人cd22特異性抗體及其治療和診斷應用的製作方法

2023-05-19 13:58:01

專利名稱：人cd22特異性抗體及其治療和診斷應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種對B淋巴細胞抗原(CD22)的抗原決定簇具有特異性的抗體分子。本發明也涉及所述抗體分子的治療用途和製備所述抗體分子的方法。
在天然抗體分子中，有兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈和每條輕鏈在其N-末端有一個可變區。每個可變區由4個構架區(FR)和交互的3個互補性決定區(CDR)組成。通常可變區的殘基按照Kabat等發明的系統編號。該系統是美國健康與人類服務部NIH USA的Kabat等於1987年在「Sequence of Proteins of Immunological Interest」中提出(在下文簡稱為「Kabat等(參見上文)」)。除非另有說明，否則在本說明書中使用該編號系統。
Kabat殘基命名經常與胺基酸殘基的線性編號不一致。無論是構架區還是CDR，實際的線性胺基酸序列可能比嚴格的Kabat編號含有較少或額外的胺基酸，這些較少或額外的胺基酸對應於基本可變區結構中截短的或插入的結構組分。對於給定的抗體，通過與具有「標準」Kabat編號序列的抗體序列中的同源殘基比對，可確定殘基的正確Kabat編號。
根據Kabat編號，重鏈可變區的CDR位於殘基31-35(CDR-H1)、殘基50-65(CDR-H2)和殘基95-102(CDR-H3)中。
根據Kabat編號，輕鏈可變區的CDR位於殘基24-34(CDR-L1)、殘基50-56(CDR-L2)和殘基89-97(CDR-L3)中。
歐洲專利申請EP-A-0239400描述了CDR移植抗體(CDR-graftedantibody)的構建，該申請公開了一種其中使用長的寡核苷酸通過定點誘變將小鼠單克隆抗體的CDR移植到人免疫球蛋白可變區的構架區的方法。CDR決定抗體的抗原結合特異性並且是可變區的構架區上攜帶的相對短的肽序列。
最早有關通過CDR移植的人源化(humanising)單克隆抗體的工作，是在識別合成抗原例如NP的單克隆抗體上進行。然而，Verhoeyen等(Science，239，1534-1536，1988)和Riechmann等(Nature，332，323-324，1988)分別描述了其中通過CDR移植使識別溶菌酶的小鼠單克隆抗體和識別人T細胞上的抗原的大鼠單克隆抗體人源化的實例。
Riechmann等發現在CDR移植物中，單獨CDR的轉移(如Kabat等定義(Kabat等(參見上文)和Wu等，J.Exp.Med.，132，211-250，1970)不足以提供令人滿意的抗原結合活性。已發現許多構架殘基必須改變以便使它們與供體構架區的那些殘基相對應。國際專利申請號WO90/07861描述了用於選擇需要改變的構架殘基的建議標準。
已公開了許多討論CDR移植抗體的綜述，包括Vaughan等(NatureBiotechnology，16，535-539，1998)。
惡性淋巴瘤是一類變化較多的腫瘤。大多數情況發生在老年人中。目前在美國有200,000位至250,000位患者患有非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins Lymphoma)(NHL)。在美國該病是增長第二快的癌症，以每年新增約55,000例的速度增加。該病的發生率增長已不能簡單地通過老齡人口增長和暴露在已知危險因素中來解釋。
淋巴瘤的分類比較複雜，近十年已有進展。在1994年採用了修訂的歐洲-美國淋巴瘤(REAL)分類法。該分類法將B細胞淋巴瘤(最常認定的)、T細胞淋巴瘤和不能分類的原發性淋巴瘤歸入公認的亞型。在平常的實踐中，依據它們的一般組織學外觀而將NHL分為低度、中度和高度的分類法充分反映了它們的臨床特徵。
NHL主要影響淋巴結，但在個別患者中，腫瘤可累及其它解剖學部位，例如肝、脾、骨髓、肺、腸和皮膚。該疾病通常表現為無痛的淋巴結腫大。結外淋巴瘤(extranodal lymphoma)最常見影響腸，儘管實際上每種器官的原發性淋巴瘤已有記載。全身症狀包括發熱、盜汗、乏力和體重減輕。
直到最近，完全根據疾病解剖學範圍的Anm Arbor分類系統成為NHL治療的主要決定因素。通過結合另外的預後指徵，包括年齡、血清乳酸脫氫酶水平和表現情況，可提煉這些信息。即便如此，Ann.Arbor分類系統的知識與腫瘤的組織學和免疫學亞型一起仍然是治療的主要決定因素。
低度NHL具有無痛的病程，患者平均存活8-10年。目前可採用的治療對存活幾乎沒有影響，儘管局部疾病的放療和全身症狀的化療改善了患者的生活質量。組合化療可預備用於復發的疾病。中度疾病和尤其高度疾病非常具有攻擊性並易於擴散。該級別的疾病需要緊急治療。在患有非常嚴重疾病的患者中，放射治療可為治療的有效組成。已採用許多不同的化療方案，並且可在超過一半的患者中獲得長期無病的倖存者。對於患有復發性或頑固性疾病的患者，最初採用幹細胞支持的大劑量治療，但是現在在一線治療中逐漸發現一個空間用於患有低危險性疾病的患者。在近年，採用漸趨攻擊性治療方法的趨勢，必須平衡許多NHL患者中一般老年患者和相對體弱的患者，並且需要使治療毒性與每位患者疾病的個體預後相配。
需要更有效並且更易耐受的改進的治療。最新採用的藥物包括逐漸加至組合中的新細胞毒性藥物，並採用基於抗體的治療。
非霍奇金淋巴瘤包括各種各樣的B細胞淋巴瘤。因此，B細胞抗原是抗體治療的合適靶。
CD22為135kDa膜糖蛋白，並且屬於稱為唾液酸粘附素的唾液酸結合蛋白家族。其在B細胞發育早期的細胞質中檢測到，與IgD同時出現在細胞表面，並且存在於大多數成熟B細胞上。表達隨B細胞活化而增加。CD22隨終末分化而喪失，一般報導在漿細胞上並不存在。因此，該內化抗原存在於前B細胞和成熟B細胞的表面，而在幹細胞或漿細胞上不存在。
在人類中存在兩種CD22同種型。其主要形式(CD22β)在胞外區含有7個免疫球蛋白樣(Ig樣)結構域。CD22α變異體缺乏Ig樣結構域4並可具有截短的胞質結構域。已表明阻斷CD22粘著至單核細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞和紅細胞上的抗體在第1或第2Ig樣結構域內結合。
一旦連接B細胞抗原受體並與Lyk、Syk和磷脂醯肌醇3-激酶締合，CD22的胞質結構域則酪氨酸被磷酸化。CD22的功能是負調節B細胞活化的閾值。它通過與帶有適當唾液酸糖綴合物(sialoglycoconjugates)的細胞相互作用也可介導細胞粘著。
CD22在包括NHL、急性成淋巴細胞性白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)和尤其是急性非淋巴細胞性白血病(ANLL)在內的大多數B細胞白血病和淋巴瘤中表達。
現有技術已描述了抗CD22的單克隆抗體。WO 98/41641描述了在VH44和VL100上具有半胱氨酸殘基的重組抗CD22抗體。WO96/04925描述了抗CD22抗體LL2的VH區和VL區。US 5686072描述了抗CD22和抗CD19免疫毒素的組合。WO 98/42378描述了裸抗CD22抗體在治療B細胞惡性腫瘤中的用途。
最近，許多基於抗體的療法或者被許可，例如Rituxan(一種未標記的CD20特異性嵌合人γ1(+mγ1V區))，或者對該疾病正在進行臨床試驗。對臨床醫師和患者來說，這些依賴或者補體介導或者ADCC介導的B細胞的殺傷或放射性核素(例如131I或90Y)的使用，已涉及到製備和使用的難題。需要治療NHL並且能反覆使用並可容易而有效製備的抗體分子。也需要對CD22有高親和力而對人體有低免疫原性的抗體分子。
發明概述第一方面，本發明提供一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區包含CDR(如Kabat等定義(參見上文))的重鏈，所述CDR具有如下給出的序列對於CDR-H1在圖1中的H1(SEQ ID NO1)；對於CDR-H2在圖1中的H2(SEQ ID NO2)，或已去除潛在糖基化位點的H2，或其中位置60(根據Kabat編號系統)的賴氨酸殘基已被其它胺基酸取代的H2，或其中已去除糖基化位點和位置60的活性賴氨酸的H2；或對於CDR-H3在圖1中的H3(SEQ IDNO3)。
本發明第一方面的抗體分子包含至少一個選自重鏈可變區的H1、H2和H3(SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)的CDR。優選所述抗體分子在重鏈可變區包含至少兩個且更優選所有這三個CDR。
本發明的第二方面，提供一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區包含CDR(如Kabat等定義(參見上文))的輕鏈，所述CDR具有如下給出的序列對於CDR-L1在圖1中的L1(SEQ ID NO4)、對於CDR-L2在圖1中的L2(SEQ ID NO5)或對於CDR-L3在圖1中的L3(SEQ ID NO6)。
本發明第二方面的抗體分子包含至少一個選自輕鏈可變區的L1、L2和L3(SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)的CDR。優選所述抗體分子在輕鏈可變區包含至少兩個且更優選所有這三個CDR。
優選本發明的第一和第二方面的抗體分子分別具有互補輕鏈或互補重鏈。
優選本發明的第一或第二方面的抗體分子包含其中可變區包含CDR(如Kabat等定義(參見上文))的重鏈，所述CDR具有如下給出的序列對於CDR-H1在圖1中的H1(SEQ ID NO1)，對於CDR-H2在圖1中的H2(SEQ ID NO2)、或已去除潛在糖基化位點的H2、或其中位置60(根據Kabat編號系統)的賴氨酸殘基已被其它胺基酸取代的H2、或其中已去除糖基化位點和位置60的活性賴氨酸的H2，或對於CDR-H3在圖1中的H3(SEQ ID NO3)；和其中可變區包含CDR(如Kabat等定義(參見上文))的輕鏈，所述CDR具有如下給出的序列對於CDR-L1在圖1中的L1(SEQ ID NO4)、對於CDR-L2在圖1中的L2(SEQ ID NO5)或對於CDR-L3在圖1中的L3(SEQ ID NO6)。
