用於兩用青貯飼料貯存的異型發酵和同型發酵的乳酸細菌菌種的改良組合物的製作方法

2023-05-05 06:14:16 3

本發明提供了例如可用於青貯飼料生產和保存的改良的細菌接種劑組合物。在具體的實施方案中，所述組合物包含專性異型發酵菌種(或其菌株)，諸如，乳桿菌屬(lactobacillus)菌種，和同型發酵菌種(或其菌株)，諸如乳球菌屬(lactococcus)或腸球菌屬(enterococcus)菌種(或其菌株)。所述組合物可用於生產發酵飼料產品，諸如青貯飼料。因此，本發明還提供了包括用本文所述的細菌接種劑組合物接種植物材料的方法。在一些實施方案中，接種後的材料適用於短培養期，諸如2、3、4、5、6、7或8天的孵育時間。

背景技術：

青貯飼料是可用於飼養反芻動物的發酵植物產品。青貯飼料可由各種植物材料製成，所述植物材料在厭氧條件下儲存以促進厭氧發酵。可以加入細菌接種劑促進發酵過程和/或改良青貯飼料產品。通過建立厭氧條件和通過快速降低ph來保存青貯飼料，所述ph快速降低與土著菌或接種的乳酸菌產生有機酸有關。低ph抑制許多腐敗菌生長，否則會導致喪失大量的營養物質。

當青貯飼料暴露於空氣時，諸如當青貯倉、青貯窖、青貯堆或卷開放以便接近青貯飼料進行使用時，有氧條件可導致存在於青貯飼料中的任何需養腐敗菌株生長。需氧腐敗菌株的生長導致溫度升高，營養成分高度損失。

因此，在發酵過程開始時的腐敗和在催肥時的需氧腐敗兩者代表了農民的重大經濟損失的來源。

第一代細菌青貯接種劑包括專性同型發酵細菌菌種(例如，嗜酸乳桿菌(l.acidophilius)、唾液乳桿菌(l.salivarius))和兼性異型發酵(例如，植物乳桿菌(l.plantarum))細菌菌種，其旨在快速降低ph以防止植物材料中天然存在的腐敗菌株生長，所述腐敗菌株如革蘭氏陰性腸桿菌科(enterobacteraceae)(例如，沙門氏菌屬(salmonella)、大腸桿菌(escherichiacoli)、鼠疫耶爾森氏菌(yersiniapestis)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、志賀氏菌屬(shigella))或革蘭氏陽性梭菌屬(clostridia)(酪丁酸梭菌(c.tyrobutyricum)、產氣莢膜梭菌(c.perfringens)、肉毒桿菌(c.botulinum)、產芽孢梭菌(c.sporogenes)、丁酸梭菌(丁酸梭菌))。通過快速降低ph來防止腐敗菌株減少了營養素損失並往往在一定程度上提高有氧穩定性(jatkauskas等人(2013),jatkauskas和vrotniakiene(2013))。

第二代細菌青貯接種劑關注於布氏乳桿菌(l.buchneri)，一種專性異型發酵菌種，發現當青貯倉/青貯堆暴露於空氣時，該菌在防止催肥時由需氧腐敗菌種造成的需氧腐敗方面有優勢。然而，使用布氏乳桿菌作為細菌青貯接種劑的缺點在於相比於其它菌種其具有較長的滯後期，且與專性同型發酵或兼性異型發酵菌種相比，在發酵的早期階段其生產的乙酸和乳酸不會快速降低ph。

來自jatkauskas和vrotniakiene(2013)的圖1圖示了就有氧穩定性(即，當再次暴露於空氣時對於需氧腐敗菌株而言使青貯倉升溫所花費的時間)而言，單獨布氏乳桿菌(p0)優於其它測試產品。在保持低溫持續許多小時方面第二好的產品是專性異型發酵/兼性異型發酵/同型發酵組合產品，該產品包含布氏乳桿菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、(p1)，下一個最好的產品是純兼性異型發酵/同型發酵產品，其含有植物乳桿菌、屎腸球菌、含有苯甲酸鈉的乳酸乳桿菌(l.lactis)(p2a)或不含苯甲酸鈉的乳酸乳桿菌(p2b)；兼性異型發酵/同型發酵產品，其含有植物乳桿菌、屎腸球菌、乳酸乳桿菌、(p3)；和兼性異型發酵產品，其含有植物乳桿菌的兩個菌株，(p4)。(未接種的青貯飼料具有最低的有氧穩定性。)

因此，仍然存在對改良的細菌青貯接種劑組合物的需求。

技術實現要素：

提供了例如可用於青貯飼料生產和保存的改良的細菌接種劑組合物。還提供了包括用本文所述的細菌接種劑組合物接種植物材料的方法。

在一些實施方案中，提供了青貯接種劑，所述青貯接種劑基本上由以下各項組成：(a)至少一種專性異型發酵乳酸細菌菌種(或其菌株)和(b)至少一種同型發酵細菌菌種(或其菌株)，所述同型發酵細菌菌種(或其菌株)(i)不降低所述至少一種專性異型發酵乳酸細菌菌種或菌株(a)的生長，以及(ii)快速地降低ph而不產生過量的乳酸。在一些實施方案中，至少一種專性異型發酵乳酸細菌菌種(或其菌株)是選自由下列各項組成的組的明串珠菌屬菌種或乳桿菌屬菌種：短乳桿菌、布氏乳桿菌、發酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌(或其菌株)。在一些實施方案中，專性異型發酵乳酸細菌菌種(或其菌株)是保藏編號為dsm22501的布氏乳桿菌。在一些實施方案中，至少一種同型發酵細菌菌種或菌株是腸球菌屬，例如，屎腸球菌。在一些實施方案中，至少一種同型發酵細菌菌種或菌株是乳球菌屬，諸如乳酸乳球菌，諸如保藏編號為dsm11037的菌株。在具體的實施方案中，青貯接種劑基本上由布氏乳桿菌和乳球菌屬組成。

在一些實施方案中，提供了生產發酵飼料產品的方法，包括用如本文所述的青貯接種劑接種植物材料。在一些實施方案中，所述植物材料與所述青貯接種劑孵育持續多達2天、或多達4天、或多達7天、或多達8天、或多達14天、或多達28天、或至少90天的時期。

