一種研究真菌孢子萌發的方法與流程
2023-05-05 06:26:21 2
本發明涉及研究真菌孢子領域，具體為一種研究真菌孢子萌發的方法。
背景技術：
真菌大致分為植物病原真菌、動物致病真菌、環境汙染真菌和食品汙染真菌等幾類。對於動物致病真菌，該種真菌在動物體內或體表滋生，在體外難以培養，因此對其拮抗菌的研究較少；而對於植物病原真菌、環境汙染真菌和食品汙染真菌，其生活環境相對開放，孢子可大量釋放於環境中，該類孢子便於收集，有時會研究其孢子萌發條件的優化、孢子萌發抑制劑或促進劑的篩選、通過研究孢子萌發從而研究細菌拮抗菌的篩選，因此研究真菌孢子的萌發方法是很有必要的。
現在已建立的真菌孢子萌發研究方法，主要有懸滴法、瓊脂法及培養皿法等。懸滴法和瓊脂法應用最廣，兩種方法操作時，由於培養液或培養基質體積有限，若加入孢子量太大，則影響孢子的萌發情況，所以操作時只能加入少量的孢子，根據統計學原理，基數越小，得到的數據準確率越低，因此該方法計算孢子萌發率時誤差較大，不能為研究工作提供準備的數據；培養皿法加入的孢子量較大，但在培養過程中，易造成液體的蒸發，需要不斷進行保溼處理，費時費力且孢子在培養皿中易聚成團或隨液體流動，觀察效果不佳，同樣不能得到準確的研究數據。
技術實現要素：
本發明針對以上不足之處，提供一種研究真菌孢子萌發的方法，該方法一次性處理的孢子數量大，為觀察與統計工作提供了較大基數，同時通過該研究方法孢子不易聚集成團或隨液體流動，觀察效果好，取得的研究數據準確，適用於孢子萌發條件的優化、孢子萌發抑制劑或促進劑的篩選和研究孢子萌發從而研究細菌拮抗菌的篩選等孢子研究工作。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：本發明包括以下步驟：
一、收集目標真菌的孢子；
二、配置2-5％的葡萄糖無菌水溶液，混勻並製成孢子萌發液；
三、取孢子萌發液0.5ml，置於1.5ml離心管中，將待測定萌發的孢子加入孢子萌發液中；
四、將離心管蓋好蓋子，置於溫度為27-30℃的搖床中，以75-150rpm的轉速培養12h；
五、從搖床中取下離心管，以槍頭吹吸培養液，使孢子均勻懸浮於液體中，吸出適量滴在乾淨載玻片上，加蓋蓋玻片，在顯微鏡下觀察孢子的萌發情況，並計算萌發率；
六、將步驟五中離心管內含孢子培養液繼續放入搖床中並重複步驟四的工作，之後再通過步驟五計算孢子萌發率。
本發明設計了，所述步驟四中的培養時間可以為6h、12h或24h。
本發明設計了，往步驟四中搖好的含孢子培養液中加入酸或鹼，從而研究不同PH對孢子萌發的影響。
本發明設計了，往步驟四中搖好的含孢子培養液中加入孢子萌發抑制劑或促進劑，觀察其對孢子萌發的影響。
本發明設計了，往步驟四中搖好的含孢子培養液中加入拮抗細菌，觀察細菌對孢子萌發的影響。
具體實施方式
禾穀鐮刀菌Fusarium graminearum是一種植物的根部致病菌，可引起穗腐、莖腐、莖基腐和根腐病等病害，是一種重要的植物病原真菌；以下3個實施例均以禾穀鐮刀菌孢子為研究對象，比較懸滴法、瓊脂法、培養皿法和本發明的方法對孢子萌發的影響。
實施例1：
相對於本發明本實施例包括以下步驟：
一、收集目標真菌的孢子；
二、配置2％的葡萄糖無菌水溶液，混勻並製成孢子萌發液；