上述SEQ ID NO1-6和圖1中給出的CDR源自小鼠單克隆抗體5/44。
小鼠5/44抗體可變區的全序列示於圖2(輕鏈)(SEQ ID NO7)和圖3(重鏈)(SEQ ID NO8)。該小鼠抗體在下面也被稱為「供體抗體」或「鼠單克隆抗體」。
本發明的第一或第二方面的第一個可供選擇的優選實施方案為具有分別如圖2(SEQ ID NO7)和圖3(SEQ ID NO8)所示的輕鏈可變區序列和重鏈可變區序列的小鼠單克隆抗體5/44。5/44的輕鏈恆定區為κ，而重鏈恆定區為IgG1。
在第二個可供選擇的優選實施方案中，根據本發明第一和第二方面中任一方面的抗體為嵌合小鼠/人抗體分子，在本文稱為嵌合5/44抗體分子。該嵌合抗體分子包含小鼠單克隆抗體5/44的可變區(SEQ IDNO7和8)和人恆定區。優選嵌合5/44抗體分子在輕鏈中包含人Cκ結構域(Hieter等，Cell，22，197-207，1980；Genebank登記號J00241)並且在重鏈中包含人γ4結構域(Flanagan等，Nature，300，709-713，1982)，任選位置241的絲氨酸殘基被脯氨酸殘基取代。
優選本發明的抗體包含其中可變區包含作為CDR-H2(如Kabat等定義(參見上文))的H2』的重鏈，其中已去除潛在的糖基化位點序列並且意想不到地提高了嵌合5/44抗體對CD22抗原的親和力，並且優選其作為CDR-H2具有如H2』(SEQ ID NO13)給出的序列。
另外，本發明的抗體可包含其中可變區包含作為CDR-H2(如Kabat等定義(參見上文))的H2」的重鏈，其中位置60的賴氨酸殘基被導致保守取代的其它胺基酸取代，所述賴氨酸殘基在CDR-H2中處於暴露的位置並被認為有可能與綴合劑(conjugation agents)反應導致抗原的結合親和力降低。優選CDR-H2具有如H2」(SEQ ID NO15)給出的序列。
另外，本發明的抗體可包含其中可變區包含作為CDR-H2(如Kabat等定義(參見上文))的H2的重鏈，其中潛在的糖基化位點序列和位置60的賴氨酸殘基被其它胺基酸所取代。優選CDR-H2具有如H2(SEQ ID NO16)給出的序列。
在第三個可供選擇的優選實施方案中，根據本發明第一和第二方面的任一方面的抗體為CDR移植抗體分子。本文所用的術語「CDR移植抗體分子」是指其中重鏈和/或輕鏈含有一個或多個CDR(如果需要，可包括修飾CDR)的抗體分子，CDR來自移植到受體抗體(例如人抗體)的重鏈和/或輕鏈可變區構架的供體抗體(例如鼠單克隆抗體)。
優選該類CDR移植抗體具有包含人受體構架區以及一個或多個上述供體CDR的可變區。
當移植CDR時，可以使用任何合適的與CDR所來源的供體抗體類別/類型有關的受體可變區構架序列，包括鼠構架區、靈長類構架區和人構架區。可用於本發明的人構架的實例有KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等(參見上文))。例如KOL和NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈，EU、LAY和POM既可用於重鏈也可用於輕鏈。或者，可以使用人種系序列。優選的輕鏈的構架區為如圖5(SEQ ID NO17)所示的人種系亞型序列(DPK9+JK1)。優選的重鏈的構架區為如圖6(SEQ ID NO21)所示的人亞型序列(DP7+JH4)。
在本發明的CDR移植抗體中，優選作為受體供體使用具有與供體抗體的鏈同源的鏈的抗體。受體重鏈和輕鏈不必源自同一抗體，並且如果需要可包含具有源自不同鏈的構架區的混合鏈。
另外，在本發明的CDR移植抗體中，構架區不必具有與受體抗體的那些序列完全相同的序列。例如，罕見殘基可變為更經常出現的該受體鏈類別或類型的殘基。或者，可改變在受體構架區所選的殘基以便它們對應於在供體抗體的相同位置存在的殘基或對應於在供體抗體的相同位置存在的殘基的保守取代的殘基。應最小限度的保持這些使供體抗體的親和力恢復必需的改變。在WO 91/09967中提出可能需要改變在受體構架區選擇殘基的方案。
優選在本發明的CDR移植抗體分子中，如果受體輕鏈具有人亞型DPK9+JK1序列(如圖2所示)(SEQ ID NO17)，那麼輕鏈的受體構架區在位置2、4、37、38、45和60包含供體殘基並可另外在位置3包含供體殘基(根據Kabat等(參見上文))。
優選在本發明的CDR移植抗體分子中，如果受體重鏈具有人DP7+JK4序列(如圖3所示)(SEQ ID NO21)，那麼重鏈的受體構架區在位置1、28、48、71和93包含除一個或多個供體CDR外的供體殘基，並可另外在位置67和69包含供體殘基(根據Kabat等(參見上文))。
供體殘基是來自供體抗體的殘基，即CDR最初來源的抗體。
優選本發明的抗體包含其中可變區包含作為CDR-H2(如Kabat等定義(參見上文))的H2』的重鏈，其中為提高嵌合5/44抗體對CD22抗原的親和力而去除潛在的糖基化位點序列，並優選其作為CDR-H2具有如H2』(SEQ ID NO13)給出的序列。
另外，本發明的抗體可包含其中可變區包含作為CDR-H2(如Kabat等定義，(參見上文))的H2」的重鏈，其中位置60的賴氨酸殘基被其它胺基酸所取代，所述賴氨酸殘基位於CDR-H2內暴露的位置並認為其有可能與綴合劑反應，從而導致抗原結合親和力下降。優選CDR-H2具有如H2」(SEQ ID NO15)給出的序列。
另外，本發明的抗體可包含其中可變區包含作為CDR-H2(如Kabat等定義，(參見上文))的H2的重鏈，其中潛在的糖基化位點序列和位置60的賴氨酸殘基被其它胺基酸所取代。優選CDR-H2具有如H2(SEQ ID NO16)給出的序列。
本發明的抗體分子可包含具有全長重鏈和輕鏈的完全抗體分子；其片段，例如Fab、修飾的Fab、Fab』、F(ab』)2或Fv片段；輕鏈或重鏈單體或二聚體；單鏈抗體，例如其中重鏈可變區和輕鏈可變區通過肽接頭連接的單鏈Fv。同樣，重鏈可變區和輕鏈可變區可與其它抗體結構域適當組合。
本發明的抗體分子可具有連接其上的效應分子或報導分子。例如，用於螯合其可具有通過共價橋連結構連接其上的重金屬原子或毒素(例如蓖麻毒蛋白)的大環。或者，可採用重組DNA技術方法，製備其中完全免疫球蛋白分子的Fc片段(CH2區、CH3區和鉸鏈區)、CH2區和CH3區或CH3區已被功能性非免疫球蛋白(例如酶或毒素分子)置換或者通過肽鍵與其連接的抗體分子。
本發明抗體分子的結合親和力優選至少0.85×10-10M、更優選至少0.75×10-10M、最優選至少0.5×10-10M。
優選本發明的抗體分子包含輕鏈可變區5/44-gL1(SEQ ID NO19)和重鏈可變區5/44-gH7(SEQ ID NO27)。這些輕鏈可變區序列和重鏈可變區序列分別示於圖5和圖6。
本發明也涉及對CD22具有改進的親和力的本發明抗體分子的變異體。這些變異體可通過包括以下的許多親和力成熟方案獲得CDR突變(Yang等，J.Mol.Biol.，254，392-403，1995)、鏈改組(Marks等，Bio/Technology，10，779-783，1992)、大腸桿菌(E.coli)增變株的應用(Low等，J.Mol.Biol.，250，359-368，1996)、DNA改組(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol，8，724-733，1997)、噬菌體展示(Thompson等，J.Mol.Biol.，256，77-88，1996)和性PCR(Crameri等，Nature，391，288-291，1998)。Vaughan等(參見上文)討論了這些親和力成熟的方法。
本發明也提供編碼本發明抗體分子的重鏈和/或輕鏈的DNA序列。
優選所述DNA序列編碼本發明抗體分子的重鏈或輕鏈。
本發明的DNA序列也可包含合成DNA(例如通過化學方法製備的合成DNA)、cDNA、基因組DNA或它們的任何組合。
本發明也涉及包含一個或多個本發明DNA序列的克隆載體或表達載體。優選所述克隆載體或表達載體包含兩種分別編碼本發明抗體分子的輕鏈和重鏈的DNA序列。
可以構建載體的常規方法、轉染方法和培養方法是本領域技術人員熟知的。在這一方面，可以參考「Current Protocol in MolecularBiology」，1999，F.M.Ausubel(編著)，Wiley Interscience，紐約以及ColdSpring Harbor Publishing出版的Maniatis Manual。
通過本領域技術人員熟知的方法，可獲得編碼本發明抗體分子的DNA序列。例如，根據確定的DNA序列或根據相應的胺基酸序列，可按需要合成編碼部分或全部抗體重鏈和輕鏈的DNA序列。
編碼受體構架序列的DNA是本領域技術人員十分容易獲得的並可根據它們的已知胺基酸序列容易地合成。
可以用標準分子生物學技術來製備編碼本發明抗體分子的DNA序列。採用寡核苷酸合成技術，可以完全或部分合成所需要的DNA序列。適當時，也可以使用定點誘變和聚合酶鏈式反應(PCR)技術。
可以使用任何合適的宿主細胞/載體系統來表達編碼本發明抗體分子的DNA序列。細菌(例如大腸桿菌)和其它微生物系統可部分用來表達Fab和F(ab』)2片段、尤其是Fv片段和單鏈抗體片段(例如單鏈Fv)等抗體片段。真核宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)表達系統可用於製備包括完全抗體分子在內的較大抗體分子。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。
本發明也提供一種製備本發明抗體分子的方法，所述方法包括在適合導致由編碼本發明抗體分子的DNA表達蛋白質的條件下，培養含有本發明載體的宿主細胞，然後分離所述抗體分子。
所述抗體分子可以僅包含重鏈多肽或輕鏈多肽，在這種情況下，只需用重鏈多肽或輕鏈多肽編碼序列轉染宿主細胞。為製備既包含重鏈又包含輕鏈的產物，可以用兩種載體轉染細胞系，第一種載體編碼輕鏈多肽，而第二種載體編碼重鏈多肽。或者，可以使用一種載體，該載體包括編碼輕鏈多肽和重鏈多肽的序列。
本發明也提供一種治療或診斷組合物，所述組合物包含本發明的抗體分子以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
