一種幹擾素髮酵液的製備方法

2023-05-19 07:18:16 2

專利名稱：一種幹擾素髮酵液的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物製品領域，具體的說是提供一種幹擾素髮酵液的製備方法。
背景技術：
幹擾素(interference，IFN)是一類多功能細胞因子，它是由培養的細胞或動物體受到適宜的刺激時所產生的一種微量的、具有高度生物學活性的非特異性抗病毒物質。 英國科學家Aliek等(1957)利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒幹擾現象時，從中獲得了一種高活性多功能的糖蛋白，該蛋白能夠抑制流感病毒在絨毛尿囊膜細胞中的繁殖，他們稱其為幹擾素(interferon，IFN)。Lamp son等(196 純化了幹擾素，證明其是分子質量為 20 34ku的蛋白質。近年來，幹擾素一直是病毒學、細胞學、分子生物學、臨床醫學、免疫學、腫瘤學等相關領域的研究熱點。為了實現穩定的工業化發酵生產工藝，獲得高產量高效價的工程菌體，設計適宜工程菌的培養基及發酵工藝是一項非常重要的工作。目前，對工程菌的發酵培養通常採用的是分批式培養方法。這種培養方式的培養初期，培養基中的營養物質過高會抑制工程菌的生長，培養的中後期，又因營養物的消耗而降低培養效率，且單批產量和表達IFN活性不是很高。為解決這個問題，對發酵工藝進行了改進，採用了反饋式流加培養。連續或間斷測定限制性營養物質的濃度，並以此為目標來調解流加速率或流加液中營養物質濃度等。利用DO值及測定糖(碳源)來調控流加速度及量。