發明詳述

如上所述，本發明提供了例如可用於青貯飼料生產和保存的改良細菌接種劑組合物。在具體的實施方案中，所述組合物包含專性異型發酵菌種(或其菌株)，諸如乳桿菌屬菌種，和同型發酵菌種(或其菌株)，諸如乳球菌屬或腸球菌屬菌種。所述組合物可用於生產發酵飼料產品，諸如青貯飼料。因此，還提供了包括用本文所述的細菌接種劑組合物接種植物材料的方法。在一些實施方案中，接種後的材料適合用於在短孵育期後使用。

定義

在描述本發明的上下文中(尤其是在下列權利要求的上下文中)，術語「一個」和「一種」和「該」以及類似指代物要被解釋為涵蓋單數和複數，除非本文另外指示或與上下文明顯牴觸。術語「包含」、「具有」、「包括」和「含有」要被解釋為開放式術語(即，意味著「包括，但不限於」)，除非另有說明。本文中數值範圍的列舉僅僅意在用作簡略表達方法，分別指落入所述範圍內的每個獨立數值，除非本文中另有指示，且每個獨立數值均併入本說明書中，如同它們單獨列舉在本文中一樣。本文描述的方法的所有步驟可以以任何合適的順序執行，除非本文另外指示或清楚地與上下文矛盾。對本文提供的任一和所有實施例，或示例性語言(例如，「諸如」)的使用，僅僅意在更好地說明本發明而不造成對本發明範圍的限制，除非另外聲明要求保護。說明書中的語言不應被解釋為指示任何未要求保護的要素作為實施本發明所必不可少的。

乳酸菌包括如乳球菌屬、腸球菌屬、酒酒球菌屬(oenococcusspp.)、片球菌屬(pediococcusspp.)、糞鏈球菌屬(streptococcusspp.)、明串珠菌屬和乳桿菌屬(lactobacillusspp.)的菌屬。它們可以分成三個亞組：專性異型發酵、兼性異型發酵和同型發酵。乳桿菌屬的乳酸菌可以是兼性異型發酵或同型發酵的，取決於屬菌種(vandamme等人，1996)。

專性異型發酵乳酸菌通過磷酸-葡糖酸途徑將己糖發酵成乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳。專性異型發酵乳酸細菌菌種的實例是明串珠菌屬和乳桿菌屬諸如短乳桿菌、布氏乳桿菌、發酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌。

另外，當葡萄糖有限時，兼性異型發酵乳酸菌可以將戊糖發酵成乳酸、乙酸、甲酸和乙醇。兼性異型發酵乳酸菌的實例是片球菌屬、乾酪乳桿菌(lactobacilluscasei)、彎曲乳桿菌(lactobacilluscurvatus)、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)、清酒乳酸菌(lactobacillussake)。

同型發酵乳酸菌定義為主要是通過embden-meyerhof途徑將己糖降解為乳酸的細菌。同型發酵乳酸菌的實例為乳球菌屬、腸球菌屬和乳桿菌屬諸如嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)、德氏乳桿菌(lactobacillusdelbrueckii)、瑞士乳桿菌(lactobacillushelveticus)、唾液乳桿菌(lactobacillussalivarius)。

市場上的許多產品兼具高產乳酸兼性異型發酵/同型發酵菌株與布氏乳桿菌。然而，本發明人發現，這種組合的細菌沒有實現最佳可能的有氧穩定性(即，不會促進在催肥時維持環境溫度)。儘管不希望受理論的束縛，本發明人相信，這種組合的細菌減少了布氏乳桿菌的生長和/或產生大量乳酸，所述大量乳酸可被需氧腐敗菌株利用，從而在暴露於空氣中時啟動青貯飼料變質。根據一些實施例，本文描述的接種劑通過將專性異型發酵菌種(例如，布氏乳桿菌)與快速降低ph而不產生過量乳酸的細菌菌種(例如，乳球菌屬和腸球菌屬)組合來解決了該問題。這種選擇的同型發酵菌種不抵消專性異型發酵菌種的正效應，或至少僅很少程度地抵消。

因此，在一些實施方案中，本發明提供了青貯接種劑，所述青貯接種劑基本上由至少一種專性異型發酵乳酸細菌菌種和至少一種同型發酵細菌菌種組成，所述至少一種同型發酵細菌菌種優選地不降低專性異型發酵乳酸菌種的生長並且優選地快速降低ph而不產生過量的乳酸。

「基本上由……組成」意指青貯接種劑僅包含特定的細菌作為活性成分並且不包含其他一種或多種活性成分諸如任何其他細菌、酶、有機酸、苯甲酸鈉、硝酸鈉或六亞甲基四胺。如本文所述的基本上由特定的細菌組成的接種劑不包含植物乳桿菌。

術語「至少一種」意指所述接種劑組合物可以包含一種、兩種、三種、四種、五種或甚至更多種不同的專性異型發酵乳酸細菌菌種和一種、兩種、三種、四種、五種或甚至更多種不同的同型發酵細菌菌種。

在具體的實施方案中，同型發酵細菌菌種或菌株不降低專性異型發酵乳酸細菌菌種或菌株的生長。這個特性可以通過使同型發酵菌株和專性異型發酵乳酸菌株在mann-rogosa-sharpe(mrs)培養基中在37℃過夜生長，將待測試的同型發酵細菌菌種或菌株和專性異型發酵乳酸細菌菌種或菌株兩者在相同的mrs瓊脂板上在基本上相同的時間劃線，然後將該瓊脂板在厭氧條件下在37℃孵育過夜來測試。如果專性異型發酵乳酸菌的生長被抑制至少5mm，則測試的同型發酵菌種或菌株不具有此所需的特性。如果青貯接種劑包含多於一種專性異型發酵乳酸細菌菌種或菌株或多於一種同型發酵菌種或菌株，可以測試所有相關的組合。

