立達黴有關物質的測定方法與流程

2023-05-05 20:22:41

本發明涉及農藥技術領域，具體地說，是立達黴有關物質的測定方法。

背景技術：

高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,hplc)是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩衝液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱中，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。高效液相色譜法已在化學、醫學、工業、農學、商檢、法檢等領域得到廣泛的應用。

中國專利文獻cn105223278a公開了一種固相萃取液質聯用法測定葡萄酒中甲霜靈、多菌靈的方法，包括先調節待測葡萄酒的ph值，用乙腈對酒樣進行液液萃取，加入氯化鈉待溶液鹽析後用固相萃取柱萃取乙腈層，通過固相萃取柱洗脫，收集淨化後的洗脫液，繼而轉入旋轉蒸發儀濃縮，用氮氣吹乾濃縮液，通過乙腈水溶液回溶後，注入液質聯用儀進行分析，獲得葡萄酒中甲霜靈、多菌靈的含量的步驟。中國專利文獻cn104535671a公開了一種茄子中甲霜靈殘留的檢測方法，包括以下幾個步驟：(1)樣品處理：將採摘後的茄子置於破碎機中破碎，得到茄子漿；(2)提取：稱取茄子漿20g於錐形瓶中，加入100ml的乙酸乙酯和丙酮混合液，在溫度為35-40℃的條件下振蕩提取60-70min，抽濾得清液，濃縮至近幹，氮吹至幹，用2ml乙腈復溶備用；(3)小柱分離：用5ml乙酸乙酯洗滌hlb小柱，再用5ml丙酮洗滌小柱，上樣，用10ml體積比為1:2的乙腈和水混合液淋洗小柱，最後用10ml的乙腈洗脫，收集洗脫液，旋蒸至1ml，氮氣吹乾，採用乙腈定容至2ml，待檢測；(4)檢測：採用hplc進行檢測。但是關於本發明的立達黴有關物質的測定方法目前還未見報導。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種立達黴有關物質的測定方法。

為實現上述目的，本發明採取的技術方案是：一種立達黴有關物質的測定方法，所述的測定方法包括：

(1)專屬性試驗，

(2)穩定性試驗，

(3)最大的有關物質測定。

一種立達黴專屬性試驗方法，所述的試驗方法包括：

(1)酸破壞試驗：取樣品加鹽酸溶液，置熱水浴中加熱，取出後放冷，用氫氧化鈉中和，加流動相稀釋，然後進行hplc分析；

(2)鹼破壞試驗：取樣品加氫氧化鈉，置熱水浴中加熱，取出後放冷，用鹽酸中和，加流動相稀釋，然後進行hplc分析；

(3)氧化破壞試驗：取樣品加過氧化氫，放置一段時間後取出，加流動相稀釋，然後進行hplc分析；

(4)加熱破壞試驗：取樣品加流動相稀釋，置100℃水浴中加熱，取出後放至室溫，然後進行hplc分析；

(5)光破壞試驗：取樣品置於紫外燈下照射，加流動相稀釋，然後進行hplc分析。

所述的試驗方法包括：

(1)酸破壞試驗：取樣品20mg加1mol/l鹽酸溶液5ml，置熱水浴中加熱30min，取出後放冷，用1mol/l氫氧化鈉溶液中和，加流動相稀釋製成每1ml中含2mg樣品的溶液，然後進行hplc分析；

(2)鹼破壞試驗：取樣品20mg加1mol/l氫氧化鈉溶液5ml，置熱水浴中加熱30min，取出後放冷，用鹽酸中和，加流動相稀釋製成每1ml中含2mg樣品的溶液，然後進行hplc分析；

