骨髓間質幹細胞的製備及其與控釋神經營養因子的聯合應用的製作方法
2023-05-05 22:38:56 1
專利名稱：骨髓間質幹細胞的製備及其與控釋神經營養因子的聯合應用的製作方法
專利說明骨髓間質幹細胞的製備及其與控釋神經營養因子的聯合應用 本發明涉及一種治療神經系統損傷的幹細胞製劑與控釋神經營養因子聯合應用的方法，具體地說，涉及骨髓間質幹細胞製劑的製備及最佳體外神經誘導時間，及其與控釋神經營養因子最佳混合比例，用於治療腦及脊髓中樞神經系統和其它疾病的新技術。對於由神經系統損傷導致的癱瘓和其他神經系統功能障礙臨床上常常無有效治療方法，有人採用神經系統細胞移植來促進神經損傷的功能恢復，但供者神經系統細胞主要來源於胎腦或其它意外死亡者，來源不足有免疫排斥問題且在臨床應用上存在倫理學障礙。因此，選擇新的幹細胞源移植治療中樞神經系統疾病變得越來越重要和緊迫。幹細胞具有自我複製和多向分化的功能，是形成生命機體各種組織器官的起源細胞。在正常生殖生理過程中，幹細胞由受精卵分化而來。幹細胞移植治療中樞神經系統損傷取得了一定的研究成果，但對損傷神經系統的功能重建仍未達到理想的效果。這是因為損傷後神經區域神經營養因子水平下降，限制了中樞神經的修復。鑑於神經營養因子類物質在體內極易降解、半衰期短的特點，必須建立起一種持續供給的體系。在轉基因技術研究領域使用最多的仍是病毒載體，但病毒轉載基因的過程包裹非常複雜的「插入」程序，此外，病毒類載體的存在有引起免疫反應和重組病毒的危險，因此，在研究新型載體的同時研究新的應用方法很有必要。越來越多的新型材料應用於組織工程中來，藥物控釋已成為可降解生物材料的重要應用。
成人骨髓中的間質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)屬於成體幹細胞，具有增殖能力強、來源豐富、採集方便等優點，成為另一個可供細胞移植的細胞源。然而，MSC誘導分化後的神經元其活性如何，移植到中樞神經系統是否可以繼續存活，能否促進神經功能的恢復，尚有疑問。而且移植細胞與控釋神經營養因子使用配比問題也有待解決。因此，建立一種可以廣泛應用於臨床治療中樞神經系統疾病的具有活性的幹細胞誘導技術，並建立相關的細胞與控釋神經營養因子混合配比的技術具有重要的意義。本發明的目的在於提供一種既可以保持移植細胞活性又可以保證誘導的有效性的方法，並提供確定細胞與控釋神經營養因子移植混合物分配比例的方法。
本發明的目的是通過以下方式而實現的骨髓間質幹細胞的製備方法，包括骨髓間質幹細胞的培養；骨髓間質幹細胞的體外誘導；移植誘導骨髓間質幹細胞與控釋神經營養因子GDNF的聯合應用。
骨髓間質幹細胞的培養包括抽取健康猴骨髓，分離單個核細胞；接種於含15％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的L-DMEM培養液中，培養液中添加鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblastic growth factor，bFGF)3ng/ml，培養瓶中貼壁培養；取5-8代骨髓間質幹細胞進行鑑定，體外誘導觀察其成骨、成脂肪多向分化潛能；移植前48小時5-溴脫氧尿嘧啶核苷酸(5-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU)按10umol/L濃度標記，計數備用。其中骨髓間質幹細胞的體外誘導時間為1.5小時；3.0×106骨髓間質幹細胞與GDNF含量為0.5ug的控釋膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic fanctor，GDNF)為最佳配比。
本發明還包括以前述方法製備的骨髓間質幹細胞在製備修復中樞神經損傷藥物中的應用。
本發明具有的重要用途如下1.猴MSC的原代培養要比大鼠MSC的培養困難，而這種難度和成人MSC的培養難度相當，本發明建立起一種改良的培養方法從而使MSC的培養變得容易。
2.本發明確定了體外誘導最佳時間的方法，既可以保證誘導的有效性，又可以保證移植細胞的活性。