通過這樣的測試，已經發現同型發酵菌種乳酸乳桿菌的產乳酸鏈球菌肽菌株諸如乳酸乳桿菌ncimb30117和乳酸乳桿菌atcc11454抑制布氏乳桿菌dsm22501，而不產生乳酸鏈球菌肽的乳酸乳球菌dsm11037和屎腸球菌dsm16656不抑制布氏乳桿菌dsm22501。

儘管不希望受理論的束縛，這些結果表明只有乳酸乳桿菌菌種的產乳酸鏈球菌肽同型發酵菌株抑制專性異型發酵菌種或菌株，並且不產生乳酸鏈球菌肽的產細菌素同型發酵菌種或菌株不抑制專性異型發酵菌種或菌株。因此，如果至少一種同型發酵細菌菌種或菌株不產生乳酸鏈球菌肽，則該同型發酵細菌菌種或菌株不降低至少一種專性異型發酵乳酸細菌菌種的生長的要求可以被滿足。因此，在具體實施方案中，同型發酵菌種或菌株為不產生乳酸鏈球菌肽的產細菌素同型發酵菌種或菌株，儘管如上所述的直接篩選可以識別表現出這種性質的其他菌株。在具體的實施方案中，本發明涉及一種青貯接種劑，其基本上由以下各項組成：至少一種專性異型發酵乳酸細菌菌種(或其菌株)和至少一種同型發酵細菌菌種(或其菌株)，所述同型發酵細菌菌種(或其菌株)(i)不產生乳酸鏈球菌肽，以及(ii)快速地降低ph而不產生過量的乳酸。

在具體的實施方案中，同型發酵細菌菌種或菌株快速降低ph值，而不會產生過量的乳酸。如上所述，快速降低ph可通過抑制腐敗微生物諸如梭狀芽孢桿菌(clostridia)、腸桿菌科(enterobacteriaceae)、酵母和黴菌的生長來抑制在青貯飼料生產早期階段中的腐敗。腐敗微生物可導致營養素流失，病原微生物的生長，和異味，所述異味使得青貯飼料對於用其飼養的動物，諸如反芻動物是不可口的。

如本文中所使用，「快速降低ph而不產生過量的乳酸的菌種或菌株」定義為在10ml無菌青貯飼料培養基中含有150,000cfu/ml所述菌株的管的30℃水浴中在接種24小時後產生不超過3mg/ml乳酸的菌種或菌株，所述無菌青貯飼料培養基通過下列步驟製備：將5g/l酵母提取物(oxoidl21)、5g/l大豆中和的蛋白腖(oxoidlp0044c)、0.8g/l可溶性澱粉(merck1252)、0.08g/l二水合硫酸錳(ii)(sigmam-1114)、0.037g/l琥珀酸(assaylab)、0.069g/l檸檬酸一水合物和0.14l-蘋果酸(merck244)在900mlmilliq水中混合直至溶解，調整ph值至6.3，分配給奶瓶並在121℃高壓滅菌15分鐘，然後加入100ml含有下列的無菌過濾的糖溶液：56g/ld(-)果糖(merck4007)、32g/ld(+)葡萄糖一水合物(merck8342)、20g/ld(+)木糖(merck8689)、20g/ll(+)阿拉伯糖(aldricha9,190-6)、和32g/l蔗糖(merck7651)。

根據一個實施方案，所述青貯接種劑包含至少一種專性異型發酵乳酸細菌菌種或菌株，所述至少一種專性異型發酵乳酸細菌菌種是選自由下列各項組成的組的明串珠菌屬菌種或乳桿菌屬菌種：短乳桿菌、布氏乳桿菌、發酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌。在具體實施方案中，所述專性異型發酵乳酸細菌菌種或菌株是布氏乳桿菌。被預期可用於本發明中的布氏乳桿菌的實例是布氏乳桿菌kkp.907、布氏乳桿菌dsm22963、布氏乳桿菌ncimb40788、布氏乳桿菌ncimb30139、布氏乳桿菌dsm16774、布氏乳桿菌dsm22963、布氏乳桿菌dsm12856。在具體實施方案中，布氏乳桿菌是保藏編號為dsm22501的布氏乳桿菌菌株。

在一些實施方案中，所述青貯接種劑包含至少一種快速降低ph而不產生過量乳酸的細菌菌種或菌株，所述細菌菌株是腸球菌屬諸如屎腸球菌。被預期可用於本發明中的腸球菌的實例是屎腸球菌ncimb10415、屎腸球菌cncmi-3236、屎腸球菌bio34和屎腸球菌dsm16573。

在其他實施方案中，所述青貯接種劑包含至少一種快速降低ph而不產生過量乳酸的細菌菌種或菌株，所述細菌菌株是乳球菌屬諸如乳酸乳球菌。在具體實施方案中，所述乳酸乳球菌是保藏編號為dsm11037的菌株。

因此，在一些實施方案中，所述青貯接種劑基本上由布氏乳桿菌菌株和腸球菌屬菌株組成，所述腸球菌屬菌株不降低專性異型發酵乳酸細菌菌種(或菌株)的生長並且快速降低ph而不產生過量乳酸。在其他實施方案中，所述青貯接種劑基本上由布氏乳桿菌菌株和乳球菌屬菌株組成，所述乳球菌屬菌株不降低專性異型發酵乳酸細菌菌種(或菌株)的生長並且快速降低ph而不產生過量乳酸。

本發明還提供了用於生產發酵飼料產品，諸如青貯飼料的方法，所述方法包括用如本文所述的細菌青貯接種劑接種植物材料。已經令人驚奇地發現本文所述的青貯接種劑能夠提供非常快速的效果。即，用如所述的細菌青貯接種劑接種的材料可適合於在短孵育期後使用，諸如僅2、3、4、5、6、7或8天的孵育期。因此，在一些實施方案中，所述方法包括在將青貯飼料暴露於空氣之前(諸如通過打開青貯倉)，將植物材料與如本文所述的青貯接種劑孵育多達2天、或多達4天的時期。然而，植物材料還可以孵育更長時期，諸如多達7天、多達8天、多達14天或多達28天或甚至更長，諸如至少60天或至少90天的時期，後者是用於測試青貯接種劑效果的常規時期。