本發明也提供一種製備治療或診斷組合物的方法，所述方法包括將本發明的抗體分子與藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體混合在一起。
在所述治療或診斷組合物中，所述抗體分子可以是唯一的活性成分，或者可以同時包含其它活性成分，包括其它抗體成分(例如抗T細胞、抗IFNγ或抗LPS抗體)或者非抗體成分(例如黃嘌呤)。
優選所述藥用組合物包含治療有效量的本發明的抗體。本文所用的術語「治療有效量」是指治療、改善或預防目標疾病或病症或者表現出可檢測的治療或預防效果需要的治療藥物的量。就任何抗體而言，開始在細胞培養測定或在動物模型(通常用齧齒動物、兔、狗、豬或靈長類動物)階段可估算出治療有效劑量。也可以使用動物模型確定合適的濃度範圍和給藥途徑。然後可利用這些資料確定用於人的有效劑量和給藥途徑。
用於人患者的準確的有效量將取決於疾病狀態的嚴重程度、患者的一般健康情況、年齡、體重和性別、飲食、給藥時間和頻率、聯合用藥、反應靈敏度和耐受性/對治療的反應。該有效量可通過常規實驗方法確定並且在臨床醫師的判斷範圍之內。一般而言，有效劑量為0.01mg/kg至50mg/kg，優選0.1mg/kg至20mg/kg，更優選約15mg/kg。
組合物可單獨給予患者或與其它藥劑、藥物或激素聯合給藥。
本發明的抗體分子給予的劑量取決於待治療病症的性質、惡性淋巴瘤或白血病的分級以及抗體分子是用於預防還是用於治療現有的病症。
給藥頻率將取決於抗體分子的半壽期及其作用持續時間。如果抗體分子的半壽期短(例如2-10小時)，則可能需要每天給予1個或多個劑量。另一方面，如果抗體分子的半壽期長(例如2-15天)，則可能只需要每天、每周、甚至每1或2個月給予1個劑量。
藥用組合物也可含有用於抗體給藥的藥學上可接受的載體。所述載體自身不應該誘導對接受組合物的個體有害的抗體產生並且不應該有毒。合適的載體可以為大的代謝慢的大分子，例如蛋白質、多肽、脂質體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物和失活的病毒顆粒。
可以使用藥學上可接受的鹽，例如無機酸鹽(如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽)或有機酸鹽(如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽)。
治療組合物中的藥學上可接受的載體可另外含水、鹽水、甘油和乙醇等液體。另外，在這些組合物中可以含有潤溼劑、乳化劑或pH緩衝物質等輔料。這些載體能使藥用組合物配製成供患者攝取的片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體製劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑和混懸劑。
優選的給藥形式包括例如經注射或輸注等適合腸胃外給藥的形式，例如經快速濃注或連續輸注。其中當產品用於注射或輸注時，可採用混懸劑、溶液劑或在油性或水性介質中的乳劑形式並且可含配方劑，例如懸浮劑、防腐劑、穩定劑和/或分散劑。或者，抗體分子可為臨用前用合適的無菌液體重建的幹品形式。
一旦配成，本發明的組合物可直接給予患者。待治療的患者可以為動物。然而，優選組合物適合給予人患者。
可經以下的任何途徑給予本發明的藥用組合物，包括但不限於口、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、透皮、經皮(例如參見WO98/20734)、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。也可以使用Hypospray給予本發明的藥用組合物。這些治療組合物一般可配製成為液體溶液劑或混懸劑的可注射形式。適用於液體溶媒中的溶液劑或混懸劑的固體形式，也可在注射前配製。
組合物的直接給藥一般通過注射、皮下、腹膜內、靜脈內或肌內、或給予組織細胞間隙來實現。也可將組合物給至損傷部位。給藥治療可為單劑量方案或多劑量方案。
可理解為所述組合物中的活性成分為抗體分子。這樣，它在胃腸道內容易降解。因此，如果組合物通過採用胃腸道的途徑給藥，該組合物將需要含有保護抗體免受降解的試劑，但是一旦被胃腸道吸收，它會釋放抗體。
在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，NJ，1991)中詳細討論了藥學上可接受的載體。
也設想可通過採用基因治療來給予本發明的抗體。為實現這一點，將編碼所述抗體分子的重鏈和輕鏈且處於合適的DNA組分控制之下的DNA序列引入患者體內，以便抗體鏈由所述DNA序列表達並且在原位裝配。
本發明也提供用於治療由表達CD22的細胞介導的疾病的本發明抗體分子。
本發明還提供本發明抗體分子在製備用於治療由表達CD22的細胞介導的疾病的藥物中的用途。
本發明的抗體分子可用於其中需要降低表達存在於人或動物體內的CD22的細胞水平的任何療法。這些表達CD22的細胞可在體內循環或以不需要的高水平集中位於體內特殊部位。例如，在B細胞淋巴瘤和白血病中，表達CD22的細胞水平升高。本發明的抗體分子可用於治療由表達CD22的細胞介導的疾病。
優選本發明的抗體分子用於惡性淋巴瘤和白血病、最優選用於治療NHL。
本發明也提供一種治療患有表達CD22的細胞介導的疾病或處於這些疾病危險之中的人或動物患者的方法，所述方法包括將有效量的本發明的抗體分子給予所述患者。
本發明的抗體分子也可用於診斷，例如用於涉及表達CD22的細胞的疾病狀態的體內診斷和成象。
僅通過以下實施例並參考以下的


進一步描述本發明，其中圖1表示小鼠單克隆抗體5/44的CDR的胺基酸序列(SEQ ID NO1-6)；
圖2表示小鼠單克隆抗體5/44輕鏈可變區的全序列；圖3表示小鼠單克隆抗體5/44重鏈可變區的全序列；圖4表示CDR-H2中的糖基化位點和活性賴氨酸的去除策略；圖5表示5/44輕鏈序列的移植設計；圖6表示5/44重鏈序列的移植設計；圖7表示載體pMRR14和pMRR10.1；圖8表示嵌合5/44突變體的Biacore測定結果；圖9表示用於5/44 gH1和gL1基因裝配的寡核苷酸；圖10表示中間載體pCR2.1(544gH1)和pCR2.1(544gL1)；圖11表示用於製備其它移植物的寡核苷酸盒；圖12表示螢光標記的小鼠5/44抗體和移植變異體之間的競爭測定；和圖13表示移植重鏈和移植輕鏈的全部DNA序列和蛋白質序列。
發明詳述實施例1各代候選抗體一系列的抗CD22抗體是採用以下的選擇標準從雜交瘤中選出的與Daudi細胞結合，在Daudi細胞上內化，與外周血單核細胞(PBMC)結合，在PBMC上內化，親和力(大於10-9M)，小鼠γ1和產率。5/44是作為優選的抗體而被選出的。
實施例2嵌合5/44抗體分子的基因克隆和表達5/44雜交瘤細胞的製備及其RNA製備雜交瘤5/44是用人CD22蛋白免疫小鼠後通過常規雜交瘤技術產生的。RNA是採用RNEasy試劑盒(Qiagen，Crawley，UK；目錄號74106)從5/44雜交瘤細胞製備的。如下所述，將所獲得的RNA逆轉錄成cDNA。
CD22在NHL腫瘤上的分布使用5/44抗CD22單克隆抗體進行免疫組織化學研究，來檢查染色的發生率和分布。在該項研究中包括對照抗CD20抗體和抗CD79a抗體，以確定腫瘤的B細胞區。
共研究了50個腫瘤，並且採用Working Formulation和REAL分類系統將這些腫瘤如下分類·7個B成淋巴細胞性白血病/淋巴瘤(高/I)·4個B-CLL/小淋巴細胞性淋巴瘤(低/A)·3個淋巴漿細胞樣瘤(lymphoplasmacytoid)/免疫細胞瘤(低/A)·1個外套細胞淋巴瘤(中/F)·14個濾泡性中心細胞淋巴瘤(低至中/D)·13個彌散性大細胞淋巴瘤(中至高/G，H)·6個不能分類的淋巴瘤(K)·2個T細胞淋巴瘤用0.1μg/ml的5/44抗體，有40個B細胞淋巴瘤對CD22抗原呈陽性，並且當將濃度提高至0.5μg/ml時，又有6個呈陽性。對於剩下的2個B細胞瘤來說，在0.1μg/ml時呈陰性，剩餘的組織不足以用較高濃度測試。然而，用另一種Celltech抗CD22抗體6/13進行的平行試驗給出比5/44更強的染色，結果所有48個B細胞淋巴瘤對CD22的染色呈陽性。
因此，可以推斷CD22抗原在B細胞淋巴瘤上廣泛表達並因此為NHL的免疫療法提供了一個合適的靶。
5/44 VH和VL的PCR克隆使用逆轉錄酶合成編碼5/44重鏈可變區和輕鏈可變區的cDNA序列，產生存在於總RNA中的mRNA的單鏈cDNA拷貝。然後採用特定的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用cDNA為模板用於擴增鼠V區序列。
a)cDNA合成在含有以下試劑的20μl反應體積中合成cDNA50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、10mM二硫蘇糖醇、3mM MgCl2、脫氧核糖核苷三磷酸各0.5mM、20單位RNAsin、75ng隨機六核苷酸引物、2μg 5/44RNA和200單位莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶。42℃保溫60分鐘後，通過95℃加熱5分鐘終止該反應。
b)PCR使用對重鏈和輕鏈具有特異性的引物組合，將cDNA的等分樣品進行PCR。將設計成與信號肽的保守序列一起退火的簡併引物庫用作正向引物。所有這些序列都依次含有一個自其5』端7個核苷酸開始的限制位點(VLSfuI；VHHindIII)、使所獲得的mRNA最佳翻譯的序列GCCGCCACC(SEQ ID NO50)、一個起始密碼子和基於已知小鼠抗體的前導肽序列的20-30個核苷酸(Kabat等，Sequence of proteins ofimmunological interest，第5版，1991，U.S.Department of Health andHuman Services，Public Health Service，National Institutes of Health(美國健康與人類服務部，公共健康服務，國家健康協會))。