3.本發明解決了細胞與控釋神經營養因子的移植比例的問題，從而達到兩組的優化組合。
4.本發明採用自體MSC移植，因而具有很大的應用優勢。
5.本發明採用猴為對象，其遺傳背景與人較大鼠等低等動物更為接近，脊髓損傷後的病理改變過程與人類更為接近。
6.採用標準化的猴脊髓挫傷模型，損傷程度相當於人類的截癱，其與臨床上發生的大多數脊髓損傷類型接近，因而具有良好的模擬性。
7.本發明觀察指標全面，誘發電位檢測為臨床常用的評價脊髓功能的方法。病理分析全面，實驗結果可靠，具有重大的參考價值。本發明對實驗動物的觀察期長達4～5個月，其中一隻長達1年，實驗結果更加有意義。
8.所使用控釋載體對機體無毒無害，可以完全降解，可以產業化生產，應用方便。
9.所使用的MSC經過流式分析、多向分化潛能的鑑定，使用可靠。
10.MSC移植前，經中藥提取物誘導，既可以保證移植細胞在體內繼續向神經方向分化，有避免了MSC體內成瘤的潛在危險。
胚胎幹細胞、神經幹細胞存在著獲取困能、倫理問題等，因而在應用上存在著很大限制；造血幹細胞在治療神經損傷性方面很有局限性；而骨髓間質幹細胞由於獲取容易，體外擴增容易，因而很容易獲取所需數量的細胞，在操作上具有簡單性、可行性，更為重要的是MSC可從自體獲取，根本不用考慮免疫排斥反應，因而在應用後不需要使用免疫抑止劑，而當前免疫移植劑的價格是很昂貴的，而且應用後還存在著很大副作用，因此MSC的推廣應用不但可以為患者節省一大筆開支，而且較少不必要的副作用。所以，MSC較其他細胞在治療神經損傷性疾病方面具有最強的競爭力。經神經誘導的MSC可以在脊髓內更好向神經元細胞分化，而且避免了其成瘤的可能性。
總之，本發明確定了最佳神經誘導時間，最佳MSC與控釋GDNF比例，通過聯合局部移植的方法使損傷猴脊髓的功能康復及結構修復。為細胞與生物工程材料的聯合應用提供了指導方法。因此，此項發明是治療脊髓損傷和相關疾病的有效策略，具有廣闊的臨床開發前景。
圖1是GDNF控釋生物材料掃描電鏡像。顯示GDNF包裹於單甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚體(Poly(lactic acid)-Poly(eyhylene glycol)，mPEG-b-PLA)形成的微球體中，隨著材料的降解，GDNF可以釋放出來發揮生物學活性。
圖2顯示正常皮層體感誘發電位(cortical somatosensory evoked potential，CSEP)呈正(P)、負(N)雙向波型。
圖3顯示經顱磁刺激運動誘導電位(motor evoked potential，MEP)波型呈多極性波。
圖4顯示脊髓損傷部位神經元[尼氏染色(×400)]。
A.實驗組脊髓損傷部位前角神經元數量多，運動神經元胞體清晰，細胞可見數量眾多的尼氏小體。
B.對照組脊髓損傷部位前角神經元數量減少，胞體內尼氏小體消失，細胞水腫。
圖5顯示脊髓損傷部位皮質脊髓側束[甘氨銀浸鍍法染色(×400)]A.實驗組脊髓損傷部位皮質脊髓側束橫切面組織結構正常，軸突密度高，著色深。
B.對照組脊髓損傷部位皮質脊髓側束橫切面結構疏鬆、紊亂，軸突密度低。
C.實驗組脊髓損傷部位皮質脊髓側束縱切面軸索排列整齊，結構完整，連續性好。
D.對照組脊髓損傷部位皮質脊髓束縱切面軸索斷裂，結構破壞。
圖6免疫雙標組化反應(×400)，顯示實驗組脊髓前角免疫雙標陽性細胞(核藍紫色，胞漿棕褐色)，在前角運動神經元周圍可觀察到BrdU和NSE雙標陽性細胞。實施例1、改良骨髓間質幹細胞(MSCs)的製備技術實例。抽取健康猴髂骨骨髓，分離單個核細胞，接種於含15％FBS的L-DMEM培養液中(其中添加bFGF，3ng/ml)，塑料培養瓶中貼壁培養。取5-8代骨髓MSCs進行鑑定，方法包括流式細胞儀檢測其表面抗原標誌，體外誘導觀察其成骨、成脂肪多向分化潛能。移植前48小時Brdu按10umol/L濃度標記，計數備用。