如上所述，在具體實施方案中，本文所述的細菌青貯接種劑可以在青貯過程的開始時實現快速的ph降低，同時維持在催肥時的高有氧穩定性。即，本文所述的細菌青貯菌劑可以表現出快速的初始發酵，所述快速的初始發酵減少乾物質(dm)損失和發酵的早期階段中的腐敗，且還可以獲得與利用專性異型發酵菌株諸如單獨布氏乳桿菌接種相同或相當的有氧穩定性。因此，本文所述的接種劑與僅含有同型發酵或/和兼性異型發酵菌株的產品相比實現更好的有氧穩定性，儘管它們的有氧穩定性可能不如單獨利用專性異型發酵布氏乳桿菌所實現的有氧穩定性那樣好。

保藏的菌株

一個植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)菌株已經由丹麥的chr.hansena/s保藏在dsmz(德國微生物菌種保藏中心,inhoffenstrasse7b,d-38124布倫瑞克)，保藏編號為dsm16568，保藏日為2004年7月13日。該保藏是在國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的條件做出的。

一個布氏乳桿菌菌株已經由丹麥的chr.hansena/s保藏在dsmz(德國微生物菌種保藏中心,inhoffenstrasse7b,d-38124布倫瑞克)，保藏編號為dsm22501，保藏日為2009年4月22日。該保藏是在國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的條件做出的。

一個屎腸球菌菌株已經由丹麥的chr.hansena/s保藏在dsmz(德國微生物菌種保藏中心,inhoffenstrasse7b,d-38124布倫瑞克)，保藏編號為dsm22502，保藏日為2009年4月22日。該保藏是在國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的條件做出的。

對於上面標識的經保藏的微生物，適用下列附加的指示：關於各個指定國家的各個專利局，本申請人請求上面提到的保藏的微生物的樣品僅可由請求人提名的專家獲得直到本專利授權日或本申請已經被駁回或撤回或視為撤回之日為止。

乳酸乳桿菌菌株dsm11037已經在1996年6月26日由丹麥的chr.hansena/s保藏在dsmz(德國微生物菌種保藏中心,inhoffenstrasse7b,d-38124布倫瑞克)，並在已授權專利ep928333中提到。

下面藉助於非限制性實施例描述本發明的實施方案。

附圖圖例

圖1a

用組合物1(δ)、組合物2(□)、組合物3(о)、組合物4和組合物5(x)接種的無菌青貯飼料培養基48h時間內的ph下降。起始接種為150,000cfu/ml，溫度保持在30℃,n＝1。

圖1b

用組合物1(δ)、組合物2(□)、組合物3(о)、組合物4和組合物5(x)接種的無菌青貯飼料培養基48h時間內按mg/ml計的乳酸濃度。起始接種為150,000cfu/ml，溫度保持在30℃,n＝1。

圖1c

用組合物1(δ)、組合物2(□)、組合物3(о)、組合物4和組合物5(x)接種的無菌青貯飼料培養基48h時間內按mg/ml計的乙酸濃度。起始接種為150,000cfu/ml，溫度保持在30℃。

圖2

用組合物2(□)、組合物4和組合物6接種的無菌青貯飼料培養基72h時間內的ph下降。起始接種為150,000cfu/ml，溫度保持在30℃。

圖3

在丹麥2011年收穫的未接種(白色條)、用組合物4接種的(灰色條)或用組合物7接種的(黑色條)的玉米(小青貯窖1)的乙酸/乳酸比例。小青貯窖真空袋在25℃貯存直至7、28、61和88天後開放。

圖4

在丹麥2012年收穫的未接種用組合物4接種的或用組合物5接種的(x)的玉米(小青貯窖2)的有氧穩定性。在x軸上是時間(h)，在y軸上是溫度(℃)。虛線黑線顯示了環境溫度，虛線灰線是環境溫度+3℃。

圖5

具有2012年收穫的玉米青貯飼料(小青貯倉2)的小青貯倉在7天的有氧刺激後的ph，包括4次觀察結果的sem。沒有接種(白色條)、用組合物4接種(灰色條)或組合物5(點狀條)。

圖6

在丹麥2013年收穫的未接種用組合物2接種的(□)或用組合物4接種的的玉米(小青貯窖3)的有氧穩定性。在x軸上是時間(h)，在y軸上是溫度(℃)。虛線黑線顯示了環境溫度，虛線灰線是環境溫度+3℃。

圖7

在丹麥2013年收穫的未接種用組合物2接種的(□)、用組合物4接種的或用組合物7接種的(▲)的玉米飼草(小青貯窖4)的有氧穩定性。在x軸上是時間(h)，在y軸上是溫度(℃)。虛線黑線顯示了環境溫度，虛線灰線是環境溫度+3℃。

圖8

2013年收穫的未接種用組合物2接種的(□)、用組合物4接種的、用組合物7接種的(▲)的紅三葉草:梯牧草:羊茅飼草(小青貯窖5)的有氧穩定性。在x軸上是時間(h)，在y軸上是溫度(℃)。虛線黑線顯示了環境溫度，虛線灰線是環境溫度+3℃。

圖9a

發酵7天和14天接著7天有氧刺激(分別為7+7和14+7)後未接種的(白色)、用組合物4接種(灰色)或用組合物7接種(黑色)的玉米青貯飼料(小青貯窖6a)中的有氧穩定性(小時)。

圖9b

發酵2、4和8天接著7天有氧刺激(分別為2+7、4+7和8+7)後未接種的(白色)或用組合物4接種(灰色)的玉米青貯飼料(小青貯窖6b)中的有氧穩定性(小時)。

圖10

發酵2、7和14天後未接種的(白色)、用組合物4接種(灰色)或用組合物7接種(黑色)的玉米青貯飼料(小青貯窖6a)中的酵母數目(cfu/g)。

圖11

發酵2、7和14天後未接種的(白色)、用組合物4接種(灰色)或用組合物7接種(黑色)的玉米青貯飼料(小青貯窖6a)中的ph發展。

圖12

在2014年收穫的未接種(灰色正方形)或用組合物4接種的(黑色圓圈)的玉米在162小時(小青貯窖7a)內的累積氣體產量。在x軸上是時間(h)，在y軸上是按ml/g新鮮飼草計的體積。