發明內容
本發明的目的是提供一種幹擾素髮酵液的製備方法。本發明的技術方案概述如下(1)用YPD液體培養基為種子培養基，28 30°C有氧條件下培養畢赤酵母菌20 Mh，成為一級種子；(2)將一級種子液接種在YPD液體培養基二級種子培養基中培養，28 30°C有氧條件下培養畢赤酵母菌20 Mh，成為二級種子；(3)發酵罐實消，進行發酵擴大培養首先將發酵罐的PH電極和溶氧電極進行標定，然後加入發酵培養基、甘油，同時在高壓滅菌前還需要將蠕動泵調節為手動方式，流加氨水，調PH至5.0，最後121°C 30min高壓滅菌。滅菌結束後，等培養基溫度降至時，用種子流加管接種，發酵培養基、甘油、種子的添加比例為50 3 5，必須確保無菌操作，同時記錄發酵罐參數。在觀 30°C有氧條件下，採用流加補料發酵方式培養90 120h。在發酵過程中，當培養至30h (Α值達到72 90)時，工程菌便進入加速生長階段，此時需要由蠕動泵來補加培養液，通過DO值控制流加速度。當DO迅速上升時，準備流加甲醇；發酵液 PH調節通過自動流加氨水；消泡劑同樣自動補料。培養至30h時每隔證抽樣一次，培養至 80h後間隔池抽樣一次，測溼重、A值及幹擾素效價。(4)發酵結束後，將發酵液經5000rpm 15min離心，收集上清液。上清液即為重組酵母菌經過誘導表達的幹擾素髮酵液，然後將發酵液用0. Olmol/L的磷酸鹽緩衝液進行脫鹽、濃縮，並用0. 22 μ m的微孔濾膜無菌過濾處理，即可得到幹擾素原液；菌體沉澱在乾燥箱中40°C烘乾成乾粉。所得乾粉以1 5比例拌料使用。所述的步驟(1)中種子培養時間為優選Mh，培養溫度。所述的步驟O)中種子培養時間為優選Mh，培養溫度。所述的步驟(3)中所述的發酵培養時間最優為IlOh本發明的有益效果是本發明的方法能改善固體發酵難於分離菌體及其代謝物的難題，使重組酵母菌及其代謝物被充分利用。採用流加式發酵方式使產菌量大大提高，利於工業化大量產生。因為該方法在菌體進入減速期前，新的營養物質不斷補充，使得工程菌自始至終處於最優環境。 這樣延遲了穩定期，也就延長了對數期。所以用本發明的方法製備的幹擾素髮酵液，它表達的IFN的活性和純度均比較高；菌體飼料添加劑應用於畜禽類時，可不使用抗生素和激素， 並能促進畜禽類的生長。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述。實施例1 幹擾素髮酵液的製備方法，包括下述步驟(1)用YPD液體培養基為種子培養基，28 30°C有氧條件下培養畢赤酵母菌20 Mh，成為一級種子；(2)將一級種子液接種在YPD液體培養基二級種子培養基中培養，28 30°C有氧條件下培養畢赤酵母菌20 Mh，成為二級種子；(3)發酵罐實消，進行發酵擴大培養首先將發酵罐的PH電極和溶氧電極進行標定，然後加入發酵培養基、甘油，同時在高壓滅菌前還需要將蠕動泵調節為手動方式，流加氨水，調PH至5.0，最後121°C 30min高壓滅菌。滅菌結束後，等培養基溫度降至時，用種子流加管接種，發酵培養基、甘油、種子的添加比例為50 3 5，必須確保無菌操作，同時記錄發酵罐參數。在觀 30°C有氧條件下，採用流加補料發酵方式培養90 120h。在發酵過程中，當培養至30h (Α值達到72 90)時，工程菌便進入加速生長階段，此時需要由蠕動泵來補加培養液，通過DO值控制流加速度。當DO迅速上升時，準備流加甲醇；發酵液 PH調節通過自動流加氨水；消泡劑同樣自動補料。培養至30h時每隔證抽樣一次，培養至 80h後間隔池抽樣一次，測溼重、A值及幹擾素效價。(4)發酵結束後，將發酵液經5000rpm 15min離心，收集上清液。上清液即為重組酵母菌經過誘導表達的幹擾素髮酵液，然後將發酵液用0. 01mol/L的磷酸鹽緩衝液進行脫鹽、濃縮，並用0. 22 μ m的微孔濾膜無菌過濾處理，即可得到幹擾素原液；菌體沉澱在乾燥箱中40°C烘乾成乾粉。所得乾粉以1 5比例拌料使用。實施例2 流加式培養與批式培養的比較當發酵結束時，分別記錄流加式培養與批式培養的菌體量及IFN產量。具體結果如下表所示表1流加式培養與批式培養的菌體量及IFN產量比較
權利要求
1.一種幹擾素髮酵液的製備方法，其特徵在於包括下述步驟(1)用YPD液體培養基作為種子培養基，28 30°C有氧條件下搖床培養畢赤酵母菌 20 Mh，成為一級種子；(2)將一級種子液接種於YPD液體培養基二級種子培養基中培養，28 30°C有氧條件下培養畢赤酵母菌20 Mh，成為二級種子；(3)發酵罐實消，進行發酵擴大培養首先將發酵罐的PH電極和溶氧電極進行標定，然後加入發酵培養基、甘油，最後121°C 30min高壓滅菌，滅菌結束後，培養基溫度降至時，用種子流加管接種，確保無菌操作，同時記錄發酵罐參數，在觀 30°C有氧條件下，採用流加補料發酵方式培養90 120h ；(4)發酵結束後，將發酵液經5000rpm15min離心，上清液即為重組酵母菌經過誘導表達的幹擾素髮酵液，然後將發酵液進行脫鹽、濃縮、無菌過濾處理，即可得到幹擾素原液；菌體沉澱用白色澱維粉吸附，在乾燥箱中40°C烘乾成乾粉。
2.根據權利要求1所述的一種幹擾素髮酵液的製備方法，其特徵在於所述步驟(1)中種子培養時間為Mh，培養溫度^°C。
3.根據權利要求1所述的一種幹擾素髮酵液的製備方法，其特徵在於所述步驟(1)中 YPD液體培養基含有1%蛋白腖、0. 5%酵母提取物、0. 5% NaCl。
4.根據權利要求1所述的一種幹擾素髮酵液的製備方法，其特徵在於所述步驟O)中種子培養時間為Mh，培養溫度^°C。
5.根據權利要求1所述的一種幹擾素髮酵液的製備方法，其特徵在於所述步驟(3) 中發酵培養基在IOOOml水中，加入IOml (1% )的黃豆餅浸出汁，IOg葡萄糖，3g蛋白腖， 2.5gNaCl，2gCaC03。
6.根據權利要求1所述的一種幹擾素髮酵液的製備方法，其特徵在於所述步驟(3)中發酵培養時間為110h，發酵培養基、甘油、種子的添加比例為50 3 5。
7.根據權利要求1所述的一種幹擾素髮酵液的製備方法，其特徵在於所述步驟中脫鹽處理是用0. 01mol/L的磷酸緩衝液(pH7. 5-8. 0)。
8.根據權利要求1所述的一種幹擾素髮酵液的製備方法，其特徵在於所述步驟中所述乾粉以15比例拌料使用。
全文摘要
本發明公開了一種幹擾素髮酵液的製備方法，包括下述步驟(1)用YPD液體培養基復活畢赤酵母菌，作為一級種子；(2)將復活的全部菌液進行擴大培養，作為二級種子；(3)發酵罐實消，進行發酵培養；(4)下罐，並將發酵液進行離心、脫鹽處理，然後無菌過濾，即得幹擾素髮酵液。將發酵液離心，菌體沉澱用白色澱維粉作為載體吸附乾燥製備乾粉，作為飼料添加劑。本發明的方法能改善固體發酵難於分離菌體的問題，可極大提高純化效率，而且採用流加式發酵培養使產菌量大大提高，利於工業化大生產。同時酵母菌代謝物也被充分利用。本發明的菌體乾粉飼料添加劑在應用於畜禽類時，能促進畜禽類的生長及免疫力提高。
文檔編號C12R1/84GK102399846SQ20101027986
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月13日 優先權日2010年9月13日
發明者劉桂蘭, 劉愛玲, 王偉穎, 聶麗娜 申請人:瑞普(天津)生物藥業有限公司