實施例2、用於移植的MSCs體外最佳誘導時間的確定。將MSCs誘導細胞分為0小時組(對照)、1小時組、1.5小時組、2小時組和3小時組，每組分為6個樣本，分別進行巢蛋白(NESTIN)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)免疫組化染色，並利用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。
(平均) NESTIN陽性率(％) NSE陽性率(％) 細胞凋亡百分比(％)0小時組 0 02.71小時組 1015 2.81.5小時組 2530 3.22小時組 1035 5.73小時組 3 55 7.2從結果中可以看出，誘導1.5小時既可以保證誘導的效果又可以保證細胞的活性，是最佳誘導時間。而目前關於誘導細胞的移植並沒有關注移植細胞活性的問題，若移植細胞誘導後活性喪失必然影響到移植的效果。
實施例3、移植誘導MSCs與控釋神經營養因子的最佳配比的確定。將GDNF含量不同的控釋GDNF分別在培養液中放置1周，然後將此培養液配成神經誘導液分別對3.0×106猴MSCs進行誘導，每組6個樣本，並檢測3小時的細胞凋亡百分比。
GDNF含量ug 細胞凋亡百分比(平均)0 7.20.256.40.375 5.80.5 3.80.625 3.80.753.6從結果中可以看出，GDNF含量在0.5時可以明顯降低誘導細胞的凋亡百分比，而且再增加含量效果無明顯增加，因此，3.0×106細胞與GDNF含量為0.5ug的控釋GDNF為最佳配比，因在本實驗中移植細胞總量為1.2×107，因子所需GDNF總量為2ug。而在目前，移植細胞與控釋因子在移植過程中的比例仍無有效的確定方法。
實施例4、實驗移植骨髓MSCs源性神經前體細胞與GDNF控釋生物材料治療脊髓人為損傷所致的猴神經功能障礙實例。按實例1、實例2所述方法分別分離培養MSCs及製備GDNF控釋生物材料。製備動物模型，取8隻健康雄性恆河猴，體重4kg，隨機分組。採用肌肉鹽酸氯胺酮注射液與地西泮注射液複合麻醉，手術按改良Allen’s法製作胸段脊髓損傷模型。
實驗設計如下移植組損傷後第10天，消化計數誘導的猴MSCs，將3.0×106cells/kg與含2ugGDNF的控釋生物材料製成200uL的PBS懸液，分五點注射到實驗組(n＝4)脊髓損傷部位(損傷脊髓階段頭尾端左右前角部位各一點，損傷中端後中間溝一點)PBS組給予同等劑量的PBS。
採用美國Nicolet公司生產的VikingIV型誘發電生理儀分別於術前、脊髓休克期過後、治療後4-5月進行皮層體感誘發電位(CSEP)、經顱磁刺激運動誘發電位(MEP)檢測，客觀評價脊髓感覺與運動功能；按照改良Tarlov評分法分標準進行運動功能評價；為了解治療對脊髓結構的保護作用，應用尼氏染色觀察前角運動神經元，應用甘氨銀法觀察軸索，並進行圖形分析。為了解移植細胞在猴脊髓內的存活與分化情況，本發明對脊髓石蠟切片進行免疫雙標組化法檢測Brdu標記細胞的存活、遷移與神經分化情況。
CSEP檢測結果(表1)。
表1 CSEP測潛伏期與波幅的均值(x±s) n＝8組別潛伏期(ms)潛伏期(ms)波幅(μV)波幅降低度(μV)實驗組 治療前 16.04±0.82 20.46±0.80 10.56±1.303.78±1.32a治療後 16.75±0.58b20.60±1.18c6.65±0.90對照組 治療前 16.42±1.20 19.82±1.52 9.95±0.849.95±0.84未治療0與對照組比較at＝-11.194，P＜0.01；與實驗組正常比較，bt＝-2.013，P＝0.07；與實驗組正常比較，ct＝-0.274，P＝0.8損傷前所有獼猴脛後神經均可引出正常的CSEP信號(圖2)。損傷後所有動物CSEP信號消失，4～5月後，治療組與損傷前相比潛時期無明顯延長，但波幅降低(6.65±0.90)μV，波幅降低度(3.78±1.32)μV，與對照組波幅降低度(9.95±0.84)μV之間具有顯著性差異，p＜0.01；對照組CSEP信號仍然無法引出。表明移植組的感覺功能獲得了一定程度的恢復，而PBS組無變化。
MEP檢測結果(表2)。