圖13

對照和用組合物4接種的玉米(小青貯窖7b)之間氣體產量的差異。在x軸上是時間(h)，在y軸上是按ml/g新鮮飼草計的體積。

圖14

在162小時(小青貯窖7b)後的2014年收穫的未接種的(白色)或用於組合物4接種(灰色)或用組合物7接種(黑色)的真空包裝玉米的重量減輕百分比。

圖15

2014年收穫的真空包裝玉米在發酵6天後氣體發展的差異。沒有接種(照片左手側)或用組合物4(150,000cfu/g玉米，照片的右手側)接種的飼草的真空包裝袋。

具體實施方式

實施例

實施例1–無菌體外分批培養

在兩個單獨的試驗裝置中使用用來模擬草的碳水化合物組成的含有不同的碳水化合物源的無菌青貯飼料培養基來測試同型發酵菌和異型發酵乳酸菌的單一菌株和組合產品。測量隨時間變化的ph和有機酸含量。所述培養基含有5g/l酵母提取物(oxoidl21)、5g/l大豆中和的蛋白腖(oxoidlp0044c)、0.8g/l可溶性澱粉(merck1252)、0.08g/l二水合硫酸錳(ii)(sigmam-1114)、0.037g/l琥珀酸(assaylab)、0.069g/l檸檬酸一水合物和0.14l-蘋果酸(merck244)，將它們混合在900mlmilliq水中直至溶解。將ph調整至6.3並分配至奶瓶中並在121℃高壓滅菌15分鐘。高壓滅菌後，加入含有56g/ld(-)果糖(merck4007)、32g/ld(+)葡萄糖一水合物(merck8342)、20g/ld(+)木糖(merck8689)、20g/ll(+)阿拉伯糖(aldricha9,190-6)和32g/l蔗糖(merck7651)的100ml無菌過濾的糖溶液以獲得最終的青貯飼料培養基。在試驗1和2中，均使用無菌青貯飼料培養基並用表1中概述的各種不同的接種劑組合物接種。

表1

在兩個體外分批培養研究中使用的菌株組合物

試驗1

將10ml接種了表1中的各種接種劑組合物的青貯飼料培養基分配到11個無菌試管中的每個中並保持在30℃水浴中。在0、2、4、6、7、8、9、11、14、24和48小時後，取出樣品進行揮發性有機酸(vfa)和乳酸分析和ph監測。使用手持ph計監測ph，而揮發性有機酸在hplc(dionex)上進行分析。

試驗2

就青貯飼料培養基、接種水平和溫度而言試驗2類似於試驗1。組合物2、4和6用作接種劑。使用自動ph-計，72h後在hplc(dionex)上測量乙酸、乳酸和甲酸。

結果

試驗1和2的結果顯示了各種接種劑組合物對ph的作用，並且在圖1a、b、c和圖2以及表2中提供了有機酸含量。

圖1a示出了來自試驗1的ph隨時間的變化。組合物2非常緩慢地降低ph。組合物1和組合物3降低ph更快並且在14小時之後ph低於5.0，而組合物2仍然具有高於6.0的ph。組合物4與組合物3一樣快地降低ph。組合物5產生的ph曲線非常類似於組合物1。

圖1b示出來自試驗1的乳酸濃度隨時間的變化。24小時後，組合物1產生比組合物2、組合物3或組合物4多得多的乳酸。48小時後，組合物1的乳酸濃度大於8mg/ml，相比組合物2、組合物3或組合物4為4mg/ml或更低。組合物5產生的乳酸濃度非常類似於組合物1。

圖1c示出來自試驗1的乙酸濃度隨時間的變化。48小時後，組合物2的乙酸濃度超過2mg/ml，組合物1和組合物3產生小於0.5mg/ml的乙酸。48小時後，組合物4產生1mg/ml的乙酸，而組合物5產生小於0.5mg/ml的濃度。

圖2示出來自試驗2的ph隨時間的改變。再次組合物2非常慢地降低ph。組合物4降低ph則快得多，並且在15小時後ph低於4.5，而組合物6仍然具有6.0以上的ph。組合物6與組合物4相比產生稍慢的ph下降。然而，ph繼續快速地降低並且在18小時後ph已經低於4.0。在72小時後，組合物2和組合物4的ph分別達到3.6和3.7，而組合物6則低至3.2。

表2

72小時後接種的無菌青貯飼料培養基的有機酸產量(試驗2)

表2示出利用組合物6(其含有布氏乳桿菌dsm22501和植物乳桿菌dsm16568)強烈地減少乙酸產量，與組合物4(其含有布氏乳桿菌dsm22501和乳酸乳球菌dsm11037)形成對照。組合物6還示出72小時後的高乳酸濃度。與組合物6相比，組合物4不僅具有高得多的乙酸濃度，還具有高濃度的甲酸。

實施例2–小青貯窖中的有氧穩定性

小青貯窖1、2和3–丹麥2011、2012和2013年收穫的玉米

建立5個不同的小青貯窖試驗以測試各種不同的青貯接種劑組合物。在丹麥用在2011年(小青貯窖1)、2012(小青貯窖2)和2013(小青貯窖3)從三個不同的農場收穫的玉米建立三個試驗，並在立陶宛在2013年使用玉米和紅三葉草:梯牧草:羊茅草皮(60:30:10)(小青貯窖4和5)進行兩個試驗。使用的接種劑和應用比率的概述列在表3中。

表3

在小青貯窖研究中使用的菌株組合物

對於小青貯窖1，玉米在日德蘭半島西南收穫。到實驗室的運輸時間為4小時。之後，將玉米在戶外儲存過夜，然後在-20℃冷凍。在接種的時間，將玉米解凍1-2小時，然後保持在4-5℃的冰箱中。將接種劑懸浮在自來水中，並填充到噴霧瓶中。用於每次處理的目標劑量為150,000cfu/g玉米，並基於組合物的實際效力計算到達目標接種劑量所需的量。將1000g玉米一次一點地稱入塑膠袋使得接種劑可以均勻地噴灑到玉米上。然後將袋振蕩以確保接種劑在袋中的均勻分布。然後對每個時間點(7、28、61和88天)，將1000g接種的玉米分配給五個alubag，每個alubag200g。真空包裝的alubag儲存在25℃。

