健飛, 劉立業, 年曉莉 申請人:吉林化工學院, 陳帥