表2實驗不同階段MEP的潛伏期和波幅(x±s)潛伏期(ms)波幅(mv)正常 4-5月後正常4-5月後 波幅降低度實驗組 20.15±0.9429.92±1.440.88±0.030 0.43±0.084 0.45±0.032對照組 20.92±0.82 0.92±0.052 0 0.92±0.052實驗組波幅降低度與對照組比較P＜0.01MEP由多極性波組成(圖3)，損傷後第10天，所有實驗動物MEP缺失，治療後4～5月，實驗組MEP波型有一定恢復，但潛時期延長(p＜0.01)，波幅降低(P＜0.01)，對照組MEP仍然缺失。波幅降低度是指與正常波幅之間的差值，間接反映了脊髓損傷後波幅恢復的程度，波幅降低度越小，與正常值之間的差值就越小，波幅恢復程度就越高，治療效果就越好。實驗組的波幅降低度明顯低於對照組，p＜0.01。表明移植組的運動功能獲得了一定程度的恢復，而PBS組未觀察到這種變化。
Tarlov評分結果。由於皮質脊髓束損傷(上運動神經元癱)，脊髓休克期(損傷後一周左右)，過後，獼猴主要保持一種遲緩性癱瘓狀態下肢屈曲、內收，髖及膝關鍵屈曲，各趾蹠屈。對照組這種狀態保持到實驗終期，評分等級0級；治療後3周期始，實驗組可觀察到股部肌肉和膝關節的輕微運動，8周時這種運動變得較為明顯，膝關節活動度增加，並可以觀察到趾及踝關節的運動，3月中，膝關節活動度明顯加大，但仍不能完全伸展，下肢仍無法支撐自身體重，站立不能，繼續觀察4周以上，治療效果不再有明顯改觀，處死動物，評分等級1-2級。表明移植組的運動功能有一定恢復，而PBS組運動功能始終不能恢復。
尼氏染色結果(表3)。
表3前角運動神經元數量(個)(x±s)實驗組 對照組神經元計數 18.3±0.90 5.6±0.68P＜0.01實驗組脊髓前角大、中型運動神經元數量較多，尼氏小體染色正常(圖4A)；對照組神經元數量顯著減少(p＜0.01)，尼氏小體消失(圖4B)。
軸突染色結果(表4，5)。
表4脊髓皮質脊髓側束橫切面軸突數量和橫切面積(x±s)項 目軸突數(個)/平均視野面積(um2)/平均視野左側① 右側② 左右平均③ 左側④ 右側⑤左右平均⑥實驗組 1423±2611404±189 1412±220 13213.89±2954.23 10238.61±1200.0211771.25±1131.05對照組 734±175 707±229 720±168 6024.71±1542.924992.22±1949.455538.45±2000.28①P＜0.01，②P＜0.01，③P＜0.01，④P＜0.01，⑤P＜0.01，⑥P＜0.01表5脊髓皮質脊髓側束縱切面縱切面積；光密度值(x±s)項 目面積(um2)/平均視野平均光密度 平均積分光密度實驗組(左) 25319.27±2108.01 0.4340±0.0279 11388.82±1307.20(右) 26118.50±2597.80 0.4197±0.0386 12009.36±1512.68(左右平均) 25718.88±2302.82 0.4268±0.0293 11499.09±1390.00對照組(左) 15205.86±1468.36 0.3192±0.0675 5235.30±1179.30(右) 13662.06±3668.50 0.3212±0.03024664.26±1618.21(左右平均) 14413.96±2323.76 0.3202±0.04774949.78±1479.82左側面積/平均視野比較P＜0.01；左側平均光密度值比較P＜0.05；左側平均積分光密度值比較P＜0.01；右側面積/平均視野比較P＜0.01；右側平均光密度值比較P＜0.01；右側平均積分光密度值比較P＜0.01；實驗組組織結構完整，軸突密度高；對照組側索框架結構破壞嚴重，皮質脊髓側束軸突密度低，軸索破壞(圖5)。光密度反映物體對光的吸收率，可反映軸突染色的深淺度。軸突染色越深，其對光線的吸收越多，故光密度越高。積分光密度是平均光密度與面積的乘積，顏色越深，面積越大，積分光密度越高。結果顯示治療組後索軸索平均光密度、積分光密度高於對照組，有顯著性差異，p＜0.01。表明移植組組織結構恢復程度較好。