每次處理在不同的時間點打開五個alubag。然後測定樣品的小有機酸。

對於小青貯窖2，從丹麥西蘭中部的農場收集剛收穫的玉米，並直接運輸到實驗室。在小青貯窖設置中測試表3中列舉的5種不同的處理以及對照組。將接種劑懸浮在自來水中，並填充到噴霧瓶中。用於每次處理的目標劑量為150,000cfu/g玉米，並基於產品的實際效力計算到達目標接種劑所需的量。將1000克玉米一次一點地稱入袋使得接種劑可以均勻地噴灑到玉米上。在將袋振蕩以確保接種劑在袋中的進一步分布後，將所述袋真空包裝。準備每次處理的4個袋，並在25℃保存用於三個月後的進一步分析。3個月後，使用已經保存在真空袋中的青貯飼料建立有氧穩定性研究。將青貯飼料分配在其中溫度傳感器位於中間的容器(頂部開口且在底部有孔的塑料瓶)中，所述容器置於聚苯乙烯凹穴中，用大的塑料板遮蓋，並且在室溫保存。監測7天的時期內暴露於空氣後每個單個樣品的溫度。

對於小青貯窖3，從西蘭東北部的農場收集剛收穫的玉米。程序與對小青貯窖2所述的相同，不同之處是在僅2周後進行有氧穩定性研究。

小青貯窖1、2和3的結果

在不同時間點小青貯窖1的青貯飼料中乙酸與乳酸的比率顯示在圖3中。與組合物7相比在7天後和28天後未接種的對照中乙酸與乳酸的比例較高。然而，在88天後，與對照相比，組合物7具有高的乙酸與乳酸比率。從第7天開始組合物4具有高的乙酸與乳酸比率，該比率隨著時間增加。所有樣品的平均ph在所有時間點均低於4.0。

小青貯窖2的結果顯示在圖4中。可以看出在78小時後，未接種的對照青貯飼料的溫度高於環境溫度超過3℃，而組合物5在96小時後升溫高於環境溫度3℃。在測量的所有162小時期間，組合物4均保持玉米青貯飼料穩定。如圖5中所示，在162小時後，對照的ph平均為6.74,而用組合物5處理的青貯飼料的平均ph為5.67，且組合物4的平均ph為4.05。

對於小青貯窖3，在儲存後打開的真空包裝的未接種的青貯飼料在93小時後不穩定，而用組合物2接種的青貯飼料穩定持續整個160小時，且用組合物4接種的青貯飼料穩定持續129小時(圖6)。

小青貯窖4和5–玉米和草/三葉草收穫物2013，立陶宛

對於小青貯窖4，玉米(zeamaysl.)在穀物成熟的蠟熟期收穫。玉米的乾物質(dm)濃度為38.85％，水溶性碳水化合物濃度為2.54％。在農場條件下通過飼料收割機將玉米切碎成長度為約2cm的片。

對於小青貯窖5，收穫含有60％紅三葉草、30％梯牧草和10％羊茅草皮的草三葉草混合物並將其乾燥為32.8％的乾物質。此飼草混合物被稱作草/三葉草混合物。水溶性碳水化合物含量為20.3g/kgdm(2.03％新鮮飼草)。在農場條件下通過飼料收割機將草/三葉草混合物切碎成長度為2-3cm的片。

對於小青貯窖4和小青貯窖5兩者，取5個代表性樣品(每個>500g)用於兩種飼草的營養價值分析和處理。將飼草在聚乙烯袋中運輸至實驗室。在從作物準備起0.5h內開始實驗室實驗。取枯萎和切碎的牧草的500g代表性樣品進行營養價值、緩衝容量、硝酸鹽和微生物組成分析。在玉米和草/三葉草飼草試驗中使用相同的青貯接種劑和程序。

青貯接種劑在其應用之前即刻懸浮在蒸餾水中，目標是達到如表3中所述的劑量。對於每個處理一式五份地進行。根據表3中所述的劑量和產品的實際細菌濃度計算產品的應用率。當稀釋產品時使用不含氯的水。使用相同體積的蒸餾水替代對照處理中的懸浮液(用於自然發酵)。在接種後，用1.80-1.84kg新鮮的作物將3升玻璃廣口瓶相等地填充至每5升體積1kgdm。填充後15分鐘將廣口瓶用蓋子封閉。在實驗期間在發酵過程中產生的氣體用排氣孔釋放。在玻璃廣口瓶中在20℃的恆定溫度儲存90天後，進行化學物質和微生物分析。

為了測量青貯飼料的有氧穩定性，監測青貯飼料內部的溫度持續10天。為此，將熱電偶線插入到青貯飼料樣品的中點，所述青貯飼料樣品放置在開放的聚苯乙烯盒中。盒的頂部和底部包含2cm直徑的孔以允許空氣進入和co2離開。換能器通過盒的蓋子中的孔放置在青貯飼料塊的中央，所述孔將青貯飼料暴露於空氣。在記錄溫度的時期期間不幹擾這些青貯飼料。將盒保持在恆定的室溫(≈20℃)。通過數據記錄器每6h記錄環境溫度和每種青貯飼料的溫度。通過使用空對照盒測量環境室溫。通過計算青貯飼料溫度和環境室溫之間的差來檢驗青貯飼料的有氧穩定性。通過到溫度持續增加開始超過環境溫度3℃以上的天數(或小時數)來標註有氧變質。

表4

分析方法

*在噴霧後立即和在填充青貯窖時收集5個用於分析的牧草樣品。

**在儲存90天後對每個變化形式(包括對照)中來自每個青貯窖的青貯飼料進行取樣。

***如果新鮮牧草中多於1500cfu/g梭狀芽胞桿菌，則對青貯飼料進行梭狀芽胞桿菌的分析。

vfa和乳酸和低級醇濃度通過對水性青貯飼料提取物的氣液色譜法來測定，所述水性青貯飼料提取物由在密封容器中在150ml去離子水中在40℃浸漬30g新鮮青貯飼料持續16小時，接著通過3μm濾紙初步過濾獲得。將內標溶液(在1000ml0.15moll-1草酸中的0.5g3-甲基-n-戊酸)的去離子水(3ml)加入至1ml來自上面的濾液，並且所述溶液通過0.45μm聚醚碸膜過濾至色譜樣品瓶用於分析。根據氣相色譜和生化分析儀官方方法，氣-液色譜gc-2010shimadzu使用大口徑毛細管柱(30m,0.53mm,id,0.5μm)。通過蒸餾–aoac941.04測定氨-氮(nh3n)。