(3)氧化破壞試驗：取樣品20mg加30％過氧化氫5ml，放置1小時後取出，加流動相稀釋製成每1ml中含2mg樣品的溶液，然後進行hplc分析；

(4)加熱破壞試驗：取樣品加流動相稀釋製成每1ml中含2mg樣品的溶液，置100℃水浴中加熱2小時，取出後放至室溫，然後進行hplc分析；

(5)光破壞試驗：取樣品置於紫外燈下照射24小時，稱取20mg加流動相稀釋製成每1ml中含2mg的溶液，然後進行hplc分析。

hplc分析的條件為：c18柱，柱溫是30℃，檢測波長225nm，流速1.5ml/min，流動相為甲醇：水＝5:95。

一種立達黴穩定性試驗方法，所述的穩定性試驗方法包括以下步驟：稱取樣品並用流動相溶解，在0-24h內在hplc進樣分析，記錄色譜圖，以主峰峰面積考察溶液的穩定性。

一種立達黴最大的有關物質的測定方法，所述的測定方法為運用hplc測定2,6-二甲苯胺，色譜柱為c18柱，流動相為乙腈：磷酸水＝40：60，檢測波長為225nm，檢測溫度為30℃，流速為1.25ml/min，進樣量為10μl。

2,6-二甲苯胺的檢出限為0.02μg/ml。

2,6-二甲苯胺的定量限為0.1μg/ml。

本發明優點在於：

1、本發明採用hplc對立達黴有關物質進行測定，具有高效、分離效能高，靈敏度高，分析速度快，準確度高等優點。

2、本發明提供了立達黴的專屬性試驗方法、穩定性試驗方法和最大的有關物質的測定方法。

附圖說明

附圖1：未破壞的系統適應性溶液色譜圖。

附圖2：光破壞立達黴的色譜圖。

附圖3：酸破壞立達黴的色譜圖。

附圖4：鹼破壞立達黴的色譜圖。

附圖5：氧化破壞立達黴的色譜圖。

附圖6：2,6-二甲苯胺的色譜圖。

附圖7。2,6-二甲苯胺和立達黴的色譜圖。

附圖8：0.1μg/ml的2,6-二甲苯胺的色譜圖。

具體實施方式

下面對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。

對照品：

立達黴(甲霜靈)對照品：購自北京世紀奧科生物技術有限公司，德國dr.ehrenstorfer，cas編號57837-19-1(watercontent0.1％,det.purity99.0％,tolerance/uncertainty+/-0.5％,determinedbykarl-fischertitration)。

供試品：

「複方立達黴粉」(美婷)，長沙拜特生物科技研究所有限公司提供，樣品編號分別為20111101、20111201、20120101、20120508、20120708、20120722、20120811、20120813、20120830、20121101、20121201和20130101。

溶液製備

供試品溶液取本品適量，加流動相稀釋至每1ml中約含立達黴0.1mg的溶液，作供試品溶液。

對照品溶液精密稱取立達黴對照品適量，加流動相溶解並稀釋為每1ml中約含0.1mg立達黴的溶液，作為對照品溶液。

1、專屬性試驗

酸破壞試驗：取立達黴20mg，加1mol/l鹽酸溶液5ml，置熱水浴中，加熱30min取出，放冷，用1mol/l氫氧化鈉溶液中和，加流動相稀釋製成每1ml中含2mg的溶液，上hplc。

鹼破壞試驗：取立達黴20mg，加1mol/l氫氧化鈉5ml，置熱水浴中，加熱30min取出，放冷，用1mol/l鹽酸溶液中和，加流動相稀釋製成每1ml中含2mg的溶液，上hplc。

氧化破壞試驗：取立達黴20mg，加30％過氧化氫5ml，放置1h，取出，加流動相稀釋製成每1ml中含2mg的溶液，上hplc。

加熱破壞試驗：取立達黴適量，加流動相溶解並稀釋成每1ml中含有2mg的溶液，置100℃水浴中，加熱2h，取出，放至室溫。上hplc。

光破壞試驗：取立達黴適量，置紫外燈下，照射24h，稱取20mg，精密測定，加流動相溶解並稀釋成每1ml中含有2mg的溶液，上hplc。

根據製劑處方及工藝，製備空白輔料樣品，上hplc。

取系統適用性溶液，上hplc。

hplc條件：色譜柱是rp-ods柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱溫是30℃，檢測波長包括225nm，流速1.5ml/min，流動相為甲醇：水＝5:95(v:v)。