將3』引物設計成跨越該抗體的構架4 J-C接點並含有酶BsiWI的限制位點，以使VLPCR片段的克隆容易進行。重鏈3』引物為設計成跨越該抗體J-C接點的混合物。該3』引物包括ApaI限制位點，以使克隆容易進行。該引物的3』區含有基於在已知的小鼠抗體中發現的那些序列的混合序列(Kabat等，1991，參見上文)上述引物組合能使VH和VL的PCR產物直接克隆到合適的表達載體中(參見下文)，從而製備嵌合(小鼠-人)重鏈和輕鏈，並用於這些在哺乳動物細胞中表達的基因製備所需同種型的嵌合抗體。
按以下方法進行用於PCR的保溫(100μl)每份反應物含有10mMTris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.01％w/v明膠、脫氧核糖核苷三磷酸各0.25mM、10pmole 5』引物混合物、10pmole 3』引物、1μl cDNA和1單位Taq聚合酶。將反應物在95℃保溫5分鐘然後經過以下循環94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘。30個循環後，通過瓊脂糖凝膠電泳分析每份反應物的等分樣品。
對於重鏈V區來講，擴增的DNA產物只有當在構架I的起始位點內退火的引物庫取代信號肽引物庫時才能獲得。將片段克隆到DNA測序載體中。測定DNA序列並翻譯以給出推導出的胺基酸序列。該推導出的序列可通過參照通過實驗確定的N端蛋白質序列來證實。圖2和圖3分別表示小鼠單克隆抗體5/44的成熟輕鏈V區和重鏈V區的DNA/蛋白質序列。
c)PCR片段的分子克隆然後將鼠V區序列克隆到表達載體pMRR10.1和pMRR14(圖7)中。這些是用於分別含有編碼人κ輕鏈和人γ-4重鏈恆定區的DNA的輕鏈和重鍊表達的載體。使用SfuI和BsiWI限制位點，通過限制性消化並與測序載體連接，將所述VL區亞克隆到表達載體中，產生質粒pMRR10(544cL)。使用5』引物通過PCR擴增重鏈DNA引入信號肽，由於這在所述克隆策略—使用來自不同的近交(in-house)雜交瘤(稱為162)的小鼠重鏈抗體前導序列並沒有獲得。該5』引物具有以下的序列 5』GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3』(SEQ ID NO51)。
反向引物與用於最初的VH基因克隆的引物相同。將所得PCR產物用酶HindIII和ApaI消化，然後將其亞克隆，並確證其DNA序列，產生質粒pMRR14(544cH)。將這兩種表達載體瞬時共轉染到CHO細胞中，產生嵌合c5/44抗體。按照生產商的方案(In VitrogenLifeTechnology，Groningen，The Netherlands.目錄號11668-027)，使用Lipofectamine試劑，完成這一步。
糖基化位點和活性賴氨酸的去除在CDR-H2中觀察到一個潛在的N-聯糖基化位點序列，該序列具有胺基酸序列N-Y-T(圖3)。對5/44及其片段(包括Fab)進行的SDS-PAGE、蛋白質印跡法和凝膠糖染色法表明該位點的確糖基化(未顯示)。另外，在CDR-H2內暴露的位置觀察到賴氨酸殘基，其通過提供與可以綴合抗體的試劑綴合的額外位點，有可能降低所述抗體的結合親和力。
一個PCR策略是用於在CDR-H2序列中引入胺基酸取代，以去除糖基化位點和/或活性賴氨酸，如圖4所示。使用編碼突變N55Q、T57A或T57V的正向引物來去除所述糖基化位點(圖4)，並產生含有取代K60R的第4個正向引物，以去除所述活性賴氨酸殘基(圖4)。在這些PCR擴增的每一個中都使用構架4反向引物。PCR產物用酶XbaI和ApaI消化並插入到pMRR14(544cH)(也用XbaI和ApaI切割)中，產生編碼這些突變體的表達質粒。N55Q、T57A和T57V突變通過遠離共有序列N-X-T/S處改變胺基酸序列可去除所述糖基化位點，同時K60R突變導致潛在的活性賴氨酸被帶同樣正電荷的殘基精氨酸取代。將所得cH變異質粒與cL質粒一起共轉染，產生已表達嵌合抗體變異體。
嵌合基因活性的評價瞬時轉染到CHO細胞後，對所得嵌合基因的活性進行評價。
c)通過BiaCore分析測定親和力常數採用BIA技術，對嵌合5/44或其變異體與CD22-mFc構建體結合的親和力進行研究，其中所述嵌合5/44或其變異體的糖基化位點或活性賴氨酸已被去除。結果示於圖8。所有結合測定都在BIAcoreTM2000儀器(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典)中進行。通過固定化抗小鼠Fc捕獲CD22mFc，進行該項測定。該抗體存在於可溶相中。將樣品、標準品和對照(50μl)注射到固定化抗小鼠Fc上，然後注射到可溶相中的抗體上。每個循環之後，所述表面用50μl的40mM HCl以30μl/min再生。運用BIAevaluation 3.1軟體(Pharmacia)，進行動力學分析。
與嵌合5/44相比，構建體T57A中糖基化位點的去除導致締合速率(on-rate)稍微加快而解離速率(off-rate)顯著減慢，得到的親和力改進約為5倍。N55Q突變對親和力沒有影響。該結果是意想不到的，因為這表明糖本身的去除對結合沒有明顯的影響(如同N55Q改變一樣)。僅在T57A改中中觀察到改進的親和力。一種可能的解釋是，無論是否存在糖，位置57的蘇氨酸對結合都產生負面影響，所述結合在蘇氨酸轉變成丙氨酸時去除。丙氨酸較小是重要的並且蘇氨酸的負面影響與其大小有關的假設，可以從使用T57V突變得到的結果得到支持57位被纈氨酸取代並不好(結果未顯示)。
通過K60R突變去除賴氨酸對親和力無影響，即引入精氨酸消除了潛在的活性位點而不影響親和力。
因此，用於去除糖基化位點和用於去除活性賴氨酸的突變均包括在人源化設計中。
實施例25/44的CDR移植上面已經描述了5/44抗體重鏈可變區和輕鏈可變區基因的分子克隆及其製備嵌合(小鼠/人)5/44抗體的用途。小鼠5/44 VL區和VH區的核苷酸序列和胺基酸序列分別示於圖2和圖3(SEQ ID NO7和SEQID NO8)。按照Adair等(WO 91/09967)的方法，本實施例描述了將5/44抗體CDR移植到人構架上，以降低人體內的可能免疫原性。
5/44輕鏈的CDR移植蛋白質序列與來自人亞型Iκ輕鏈V區的共有序列比對表明有64％序列同一性。因此，為構建CDR移植輕鏈，所選的受體構架區對應於人VK亞型I種系O12，DPK9序列的那些序列。構架4受體序列來源於人J區種系序列JK1。
鼠5/44構架區的胺基酸序列與受體序列的比較在圖5給出，並顯示在供體鏈和受體鏈之間有27處不同。在每個位置，對鼠源殘基通過對堆積(packing)或在VH/VL界面產生影響而直接或間接對抗原結合產生貢獻的可能性進行分析。如果認為一個鼠源殘基重要並且與人源殘基在大小、極性或電荷方面明顯不同，那麼就該保留鼠源殘基。基於此分析，構建了兩種具有SEQ ID NO19和SEQ ID NO20(圖5)給出的序列的CDR移植輕鏈。
5/44重鏈的CDR移植採用與用於輕鏈描述的方案相同的策略，完成5/44重鏈的CDR移植。發現5/44重鏈的V區與屬於亞型I的人重鏈同源(70％序列同一性)，因此用人亞型I種系構架VH1-3，DP7的序列作為受體構架。構架4受體序列來源於人J區種系序列JH4。
5/44重鏈與構架區的比較示於圖6，其中可以發現5/44重鏈與受體序列在位置22不同。分析這些序列中的任何序列可能對抗原結合的貢獻，從而構建了5種具有以下給定序列的CDR移植重鏈SEQ IDNO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26和SEQ ID NO27(圖6)。
用於移植序列的基因的構建將基因設計成編碼移植序列gH1和gL1，並設計和構建系列重疊寡核苷酸(圖9)。採用PCR裝配技術來構建CDR移植V區基因。配製100μl含有以下組分的反應體積10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mMMgCl2、50mMKCl、0.001％明膠、脫氧核糖核苷三磷酸各0.25mM、「內部」引物(T1、T2、T3、B1、B2、B3)各1pmole、「外部」引物(F1、R1)各10pmole和1單位Taq聚合酶(AmpliTaq，AppliedBioSystems，目錄號N808-0171)。PCR循環參數為94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘，30個循環。然後將反應產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，切下電泳條帶，使用QIAGEN離心柱(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄號28706)進行回收。用30μl體積洗脫DNA。然後按照生產商的說明，將gH1和gL1 DNA的等分樣品(1μl)克隆到InVitrogen TOPOTA克隆載體pCR2.1 TOPO(目錄號K4500-01)中。該非表達載體用作克隆中間體，以便於對大量克隆進行測序。使用載體特異性引物，通過DNA測序來鑑定含有gH1和gL1的正確克隆，產生質粒pCR2.1(544gH1)和pCR2.1(544gL1)(圖10)。
使用寡核苷酸盒置換法來產生人源化移植物gH4、gH5、gH6和gH7以及gL2。圖11表示寡核苷酸盒的設計。為構建每種變異體，用所示的限制性酶(對於重鏈而言為XmaI/SacII，對於輕鏈而言為XmaI/BstEII)切下載體(pCR2.1(544gH1)或pCR2.1(544gL1))。將大載體片段用瓊脂糖凝膠電泳純化並用於與寡核苷酸盒連接。這些盒由2種互補寡核苷酸(如圖11所示)組成，在200μl體積(12.5mM Tris-HCl(pH7.5)、2.5mM MgCl2、25mM NaCl、0.25mM二硫赤蘚糖醇)中以0.5pmole/μl的濃度混合。通過在水浴(500ml體積)中加熱至95℃達3分鐘，然後讓反應物慢慢冷卻至室溫，完成退火。將已退火的寡核苷酸盒用水稀釋10倍，然後將其連接到合適的切割載體中。用DNA測序來證實正確的序列，產生質粒pCR2.1(5/44-gH4-7)和pCR2.1(5/44-gL2)。然後將這些經證實的移植序列亞克隆到表達載體pMRR14(重鏈)和pMR10.1(輕鏈)中。