小青貯窖4和5的結果

來自玉米小青貯窖4的結果顯示在表5中。所有三種接種的玉米青貯飼料在3天的厭氧發酵後與對照相比具有顯著(p>0.05)較低的ph。組合物4和組合物7與組合物2和對照相比具有顯著較少的dm損失(％/kg)，顯著(p<0.05)較少的n-nh3級分(％/kg總n)和顯著(p<0.05)較高的乳酸濃度(％/kgdm)。與組合物7和對照相比，用組合物2和組合物4接種玉米導致顯著(p<0.05)較高的乙酸(％/kgdm)和丙酸(％/kgdm)濃度。所有接種的玉米青貯飼料與對照相比具有較小的酵母和黴菌計數(logcfu/g)。

如圖7中所見，10天的有氧暴露導致未接種的對照青貯飼料在66小時後溫度升高高於環境溫度大於3℃，而組合物7在178小時後升溫至高於環境溫度大於3℃，與對照相比這是顯著(p<0.05)較長的時間以及與組合物2和4相比是顯著(p<0.05)較短的時間。在有氧暴露240小時後，對照的ph高至8.29，而組合物7的ph為5.66，與對照相比這是顯著(p<0.05)較低的。

表5

各種組合物對發酵變量和青貯的玉米的微生物組成的作用

行中的不同字母顯示統計學顯著差異(p0.05)較低的ph。組合物4和組合物7具有顯著(p<0.05)較少的dm損失(％/kg)。儘管所有接種的草/三葉草青貯飼料與對照相比具有顯著(p<0.05)較少的n-nh3級分(％/kg總n)，且與對照相比顯著(p<0.05)較高的乳酸濃度(％/kgdm)，與組合物7和對照相比，用組合物4接種玉米產生顯著(p<0.05)較高的乙酸(％/kgdm)。所有接種的草/三葉草青貯飼料與對照相比具有較低的酵母和黴菌計數(logcfu/g)。

如圖8中所見，10天的有氧暴露導致未接種的對照青貯飼料在91小時後的溫度升高高於環境溫度大於3℃，而組合物7在169小時後升溫至高於環境溫度大於3℃。組合物4在191小時後溫度升高大於3℃，組合物2在214小時後達到相同的增加。在有氧暴露240小時後，對照的ph高至7.93，而組合物7的ph為5.41，組合物4的ph為5.35，組合物2的ph為最低，為4.93。

表6

各種組合物對發酵變量和青貯的紅三葉草:梯牧草:羊茅的微生物組成的作用

行中的不同字母顯示統計學顯著差異(p<0.05)

在開放後青貯窖中不存在流出物

對揮發性物質校正的乾物質

小青貯窖6a-玉米收穫物2014，美國

對於小青貯窖6a，在美國德拉瓦州收穫玉米，處於大致35％全株dm含量。組合物4和7溶解在去離子水中並每次處理施用於5個20kg堆的新鮮切碎的玉米飼草以獲得準確重複。來自每堆的飼草青貯在7.6l桶式青貯窖中並用帶有o形圈密封的塑料蓋子密封。

對每個發酵間隔(2天、7天和14天)每次處理準備總計5個處於第0天的樣品(新鮮材料)和5個桶。桶裝填有大約6kg新鮮飼草以達到0.208-0.266kgdm/l的最終堆積密度。將筒在(22±1℃)保存並在2天、7天和14天青貯後打開。

對於有氧穩定性的測定，2kg來自每個青貯窖的代表性樣品進入清潔的筒(沒有填料)中並將數據記錄器放置在飼草塊的幾何中心。所述記錄器被設定成每10分鐘記錄溫度並按小時平均。用粗棉布覆蓋在桶的頂部上方以防止過度乾燥並且允許在房間內在22±1℃孵育。測量並同時記錄房間中的環境溫度。有氧穩定性定義為在青貯飼料塊在暴露於空氣後在穩定基線上增加3℃之前的時間長度。

小青貯窖6a的結果

小青貯窖6a的結果顯示在圖10和11以及表7a中。

表7a

各種組合物對各個發酵期後打開時的ph和酵母計數的作用以及對7天有氧刺激期內的有氧穩定性的作用

小青貯窖6b-玉米收穫物2014,立陶宛

對於小青貯窖6b，在立陶宛收穫玉米，處於大致35％全株dm含量。組合物4溶解在去離子水中並以150,000cfu/g飼草施用於一堆新鮮切碎的玉米飼草以獲得準確重複。來自此堆的飼草以及一堆未處理的對照青貯在3l帶有o形圈的玻璃廣口瓶中。

對每個發酵間隔(2天、4天和8天)每次處理準備總計5個處於第0天的樣品(新鮮材料)和5個玻璃廣口瓶。廣口瓶裝填有大約1kg新鮮飼草以達到0.208-0.266kgdm/l的最終堆積密度。將玻璃廣口瓶在(20±1℃)保存並在2天、4天和8天厭氧發酵後打開。

有氧穩定性

通過監測在隔熱的pvc管(1300ml)中在20±1℃環境溫度(實驗期間記錄的室溫)保存的青貯飼料中的溫度增加來測定有氧穩定性。(圖9a)

有氧變質表示為青貯飼料溫度達到環境溫度之上3℃的小時數(表7b和圖9b)。

小青貯窖6b的結果

表7b

組合物4對有氧穩定性的作用

增加厭氧發酵的時間增加了對照青貯飼料和用組合物4接種的玉米青貯飼料兩者的穩定性。然而，值得注意的是在僅厭氧發酵2天後，用組合物4接種能夠保持玉米青貯飼料穩定比對照多18小時，並且當在有氧刺激之前發酵4天或8天時對照和組合物4之間的差異仍然是相當大的(分別為10和29個小時)。

