結直腸癌的生物標記物的製作方法

2023-05-05 18:02:36

技術領域：

本發明屬於生物醫學技術領域，具體涉及基於檢測ifitm1及其調控的hervs相關基因的表達水平來診斷結直腸癌的方法。

背景技術：
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1.近年來，多項研究表明ifitm1在多種惡性腫瘤中高表達，如ifitm1在子宮頸癌、食管癌、卵巢癌、腦癌中均高表達，並且在結直腸癌中表達上調並被認為是結直腸癌分子標誌物。越來越多人關注其在惡性腫瘤的發生發展及腫瘤早期侵襲中的作用。在結直腸癌中，其僅在腫瘤組織有ifitm1表達，在腸道腫瘤形成過程中wnt/β-catenin信號通路的激活能誘導ifitm1的表達；在慢性髓系白血病中，其在高危組表達水平低，低危組表達水平高，表達水平高的患者具有更好的預後，因此，有人認為ifitm1可能是慢性髓系白血病患者預後的分子標誌物。

2.人內源性逆轉錄酶病毒(humanendogenousretroviruses,hervs)是可轉座的遺傳因子，可以插入人的基因組中，在人基因組中佔到8％的比例。其在胚胎發育過程中被激活，ifitm1能保護胚胎和生殖細胞免受內源性逆轉錄酶病毒和外源性病毒的感染。ervs包含有長的末端重複序列(ltrs)，能通過h3k9me3組蛋白修飾來抑制其表達，並且可以通過增加基因組dna甲基化來抑制hervs的表達。hervs過表達會導致基因組不穩定，異常表達的hervs甚至與癌症的發生相關聯。

3.前人研究中提議將ifitm1作為結直腸癌分子標誌物，經過試驗發現在結直腸癌中ifitm1的表達與hervs表達呈負相關，本發明中以ifitm1及hervs的表達作為雙重標準來作為結直腸癌的標誌物。

技術實現要素：
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本發明的目的在於提供一種ifitm1及其調控的hervs在結直腸癌標記中的用途。具體說，本發明涉及ifitm1蛋白及其調控的hervs在結直腸癌診斷試劑盒中的應用。本發明的實施能提供更加準確的結直腸癌的診斷。

本發明的技術方案

一種蛋白及其調控的基因即人內源性逆轉錄病毒在製備用於檢測受試者中存在結直腸癌的體外方法中的試劑盒中的用途，該用途包括：檢測該ifitm1及其調控的基因即人內源性逆轉錄病毒(hervs)在受試者的測定細胞即結直腸活檢測樣品中的表達；將所述的測定值與參考值相比較，ifitm1明顯高於參考值並且hervs明顯低於參考值，表明受試者可能患有結直腸癌。

所述參考值水平是ifitm1和hervs相關基因在正常細胞即結直腸活檢測樣品中的水平。所述正常細胞是相同受試者中與測定細胞相同類型的細胞。所述正常細胞是受試者中與測定細胞相同類型的細胞，所述受試者沒有癌症。所述樣品已知或被懷疑包含腫瘤細胞。

1.本發明至少部分基於對在人結直腸中高表達的ifitm1及在結直腸癌腫瘤中普遍低表達的hervs基因的鑑定。本發明的方法對於結直腸癌的檢測有用。

2.利用ifitm1和hervs作為生物標記診斷結直腸癌。

3.本申請所描述的方法可用於診斷受試者中的結直腸癌的存在。在一些具體實施方案中，所述的方法包括，從受試者獲取樣品，評估所述樣品中ifitm1和hervs存在和/或水平，將所述的存在和/或水平與一個或以上的參照相比較，例如代表正常ifitm1和hervs水平的對照參照，如來自未受影響的受試者或來自相同個體的正常細胞的中的水平。

4.樣品：在本發明的方法的一些具體實施方案中，所述的樣品是包括已知的或被懷疑的腫瘤細胞，例如是活檢樣品。在一些具體實施方案中，所述的樣品是冷凍的，固定的和/或經滲透處理的,例如是福馬林固定石蠟包埋(ffpe)的樣品或冰凍在液氮中的樣品。