CDR移植序列的CD22結合活性在各種組合中，將編碼移植變異體的載體與原始嵌合抗體鏈一起共轉染到CHO細胞中。在競爭測定中，比較原始小鼠5/44抗體的結合對與Ramos細胞(得自ATCC，一種表達表面CD22的伯基特淋巴瘤成淋巴細胞性人細胞系)結合的競爭的結合活性。該測定被認為是比較移植物與細胞表面CD22結合的能力的最佳方法。結果示於圖8。正如所見到的，在任何移植物之間存在非常小的差異，在競爭抗鼠親代方面所有都表現出比嵌合體更有效。在CDR-H3(gH5和gH7)末端引入3個額外的人源殘基並不會明顯影響結合。
選擇與最少數量的鼠源殘基結合的移植物即gL1gH7。輕鏈移植物gL1有6個供體殘基。殘基V2、V4、L37和Q45是潛在的重要堆積殘基。殘基H38位於VH/VL界面。殘基D60為靠近CDR-L2的表面殘基並且可直接對抗原結合作出貢獻。這些殘基中，V2、L37、Q45和D60存在於來自其它亞型的人κ基因的種系序列。重鏈移植物gH7有4個供體構架殘基(根據CDR移植中使用的結構定義(參見Adair等(1991，WO 91/09967)，殘基R28被認為是CDR-H1的一部分)。殘基E1和A71為靠近CDR的表面殘基。殘基I48為潛在的堆積殘基。殘基T93存在於VH/VL界面。這些殘基中，E1和A71存在於人亞型I的其它種系基因中。殘基I48存在於人種系亞型4中，而T73存在於人種系亞型3中。
輕鏈和重鏈兩者的全部DNA序列和蛋白質序列，包括由載體提供的恆定區基因內的內含子的大致位置，如圖13所示，並分別在SEQID NO29和SEQ ID NO28中給出(對於輕鏈)以及分別在SEQ IDNO31和SEQ ID NO30中給出(對於重鏈)。
從這些載體中切下編碼這些輕鏈和重鏈基因的DNA。重鏈DNA在5』HindIII位點消化，然後用大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段處理，產生5』平端。在3』EcoRI位點切割，產生重鏈片段，然後通過瓊脂糖凝膠純化。同樣，產生輕鏈片段，在5』SfuI位點平端化並用3』EcoRI位點。將這兩個片段克隆到基於DHFR的表達載體中並用來在CHO細胞中產生穩定的細胞系。
序列表110細胞技術研究及開發有限公司(Celltech RD Limited)120生物製品16051170SeqWin99，version 1.0221012115212PRT213小家鼠(Mus.musculus)220
223小鼠單克隆抗體5/44 CDR-H14001Asn Tyr Trp Ile His1 5210221117212PRT213小家鼠(Mus.musculus)220
223小鼠單克隆抗體5/44 CDR-H24002Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys1 5 10 15Gly
210321112212PRT213小家鼠(Mus.musculus)220
223小鼠單克隆抗體5/44 CDR-H34003Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr1 5 10210421116212PRT213小家鼠(Mus.musculus)220
223小鼠單克隆抗體5/44 CDR-L14004Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser1 5 10 1521052117212PRT213小家鼠(Mus.musculus)220
223小鼠單克隆抗體5/44 CDR-L24005Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser1 5
21062119212PRT213小家鼠(Mus.musculus)220
223小鼠單克隆抗體5/44 CDR-L34006Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr1 52107211113212PRT213小家鼠(Mus.musculus)220
223鼠單克隆抗體5/44 VL區4007Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly1 5 10 15Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser20 25 30Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly85 90 95Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg
2108211121212PRT213小家鼠(Mus.musculus)220
223小鼠單克隆抗體5/44 VH區4008Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr20 25 30Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120210921113212PRT213人工序列220
223cH4009Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly1 5 10
2101021113212PRT213人工序列220
223N55Q40010Gly Asn Gln Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly1 5 102101121113212PRT213人工序列220
223T57A40011Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly1 5 102101221113212PRT213人工序列220
223T57V40012Gly Asn Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly1 5 10
2101321117212PRT213人工序列220
223CDR-H2(T57A)H』40013Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys1 5 10 15Gly2101421113212PRT213人工序列220
223K60R40014Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Gly1 5 102101521117212PRT213人工序列220
223CDR-H2(K60R)H」40015
Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys1 5 10 15Gly2101621117212PRT213人工序列220
223CDR-H2(T57A K60R)H40016Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys1 5 10 15Gly2101721170212PRT213人(Homo sapiens)220
223DPK940017Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala20 25 30Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly35 40 45Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp50 55 60
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys65 702101821111212PRT213人(Homo sapiens)220
223JK140018Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg1 5 1021019211113212PRT213人工序列220
223gL140019Asp Val Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser20 25 30Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Lys Ala35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly85 90 95
Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg21020211113212PRT213人工序列220
223gL240020Asp Val Val Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser20 25 30Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Lys Ala35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly85 90 95Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg2102121180212PRT213人(Homo sapiens)220
223DP7
40021Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Trp Val20 25 30Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Lys Phe Gln Gly35 40 45Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu50 55 60Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg65 70 75 802102221111212PRT213人(Homo sapiens)220