小青貯窖7a、7b和7c–玉米收穫物2014,丹麥

對於小青貯窖7a，從丹麥西蘭北部農場收集新鮮收穫的玉米(28.6％dm)，並直接運輸至實驗室。玉米用來測試組合物4相對對照的作用，使用1.8-l帶有自動排氣口的玻璃廣口瓶(www.ankom.com)。玻璃廣口瓶填充了平均746g剛收穫的玉米，所述玉米接種以150,000cfu/g組合物4(n＝5)或接種以相同量的自來水(n＝5)作為對照。將廣口瓶保持在大約21℃的室溫。以10分鐘的間隔自動測量氣體產量並當達到1.5psi時還自動地釋放氣體。將累積的氣體轉換成ml/g新鮮飼草(體積＝p(以psi計的壓力)×c(廣口瓶的體積)/從0至162小時記錄的平均大氣壓×飼料的全部樣品(鮮重))。測量氣體產量持續162小時(圖12)，對照和用組合物4處理的玉米之間的差異顯示在圖13中。

對於小青貯窖7b，在同一天使用1kg與小青貯窖7a中相同的玉米並通過移除90％空氣並密封來進行真空包裝。利用未接種(白色條)、組合物4(150,000cfu/g玉米，灰色條)或組合物7(150,000cfu/g玉米，點狀條)使用每次處理5個袋。162小時後，打開袋子，釋放氣體並測量重量減輕(圖14)。

對於小青貯窖c，使用在冰箱中在-18℃保存後的與小青貯窖7a中相同的玉米。之後，將飼草復溫，通過移除90％空氣並密封來對1kg樣品進行真空包裝。將不含接種劑或含有組合物4(150,000cfu/g玉米)的飼草的真空包裝袋置於戶外環境溫度下以模擬「真實戶外條件」並確認發酵6天後的氣體產生(圖15)。

小青貯窖7a、7b和7c的結果

青貯飼料中非常早期(前48小時)的氣體產生與來自腸桿菌科(例如，大腸桿菌、沙門氏菌、克雷白氏桿菌屬等)的附生植物需氧微生物相關。氣體產生與青貯飼料的營養素損失有關。與未接種玉米相比，用組合物4接種玉米導致較少的氣體產生(圖12)。氣體產生的差異從10小時增加至116小時，其峰值為0.17ml氣體/g玉米的差異(圖13)。

在真空包裝的玉米中，營養素損失可以通過對袋子稱重來評估。與對照相比，且還與組合物7相比，組合物4的重量減輕較少(圖14)。

在理想條件下，許多農民有這樣的經歷，即他們的青貯倉往往在密封后「膨脹」。如圖15中所示，在未接種(左側)和用組合物4接種(右側)之間氣體產生的差異可以容易地用肉眼檢測到。

討論

由布氏乳桿菌產生的乙酸已知是對抗催肥時需氧腐敗菌株生長的重要酸，在催肥時青貯飼料暴露於氧。然而，布氏乳桿菌的生長具有很長的滯後時間，並且使用布氏乳桿菌導致的ph降低非常緩慢。為了解決此問題，已經將布氏乳桿菌與高產乳酸的細菌菌種,諸如植物乳桿菌組合。然而，高產乳酸菌株的組合可能抵消布氏乳桿菌對有氧穩定性的效率。這個現象顯示在小青貯窖2中，其中與組合物4相比，含有70％布氏乳桿菌dsm22501和10％植物乳桿菌dsm16568、20％乳酸乳球菌dsm11037的組合物5導致很不穩定的青貯飼料，所述組合物4僅包含低產乳酸菌株(50％乳酸乳球菌dsm11037)與布氏乳桿菌dsm22501(50％)的組合。(圖4)

和與高產乳酸菌種的其他組合相比，組合物4實現了快速的且高的終末ph水平。儘管不希望受任何理論約束，但據信在組合物4中，布氏乳桿菌dsm22501仍然能夠繼續生長和/或是有代謝活性的，如高乙酸水平所指示(圖1c)。組合物4的高乙酸/乳酸產量還見於小青貯窖1(圖3)中。另外，在厭氧發酵的早期階段時的高乙酸/乳酸比率顯然對小青貯窖3中的有氧穩定性具有積極作用，所述小青貯窖3僅在短時期(2周)的厭氧發酵後開放。

這些結果還顯示組合物4的dm損失(重要的飼草質量參數)與含有高產乳酸菌株的產品(參見小青貯窖4和小青貯窖5)一樣低，而組合物4還實現了高乙酸產量。高乙酸水平產生非常穩定的青貯飼料(圖4、5、6和7)，在利用小青貯窖的所有三種情況下(實施例2)其優於含有布氏乳桿菌dsm22501的其他組合物(組合物5和7)，所述其他組合物包含植物乳桿菌dsm16568、高產乳酸菌株。

如圖9a中所示，與未處理的對照相比，在7天或14天的短髮酵期後，組合物4增加有氧穩定性。另外，且非常令人驚訝地是，組合物4還證明在兩個時間點有氧穩定性均好於陽性對照(組合物7)。

如圖9b中所示，與未處理的對照相比，在8天的發酵接著7天的有氧刺激後，組合物4增加有氧穩定性。另外，且非常令人驚訝地，與未處理的對照相比，甚至在僅2天或4天的非常短的發酵期後，組合物4仍增加有氧穩定性。

如圖10中所示，觀察到隨著發酵時間增加酵母計數減少的公認模式。然而，令人驚訝的是，在2天和14天發酵兩者後，使用組合物4與陰性對照和陽性對照(組合物7)兩者相比酵母計數減少更多。

令人驚訝地，如圖11中所示，當使用組合物4時ph水平降低至與陽性對照(組合物7)相同的水平，儘管組合物4中缺少植物乳桿菌。

所以這些實驗表明基本上由兼性異型發酵布氏乳桿菌和僅同型發酵菌株組成的青貯接種劑實現了良好的飼草質量，並具有改善的有氧穩定性，甚至對於在僅短期的厭氧發酵後開放的青貯飼料也是如此。

參考文獻

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