5.檢測的方法：a.可以使用本領域任何已知的方法來檢測和/或定量本申請所述的生物標記的水平。例如可以利用本領域已知的方法評估ifitm1和hervs的mrna(轉錄物)的水平，例如northern印跡,rna原位雜交(rna-ish),rna表達測定,例如微陣列分析,rt-pcr,rna測序(例如利用隨機引物或寡t引物),深度測序(deepsequencing)，克隆，northern印跡，和擴增轉錄物,例如利用定量實時聚合酶鏈式反應(qrt-pcr)。b.在一些具體實施方案中，可以檢測ifitm1和hervs編碼的蛋白質的水平。可利用本領域已知的方法評估蛋白質的存在和/或水平,例如利用定量免疫分析方法，如酶聯免疫吸附試驗(elisas),免疫沉澱，免疫螢光，免疫組織化學，酶免疫測定(eia),放射免疫測定(ria)和western印跡分析。c.在一些具體實施方案中，所述的方法包括使選擇性地與生物標記結合的試劑與樣品接觸，以評估樣品中所述生物標記，例如ifitm1及hervs轉錄物/mrna或蛋白質(例如寡核苷酸探針，抗體或其抗原結合部分)的水平。在一些具體實施方案中，所述的試劑帶有可檢測的標記。關於經標記的試劑，包括將所述試劑與可檢測的物質相偶聯(即物理連接)的直接標記，以及通過所述試劑與可檢測的物質的反應性進行間接標記。可檢測的物質的示例是本領域已知的，包括化學發光的，螢光的，放射性的或顯色的標記。例如可檢測的物質包括各種酶,輔基,螢光材料，發光材料，生物發光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物的例子包括鏈黴抗生物素蛋白/生物素，以及親和素/生物素；合適的螢光物質的例子包括傘形酮，螢光素，異硫氰酸螢光素,羅丹明),二氯三嗪氨螢光素(dichlorotriazinylaminefluorescein),丹磺醯氯，量子點(quantumdots)或藻紅蛋白；發光材料的示例包括魯米諾；生物發光材料的示例包括螢光素酶，螢光素和水母發光蛋白；

合適的放射性物質的示例包括125i,131i,35sor3h。總體而言，可利用抗體檢測蛋白質。抗體可以是多克隆抗體，更優選單克隆抗體。可應用完整抗體或其抗原結合片段(例如fab或f(ab')2)。

附圖說明：

圖1是免疫螢光圖和柱狀圖，通過免疫螢光和定量pcr實驗證明ifitm1在結直腸癌腫瘤部位和hescs(wa26和rues2兩個細胞系)中確實高表達。

圖2是包括免疫螢光圖(d,e)，柱狀圖(g,i)，凝膠電泳圖(h)，細胞形態圖(c),曝光圖片(b,f,j)。圖2驗證構建的ifitm1敲除細胞系，並檢驗ifitm1敲除後細胞變化。其中a顯示crispr/cas9敲除基因原理圖。b,d鑑定ifitm1敲除細胞系。c顯示ifitm1敲除後細胞形態無變化。f顯示ifitm1敲除後幹細胞多能性無明顯變化。i,j顯示ifitm1敲除後細胞端粒無明顯變化。g,h顯示ifitm1敲除後細胞端粒酶活性物明顯變化。

圖3是柱狀圖，檢測ifitm1敲除後細胞內hervs的表達。其中a顯示hervs的結構，黑色箭頭表明我們所設計定量pcr(chip-qpcr引物同定量pcr)引物的大致位點。b顯示在hescs中，ifitm1敲除後hervs表達升高(p15代次)。c通過chip-qpcr實驗說明在hescs(rues2)中，ifitm1敲除後h3k9me3在hervs位點的結合下降(p15代次)。

圖4是免疫螢光圖和散點圖，檢測ifitm1敲除後細胞內dna甲基化變化情況。通過免疫螢光實驗，並且統計細胞螢光強度後可以知道5mc/5hmc在ififm1-ko的hescs中下降(即dna甲基化下降)，則可以說明ifitm1通過調控dna甲基化來調控hervs的表達。