223JH440022Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser1 5 1021023211121212PRT213人工序列220
223gH140023Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr20 25 30Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Gln Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu50 55 60Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 12021024211121212PRT213人工序列220
223gH440024Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr20 25 30Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu50 55 60Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 12021025211121212PRT213人工序列220
223gH540025Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr20 25 30Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu50 55 60Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 12021026211121212PRT213人工序列220
223gH640026Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr20 25 30Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 12021027211121212PRT213人工序列220
223gH740027Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr20 25 30Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 12021028211239212PRT213人工序列220
223移植輕鏈的全序列40028Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp Ile Pro1 5 10 15Ala Ser Arg Gly Asp Val Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser20 25 30Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser35 40 45Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys50 55 60Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe65 70 75 80Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr100 105 110Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys115 120 125Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp165 170 175Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp180 185 190Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 23521029211781212DNA213人工序列220
223移植輕鏈的全部DAN序列40029ttcgaagccg ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttgg tgcttctgtt gttctggatt60cctgcttccc ggggtgacgt tcaagtgacc cagagcccat ccagcctgag cgcatctgta120ggagaccggg tcaccatcac ttgtagatcc agtcagagtc ttgcaaacag ttatgggaac180acctttttgt cttggtatct gcacaaacca ggtaaagccc cacaattgct catctacgga240atctctaaca gatttagtgg tgtaccagac aggttcagcg gttccggaag tggtactgat300ttcaccctca cgatctcgtc tctccagcca gaagatttcg ccacttatta ctgtttacaa360ggtacacatc agccgtacac attcggtcag ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta420gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc480tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg540gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac600agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa660gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac720aggggagagt gttagaggga gaagtgcccc cacctgctcc tcagttccag cctgggaatt780c781
21030211467212PRT213人工序列220
223移植重鏈的全序列40030Met Asp Phe Gly Phe Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe35 40 45Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg65 70 75 80Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser85 90 95Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala115 120 125Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu145 150 155 160Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val195 200 205Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn210 215 220
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser225 230 235 240Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly245 250 255Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln275 280 285Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile340 345 350Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Leu Gly Lys465210312112160212DNA213人工序列
220
223移植重鏈的全部DNA序列40031aagcttgccg ccaccatgga cttcggattc tctctcgtgt tcctggcact cattctcaag 60ggagtgcagt gtgaggtgca attggtccag tcaggagcag aggttaagaa gcctggtgct 120tccgtcaaag tttcgtgtaa ggctagcggc tacaggttca caaattattg gattcattgg 180gtcaggcagg ctccgggaca aggcctggaa tggatcggtg gcattaatcc cgggaataac 240tacgctacat ataggagaaa attccagggc agagttacga tgaccgcgga cacctccaca 300agcactgtct acatggagct gtcatctctg agatccgagg acaccgcagt gtactattgt 360actagagaag gctacggtaa ttacggagcc tggttcgcct actggggcca gggtacccta 420gtcacagtct cctcagcttc tacaaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc 480aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag 780ccctcctgcc tggacgcacc ccggctgtgc agccccagcc cagggcagca aggcatgccc 840catctgtctc ctcacccgga ggcctctgac caccccactc atgcccaggg agagggtctt 900ctggattttt