免疫組化染色結果表明，移植後4～5個月，實驗組脊髓損傷區仍然有BrdU標記的猴骨髓間質幹細胞源性細胞存活，並且可以表達神經元標誌物NSE(圖6)，說明使用本方法可以使移植到脊髓中的誘導的猴骨髓間質幹細胞存活，而且有機的與脊髓神經組織整合在一起，並進一步具備分化為神經組織細胞的能力。這種雙標陽性的細胞在每張脊髓切片(厚4um)中的數量為6-8個，散在分布，脊髓內各處都可以出現。我們推測移植細胞替代損傷組織細胞的方式可能是其修復脊髓損傷的一個重要機制。
神經營養因子已經顯示出對中樞神經損傷的修復作用，如何有效的應用神經營養因子修復神經損傷是目前研究的一個重點。鑑於神經營養因子類物質在體內極易降解、半衰期短的特點，必須建立起一種持續供給的體系。在轉基因技術研究領域使用最多的仍是病毒載體，但病毒轉載基因的過程包裹非常複雜的「插入」程序，此外，病毒類載體的存在有引起免疫反應和重組病毒的危險，因此，在研究新型載體的同時研究新的應用方法很有必要。
藥物控釋已成為可降解生物材料的重要應用。單甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚體(mPEG-b-PLA)是一種良好的生物材料，然而這種生物材料是否可以用來進行脊髓局部移植治療還不清楚。
當mPEG-b-PLA植入脊髓後，首先發生的是材料吸水，滲入材料的水很快在材料表面和內部之間形成一個梯度。但是這種梯度會在幾天內消失，因為像水這樣的小分子的擴散速度比酯鍵的斷裂速度快得多。因而，可以認為酯鍵的水解開始時是均勻的。降解會使能加速酯鍵水解的羧基端基的數目增加，只有能溶於周圍水性介質的低聚物才能從材料上脫離下來。隨著時間的延長，那些位於材料表面的可溶性齊聚物可以在完全降解之前被分離出來，而那些在材料內部的齊聚物仍然受到束縛，導致內部的酸性大於表層，從而產生羧基濃度的內外差異。隨著降解的進行，材料內部會有越來越多的羧基加速內部材料的降解，並進一步增大內外差異。當內部材料完全轉變成可降解性齊聚物並溶解在水性介質中時，就會形成表面由沒有完全降解的高聚物組成的中空結構，其表面厚度由很多因素決定。酶解作用在材料的降解過程中尤其在後期也發揮了一定作用。
權利要求
1.骨髓間質幹細胞的製備方法，包括骨髓間質幹細胞的培養；骨髓間質幹細胞的體外誘導；移植誘導骨髓間質幹細胞與控釋膠質細胞源性神經營養因子GDNF的聯合應用。
2.根據權利要求1所述製備方法，其特徵在於骨髓間質幹細胞的培養包括抽取健康猴骨髓，分離單個核細胞；接種於含15％胎牛血清FBS的L-DMEM培養液中，培養液中添加鹼性成纖維細胞生長因子bFGF，3ng/ml，培養瓶中貼壁培養；取5-8代骨髓間質幹細胞進行鑑定，體外誘導觀察其成骨、成脂肪多向分化潛能；移植前48小時5-溴脫氧尿嘧啶核苷酸Brdu按10umol/L濃度標記，計數備用。
3.根據權利要求1所述製備方法，其特徵在於骨髓間質幹細胞的體外誘導時間為1.5小時。
4.根據權利要求1所述製備方法，其特徵在於3.0×106骨髓間質幹細胞與GDNF含量為0.5ug的控釋GDNF為最佳配比。
5.以前述方法製備的骨髓間質幹細胞在製備修復中樞神經損傷藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及骨髓間質幹細胞製劑的製備及最佳體外神經誘導時間，及其與控釋神經營養因子最佳混合比例，用於治療腦及脊髓中樞神經系統和其它疾病的新技術。骨髓間質幹細胞MSC的製備方法，包括骨髓間質幹細胞的培養；骨髓間質幹細胞的體外誘導；移植誘導骨髓間質幹細胞與控釋膠質細胞源性神經營養因子GDNF的聯合應用。本發明還包括以前述方法製備的骨髓間質幹細胞在製備修復中樞神經損傷藥物中的應用。本發明確定了最佳神經誘導時間，最佳MSC與控釋GDNF比例，通過聯合局部移植的方法使損傷猴脊髓的功能康復及結構修復，為細胞與生物工程材料的聯合應用提供了指導方法。因此，本發明是治療脊髓損傷和相關疾病的有效策略，具有廣闊的臨床開發前景。
文檔編號C12N5/08GK1710068SQ200510035460
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月23日 優先權日2005年6月23日
發明者鄧宇斌 申請人:中山大學