圖5是柱狀圖，檢測病人樣品中hervs的表達。說明在結直腸癌中腫瘤部位hervs的表達比正常部位低。

圖6是免疫螢光圖和散點圖，檢測腫瘤樣品中dna甲基化情況。說明在結直腸癌中，通過5mc/5hmc的比值可以知道腫瘤部位5mc(dna甲基化程度高)升高，dna甲基化能抑制hervs的表達，所以ifitm1能通過調控dna甲基化程度來抑制hervs的表達。

具體實施例：

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用限制本發明的範圍。除非另有描述，本發明的實施將採用分子生物學、和免疫學的常規技術，這些均是本領域技術人員所知的。

實施例1：

檢測ifitm1在結直腸癌中和hescs中的表達(圖1)

材料與方法：

1.隨機選取結直腸癌病人，取結直腸癌病人冰凍組織切片(包括腫瘤部位和正常部位)，進行免疫螢光染色。

2.隨機選取結直腸癌病人，提取rna，通過定量pcr檢測其ifitm1的mrna水平；並取hescs細胞系(wa26和rues2)rna,檢測ifitm1表達水平。

3.結果：ifitm1在結直腸癌中腫瘤部位表達量顯著高於正常組織，並且其在hescs細胞系中表達高(以hef細胞作為對照)。

實施例2：

利用crispr/cas9技術構建ifitm1敲除的hescs細胞系(圖2)

1.細胞培養：利用essential8(invitrogen)培養液在37℃、5％co2條件下培養培養hescs細胞，需要每天換液。

2.構建質粒：根據ncbi公布的ifitm1蛋白的cds區序列設計引物，通過擴增、連接等將其插入px459質粒中，經陽性克隆pcr鑑定、測序、blast比對，結果顯示px459-ifitm1構建成功。

3.細胞轉染及鑑定：hescs細胞系在essential8培養液中，於37℃、5％co2培養箱中培養。利用核轉技術將質粒轉到細胞中，然後培養細胞。通過藥物篩選及挑取單克隆細胞，然後經過測序及westernblot實驗和免疫螢光實驗驗證得到ifitm1敲除細胞。

實施例3：

驗證ifitm1敲除後對hescs的影響(圖2,3,4)

1.通過westernblot實驗檢測到ifitm1敲除後細胞多能性沒有變化；通過定量pcr實驗和trap實驗檢測到ifitm1敲除後細胞端粒酶沒有變化；通過定量pcr(t/sratio)實驗檢測到細胞端粒長度沒有變化。

2.通過pcr實驗我們檢測到ifitm1敲除後，收取細胞提取rna,檢測知道細胞內hervs升高。檢測用到的引物如下：

3.通過chip-qpcr實驗(用2中引物)，我們發現在ifitm1敲除後，h3k9me3在hervs位點富集程度下降，因為h3k9me3具有抑制hervs表達的作用，因此導致hervs表達升高。

4.收集3中同代次細胞做免疫螢光(5mc和5hmc)，統計細胞的螢光強度，通過5mc/5hmc比值可以知道，ifitm1敲除後細胞dna甲基化程度降低，dna甲基化能夠抑制抑制hervs的表達。

5結論：ifitm1能通過調節表觀遺傳的方式來抑制hervs的表達。

實施例4：

驗證結直腸中hervs的表達(圖5，6)

1.取結直腸癌病人腫瘤組織和正常組織，然後提取rna，通過定量pcr檢測發現，在腫瘤組織中(ifitm1表達高)hervs表達比正常組織低(ifitm1表達低)。

2.將組織石蠟包埋後切片後，免疫螢光染色(5mc和5hmc)，統計細胞的螢光強度，通過5mc/5hmc比值可以知道，腫瘤組織中(ifitm1表達高)dna甲基化程度高。

3.結論：同hescs中一樣，ifitm1能通過調節表觀遺傳的方式來抑制hervs的表達，並且確定結直腸中腫瘤組織ifitm1表達高，並且hervs表達降低。