未破壞的系統適應性溶液色譜圖見附圖1，光破壞立達黴的色譜圖見附圖2，酸破壞立達黴色譜圖見附圖3，鹼破壞立達黴色譜圖見附圖4，氧化破壞立達黴色譜圖見附圖5。

結果顯示，立達黴經過酸/鹼水浴、光和氧化破壞能產生明顯的降解產物，立達黴在加熱破壞時未出現降解產物。建立的hplc法能有效分離立達黴及其經酸鹼、光和氧化破壞後產生的降解產物，立達黴峰與其它分解產物峰分離良好，說明本法專屬性強。

2、穩定性試驗

精密稱取「複方立達黴粉」(批號20111101)適量，加流動相溶解，在0～24h內進樣測定並記錄色譜圖，以主峰峰面積和雜質含量為指標考察溶液穩定性，結果見表1。立達黴主峰面積的rsd＝0.25％。結果表明立達黴供試品溶液24h內穩定性良好。

表1穩定性試驗結果

3、樣品測定

將不同批次的「複方立達黴粉」按照以上方法(穩定性試驗的操作方法)進行測定，結果見表2。在有關物質方面，「複方立達黴粉」樣品中單個最大雜質最高為3.48％，最低為1.97％，平均為2.75％。「複方立達黴粉」樣品中總雜質最高為5.32％，最低為3.24％，平均為4.48％。

表2樣品有關物質測定結果

根據有關物質測定結果，將單個雜質限度定為4.0％，雜質總量限度定為6.0％。

4、最大的有關物質

最大的有關物質為2,6-二甲苯胺。2,6-二甲苯胺是立達黴合成途徑過程的中間產物(詳見《立達黴(甲霜靈)生產工藝》)，有可能在生產立達黴原料過程中摻入到立達黴原料中。

2,6-二甲苯胺的分析方法採取高效液相色譜法，色譜條件為：c18rp-ods柱(150mm×4.6mm,5μm)；流動相【乙腈：磷酸水＝40：60(v/v)】；檢測波長為225nm；檢測溫度30℃，流速為1.25ml/min。進樣量10μl。該檢測方法可以有效地將檢測2,6-二甲苯胺，2,6-二甲苯胺保留時間約為1.68min(附圖6)。將2,6-二甲苯胺和立達黴的混合液上hplc，2,6-二甲苯胺保留時間約為1.68min，立達黴的保留時間為4.97min(附圖7)，證明該方法特異性良好。

以信噪比s/n≥3計算，確定2,6-二甲苯胺的檢出限為0.02μg/ml，相當於總含量的0.01％。以信噪比s/n≥10計算，確定2,6-二甲苯胺的定量限為0.1μg/ml(附圖8)，相當於總含量的0.05％。以上比例均遠低於雜質的限度值。

將系列濃度梯度的2,6-二甲苯胺標準溶液上hplc。以2,6-二甲苯胺濃度(μg/ml)為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪製標準曲線。2,6-二甲苯胺標準溶液在0.1μg/ml-1000μg/ml的線性範圍內與峰面積的線性關係良好，線性回歸方程為y＝5.5254x+6.1058，相關係數(r2)為0.9999。

將一定量2,6-二甲苯胺添加到空白溶液中，用以上方法，測定2,6-二甲苯胺的準確度和精密度。2,6-二甲苯胺的平均回收率為94.60％～99.02％，精密度為0.55％～4.45％，詳細見表3。

表32,6-二甲苯檢測的準確度和精密度(n＝5)

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護範圍。