三、取孢子萌發液0.5ml，置於1.5ml離心管中，將待測定萌發的孢子加入孢子萌發液中；
四、將離心管蓋好蓋子，置於溫度為27℃的搖床中，以75rpm的轉速培養12h；
五、從搖床中取下離心管，以槍頭吹吸培養液，使孢子均勻懸浮於液體中，吸出適量滴在乾淨載玻片上，加蓋蓋玻片。
懸滴法、瓊脂法、培養皿法同樣是採用上述步驟二中的孢子萌發液，計算上述四種方法的孢子萌發率時，都是在顯微鏡下隨機選取3個視野進行計算，然後計算三次萌發率的平均值，最後結果如下：懸滴法的孢子萌發率84％、瓊脂法的孢子萌發率85％、培養皿法的孢子萌發率83％、本發明的孢子萌發率86％。
上述四種方法隨機選取的3個視野中孢子的平均數為：懸滴法的孢子個數為42個、瓊脂法的孢子個數為39個、培養皿法的孢子個數為56個、本發明的孢子個數為65個。
實施例2：
相對於本發明本實施例包括以下步驟：
一、收集目標真菌的孢子；
二、配置3％的葡萄糖無菌水溶液，混勻並製成孢子萌發液；
三、取孢子萌發液0.5ml，置於1.5ml離心管中，將待測定萌發的孢子加入孢子萌發液中；
四、將離心管蓋好蓋子，置於溫度為28℃的搖床中，以100rpm的轉速培養6h；
五、從搖床中取下離心管，以槍頭吹吸培養液，使孢子均勻懸浮於液體中，吸出適量滴在乾淨載玻片上，加蓋蓋玻片。
懸滴法、瓊脂法、培養皿法同樣是採用上述步驟二中的孢子萌發液，計算上述四種方法的孢子萌發率時，都是在顯微鏡下隨機選取3個視野進行計算，然後計算三次萌發率的平均值，最後結果如下：懸滴法的孢子萌發率65％、瓊脂法的孢子萌發率63％、培養皿法的孢子萌發率64％、本發明的孢子萌發率65％。
上述四種方法隨機選取的3個視野中孢子的平均數為：懸滴法的孢子個數為40個、瓊脂法的孢子個數為36個、培養皿法的孢子個數為50個、本發明的孢子個數為60個。
實施例3：
相對於本發明本實施例包括以下步驟：
一、收集目標真菌的孢子；
二、配置5％的葡萄糖無菌水溶液，混勻並製成孢子萌發液；
三、取孢子萌發液0.5ml，置於1.5ml離心管中，將待測定萌發的孢子加入孢子萌發液中；
四、將離心管蓋好蓋子，置於溫度為30℃的搖床中，以150rpm的轉速培養24h；
五、從搖床中取下離心管，以槍頭吹吸培養液，使孢子均勻懸浮於液體中，吸出適量滴在乾淨載玻片上，加蓋蓋玻片。
懸滴法、瓊脂法、培養皿法同樣是採用上述步驟二中的孢子萌發液，計算上述四種方法的孢子萌發率時，都是在顯微鏡下隨機選取3個視野進行計算，然後計算三次萌發率的平均值，最後結果如下：懸滴法的孢子萌發率93％、瓊脂法的孢子萌發率95％、培養皿法的孢子萌發率93％、本發明的孢子萌發率95％，從結果來看四種方法的萌發率比較接近。
上述四種方法隨機選取的3個視野中孢子的平均數為：懸滴法的孢子個數為60個、瓊脂法的孢子個數為66個、培養皿法的孢子個數為70個、本發明的孢子個數為80個。
從上述三個實施例的實驗數據可以看出來：本方法與其他三種傳統的計算孢子萌發率的結果比較相近，因此採用本方法計算孢子的萌發率從而對孢子進行研究完全是可行的；再者，通過比較孢子的數量的數據可以看出來：本發明的孢子個數與培養皿法都是比較多的，兩種方法都便於觀察且都能為孢子萌發的研究提供比較大的基數，但是培養皿法需要持續的進行保溼，費時費力，且本方法通過搖床震蕩，使孢子的萌發更加的均勻，因此本發明完全能適用於孢子萌發的研究。