ccaccaggct ccgggcagcc acaggctgga tgcccctacc ccaggccctg 960cgcatacagg ggcaggtgct gcgctcagac ctgccaagag ccatatccgg gaggaccctg1020cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc agacaccttc1080tctcctccca gatctgagta actcccaatc ttctctctgc agagtccaaa tatggtcccc1140catgcccacc atgcccaggt aagccaaccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca1200ggtgccctag agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cgcatccacc1260tccatctctt cctcagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca1320aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac1380gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat1440aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc1500ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac1560aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccacggg1620gtgcgagggc cacatggaca gaggtcagct cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc1680tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc1740atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta1800ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac1860cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga1920
caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca1980caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaatgagtgc cagggccggc2040aagcccccgc tccccgggct ctcggggtcg cgcgaggatg cttggcacgt accccgtcta2100catacttccc aggcacccag catggaaata aagcacccac cactgccctg gctcgaattc21602103221194212DNA213人工序列220
223544gH1 T140032agtgtgaggt gcaattggtc cagtcaggag cagaggttaa gaagcctggt gcttccgtca60aagtttcgtg taaggctagc ggctacaggt tcac942103321196212DNA213人工序列220
223544gH1 T240033gtggcattaa tcccgggaat cagtacacta catataaaag aaatctaaagggcagagcaa60cgctgaccgc ggacacctcc acaagcactg tctaca 962103421195212DNA213人工序列220
223544gH1 T3
40034agagaaggct acggtaatta cggagcctgg ttcgcctact ggggccaggg taccctagtc60acagtctcct cagcttctac aaagggccca agaaa 952103521194212DNA213人工序列220
223544 gH1 B140035ggaccaattg cacctcacac tgcactccct tgagaatgag tgccaggaac acgagagaga60atccgaagtc catggtggcg gcaagctttt attc942103621197212DNA213人工序列220
223544gH1 B240036gattcccggg attaatgcca ccgatccatt ccaggccttg tcccggagcc tgcctgaccc60aatgaatcca ataatttgtg aacctgtagc cgctagc 972103721193212DNA213人工序列220
223544gH1 B340037
cgtaattacc gtagccttct ctagtacaat agtacactgc ggtgtcctcg gatctcagag60atgacagctc catgtagaca gtgcttgtgg agg 932103821121212DNA213人工序列220
223544gH1 F140038gaataaaagc ttgccgccac c 212103921122212DNA213人工序列220
223544gH1 R140039tttcttgggc cctttgtaga ag 222104021187212DNA213人工序列220
223544 gL1 T140040gcttcccggg gtgacgttca agtgacccag agcccatcca gcctgagcgc atctgtagga60gaccgggtca ccatcacttg tagatcc87
2104121190212DNA213人工序列220
223544 gL1 T240041tatctgcaca aaccaggtaa agccccacaa ttgctcatct acggaatctc taacagattt60agtggtgtac cagacaggtt cagcggttcc 902104221191212DNA213人工序列220
223544gL1 T340042agatttcgcc acttattact gtttacaagg tacacatcag ccgtacacat tcggtcaggg60tactaaagta gaaatcaaac gtacggcgtg c 912104321188212DNA213人工序列220
223544gL1 B140043gaacgtcacc ccgggaagca ggaatccaga acaacagaag caccaacagc ctaacaggca60acttcatggt ggcggcttcg aatcatcc 8821044
21188212DNA213人工序列220
223544gL1 B240044ctttacctgg tttgtgcaga taccaagaca aaaaggtgtt cccataactg tttgcaagac60tctgactgga tctacaagtg atggtgac 882104521190212DNA213人工序列220
223544gL1 B340045aacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggagagacga gatcgtgagg gtgaaatcag60taccacttcc ggaaccgctg aacctgtctg 902104621120212DNA213人工序列220
223544gL1 F140046ggatgattcg aagccgccac202104721121212DNA
213人工序列220
223544gL1 R140047gcacgccgta cgtttgattt c 2121048211339212DNA213小家鼠(Mus.musculus)220
223小鼠單克隆抗體5/44 VL的DNA序列40048gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca gctttggaga tcaagtttct 60atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacacctt tttgtcttgg120tacctgcaca agcctggcca gtctccacag ctcctcatct atgggatttc caacagattt180tctggggtgc cagacaggtt cactggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc240agcacaataa agcctgagga cttgggaatg tattactgct tacaaggtac acatcagccg300tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgt 33921049211363212DNA213小家鼠(Mus.musculus)220
223小鼠單克隆抗體5/44 VH的DNA序列40049gaggtccaac tgcagcagtc tgggactgta ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60tcctgcaagg cttctggcta caggtttacc aactactgga ttcactgggt aaaacagagg120cctgggcagg gtctagaatg gattggtggt attaatcctg gaaataatta tactacgtat180aagaggaact tgaagggcaa ggccacactg actgcagtca catccgccag cactgcctac240
atggacctca gcagcctgac aagtgaggac tctgcggtct attactgtac aagagagggc300tatggtaact acggggcctg gtttgcttac tggggccagg ggactctggt caccgtctcc360tca 363210502119212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物內的序列40050gccgccacc921051211101212DNA213人工序列220
2235』寡核苷酸引物40051gcgcgcaagc ttgccgccac catggacttc ggattctctc tcgtgttcct ggcactcatt 60ctcaagggag tgcagtgtga ggtgcagctc gtcgagtctg g10權利要求
1.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區包含CDR的重鏈，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對於CDR-H1在圖1中的H1(SEQ ID NO1)；對於CDR-H2在圖1中的H2(SEQ ID NO2)，或H2』(SEQ ID NO13)或H2」(SEQ IDNO15)或H2(SEQ ID NO16)；或對於CDR-H3在圖1中的H3(SEQID NO3)。
2.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區包含CDR的輕鏈，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對於CDR-L1在圖1中的L1(SEQ ID NO4)、對於CDR-L2在圖1中的L2(SEQ ID NO5)或對於CDR-L3在圖1中的L3(SEQ IDNO6)。
3.權利要求1或2的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區包含CDR的重鏈，所述CDR具有以下給出的序列中的至少一種CDR-H1的SEQ ID NO1，CDR-H2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13或SEQ ID NO15或SEQ ID NO16，或CDR-H3的SEQ ID NO3；和其中可變區包含CDR的輕鏈，所述CDR具有以下給出的序列中的至少一種CDR-L1的SEQ ID NO4、CDR-L2的SEQ ID NO5或CDR-L3的SEQ ID NO6。
4.權利要求3的抗體分子，所述抗體分子包含CDR-H1的SEQ IDNO1；CDR-H2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13或SEQ ID NO15或SEQ ID NO16；CDR-H3的SEQ ID NO3；CDR-L1的SEQ ID NO4；CDR-L2的SEQ ID NO5；和CDR-L3的SEQ ID NO6。
5.權利要求1-4中任一項的抗體分子，所述抗體分子是CDR移植抗體分子。
6.權利要求5的抗體分子，其中所述可變區包含人受體構架區和非人類供體CDR。
7.權利要求6的抗體分子，其中所述重鏈可變區的人受體構架區基於人亞型I共有序列並且在位置1、28、48、71和93包含供體殘基，所述供體殘基對應於SEQ ID NO8中這些位置的殘基。
8.權利要求7的抗體分子，所述抗體分子還在位置67和69包含供體殘基，所述供體殘基對應於SEQ ID NO8中這些位置的殘基。
9.權利要求6-8中任一項的抗體分子，其中所述輕鏈可變區的人受體構架區基於人亞型I共有序列並且在位置2、4、37、38、45和60包含供體殘基，所述供體殘基對應於SEQ ID NO7中這些位置的殘基。
10.權利要求9的抗體分子，所述抗體分子還在位置3包含供體殘基，所述供體殘基對應於SEQ ID NO7中該位置的殘基。
11.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含權利要求7或權利要求8中任一項的重鏈和權利要求9或權利要求10中任一項的輕鏈。
12.權利要求1-11中任一項的抗體分子，所述抗體分子包含輕鏈可變區5/44-gL1(SEQ ID NO19)和重鏈可變區5/44-gH7(SEQ IDNO27)。
13.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含輕鏈，其中所述輕鏈的序列包含SEQ ID NO28中給出的序列。
14.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含輕鏈，其中所述輕鏈的序列由SEQ ID NO28中給出的序列組成。
15.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含重鏈，其中所述重鏈的序列包含SEQ ID NO30中給出的序列。
16.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含重鏈，其中所述重鏈的序列由SEQ ID NO30中給出的序列組成。
17.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子具有輕鏈和重鏈，所述輕鏈包含SEQ ID NO28中給出的序列，而所述重鏈包含SEQ ID NO30中給出的序列。
18.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子具有輕鏈和重鏈，所述輕鏈由SEQ ID NO28中給出的序列組成，而所述重鏈由SEQ ID NO30中給出的序列組成。
19.一種權利要求1-18中任一項的抗體分子的變異體，所述變異體對CD22具有改進的親和力。
20.權利要求19的變異體，所述變異體通過親和力成熟方案獲得。
21.權利要求1-4中任一項的抗體分子，所述抗體分子是鼠抗CD22單克隆抗體5/44，其中所述輕鏈的可變區具有SEQ ID NO7中給出的序列，而所述重鏈的可變區具有SEQ ID NO8中給出的序列。
22.權利要求1-4中任一項的抗體分子，所述抗體分子是包含權利要求21的單克隆抗體的輕鏈可變區序列和重鏈可變區序列的嵌合抗體分子，所述序列分別在SEQ ID NO7和SEQ ID NO8中給出。
23.一種包含雜種CDR的抗體分子，所述CDR包含截短的供體CDR序列，其中所述供體CDR的缺失部分被不同的序列取代並且形成功能性CDR。
24.權利要求23的抗體分子，其中所述CDR序列的缺失部分源自所述抗體分子的構架區所來源的抗體。
25.權利要求24的抗體分子，其中所述CDR序列的缺失部分源自具有共有構架區的種系抗體。
26.權利要求23-25中任一項的抗體分子，其中在所述抗體分子中所述重鏈的CDR-H2是雜種。
27.權利要求23-26中任一項的抗體分子，其中所述供體CDR的截短是去除1-8個胺基酸。
28.權利要求27的抗體分子，其中所述截短是去除4-6個胺基酸。
29.權利要求23-28中任一項的抗體分子，其中在所述CDR的C末端進行所述截短。
30.一種DNA序列，所述DNA序列編碼權利要求1-29中任一項的抗體分子的重鏈和/或輕鏈。
31.一種克隆載體或表達載體，所述載體包含權利要求30的DNA序列。
32.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求31的克隆載體或表達載體。
33.權利要求1-29中任一項的抗體分子或權利要求30的DNA序列，所述抗體分子或所述DNA序列用於治療中。
34.權利要求1-29或權利要求33中任一項的對人CD22具有特異性的抗體分子或者權利要求30的DNA序列，所述抗體分子或所述DNA序列用於治療由表達CD22的細胞介導的疾病。
35.權利要求33或權利要求34的抗體分子或者權利要求33或權利要求34的DNA序列，所述抗體分子或所述DNA序列用於治療惡性淋巴瘤。
36.權利要求35的抗體分子或DNA序列，其中所述惡性淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
37.權利要求1-29中任一項的對人CD22具有特異性的抗體分子或權利要求30的DNA序列在製備用於治療由表達CD22的細胞介導的疾病的藥物中的用途。
38.權利要求37的用途，其中所述疾病是惡性淋巴瘤。
39.權利要求38的用途，其中所述惡性淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
40.一種治療或診斷組合物，所述組合物包含權利要求1-29中任一項的抗體分子或權利要求30的DNA序列。
41.權利要求40的治療或診斷組合物，所述組合物包含藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
42.權利要求40或權利要求41的治療或診斷組合物，所述組合物還包含抗T細胞、抗IFNγ或抗LPS抗體，或者非抗體成分例如黃嘌呤。
43.一種製備權利要求1-29中任一項的抗體分子的方法，所述方法包括在適合導致由編碼所述抗體分子的DNA表達蛋白質的條件下，培養權利要求32的宿主細胞，然後分離所述抗體分子。
44.一種製備權利要求40-42中任一項的治療或診斷組合物的方法，所述方法包括將權利要求1-29中任一項的抗體分子與藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體混合在一起。
45.一種多肽，所述多肽具有SEQ ID NO1-28中任一個或SEQ IDNO30中給出的胺基酸序列。
全文摘要
本發明公開了含有至少一個CDR的抗體分子，所述CDR源自對人CD22具有特異性的小鼠單克隆抗體。本發明也公開了一種其中所述CDR中至少一個為修飾CDR的CDR移植抗體。本發明還公開了編碼所述抗體分子的鏈的DNA序列、載體、轉化宿主細胞以及所述抗體分子在治療由表達CD22的細胞介導的疾病中的用途。
文檔編號A61K39/395GK1662558SQ03815043
公開日2005年8月31日 申請日期2003年5月2日 優先權日2002年5月2日
發明者A·G·波普勒維爾, S·P·蒂克爾, H·M·拉迪曼 申請人:細胞技術研究及開發有限公司