酵母展示脂肪酶催化合成l-抗壞血酸棕櫚酸酯的方法

2023-05-05 17:45:46 3

專利名稱：酵母展示脂肪酶催化合成l-抗壞血酸棕櫚酸酯的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯的方法。
背景技術：
BHA、BHT、PG、TBHQ等合成抗氧化劑廣泛用於食品工業，但是由於存在致癌，體內消化後有毒性等安全隱患，其食用越來越受質疑，天然抗氧化劑也因此備受青睞。L-抗壞血酸 (維生素C)是目前使用最多的天然抗氧化劑之一，隨著兩步發酵法生產維生素C技術的不斷成熟，我國生產維生素C產量已居世界之首，生產成本也相對較低。然而，維生素C是水溶性的天然抗氧化劑，只能在水相體系發揮作用，但食品體系往往是油相或者是多相的，這就大大局限了維生素C的使用範圍。將合適的親油性基團「嫁接」到維生素C上合成脂溶性衍生物，從而改變其親水性及溶解性可有效解決這一問題。L-抗壞血酸棕櫚酸酯(L-ascorbyl palmitate)是維生素C上「嫁接」棕櫚酸的衍生物，它是已被FDA及中國食品添加劑委員會批准使用的營養型抗氧化劑，在嬰幼兒配方奶粉等食品行業中得到廣泛應用。目前實現這一「嫁接」有化學法和生物酶法，由於化學法存在轉化條件苛刻(強酸、鹼催化、高溫高壓)、無特異性、產物複雜、副產物多、分離難、安全性差等弊端，生物酶法越來越受青睞。脂肪酶是目前維生素酯合成中使用最廣泛的酶，但是生產成本高、固定化過程繁雜費時大大局限了其商業化應用。

發明內容
本發明提供了一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯的方法，可顯著降低L-抗壞血酸棕櫚酸酯生產成本，同時達到較高的酯化反應效率和產率。一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯的方法，包括將L-抗壞血酸和棕櫚酸溶於有機溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，無氧條件下於 50 60°C反應4 8小時，分離、純化製得L-抗壞血酸棕櫚酸酯。優選的，所述的有機溶劑為四氫呋喃。優選的，每升有機溶劑中L-抗壞血酸、棕櫚酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為 15 35g、200 500g、50 100g。攪拌速率為200 250轉/分鐘。優選的，在分離純化前加入分子篩，繼續攪拌反應10 12h，鎖住水分，促進酯化
反應進一步進行。所述的分離、純化為離心取上清液，旋轉蒸發除去有機溶劑，水洗後溶於正己烷，
重結晶。所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法製備將經線性化處理的重組質粒轉入畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，將所得轉化子接種於BMMY培養基中，誘導培養72 144小時後離心收集菌體，菌體經衝洗、生物印跡和冷凍乾燥製得酵母展示脂肪酶；所述的重組質粒由原始載體pPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下遊的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因組成。所述的脂肪酶基因可選用Genbank號為AF229435的序列，畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115為商業化產品，可從^witrogen公司購得。它的細胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 號為]\C8164。載體PPIC9K為商業化產品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)，同時該載體內信號肽序列上遊存在AOXl啟動子(Genbank號 Ζ46233)。重組質粒線性化處理的目的是為了與胞內基因組發生同源重組，提高表達穩定性。優選的，所述生物印跡所用配體為油酸，它可以誘導酶結構改變，提高轉化率。本發明通過將脂肪酶基因和細胞壁α凝集素基因導入畢赤酵母細胞GS115，畢赤酵母細胞誘導培養後，脂肪酶表達並分泌到胞外，同時利用細胞壁α凝集素將該脂肪酶固定在細胞表面。利用該酵母展示脂肪酶對酯化反應進行催化，不僅提高了操作穩定性、耐熱性以及重複性，而且反應產物單一(為6-0-Palmitoyl-L-ascorbic acid)，轉化率(以 L-抗壞血酸計)在90%以上，產率高達87%。
具體實施例方式實施例1製備酵母展示脂肪酶通過人工合成的方法，合成米根黴(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 號AF229435)和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因(Genbank號為Μ28164)，同時在脂肪酶基因C端加上連接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，連接後得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同時在序列兩端添加EcoR I和Not I酶切位點，其中 pro-ROL為脂肪酶基因，α-agglutinin為細胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列為模板，利用下述引物對，進行PCR擴增，上遊引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下遊引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反應體系為模板DNA為1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下遊引物各0. 5 μ 1，10XPCR緩衝液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR運行條件為94°C 3分鐘，；35個循環(94°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 30秒)， 72 V 10分鐘。用EocR I和Not I同時酶切PCR產物和pPIC9K質粒，並在T4連接酶的作用下過夜連接形成PPIC9K-R0L質粒，通過電泳檢驗並回收質粒。為使目的基因與畢赤酵母GS115 發生His 4單位點置換重組，用Ml I對pPIC9K-R0L質粒進行酶切線性化處理。將酶切線性化處理好的目的基因約15 μ 1加入到事先準備好的畢赤酵母GS115感受態細胞中，轉入電轉杯中，冰浴15min，然後在1500V，400Q，25uF條件下電擊10ms，並加入約Iml預冷的山梨醇。將上述混勻的電轉產物約400μ 1塗於MD平板上，篩選陽性轉化子，然後將陽性轉化子塗於不同濃度的G418平板上，根據陽性轉化子對G418的抗性篩選出Mut表型的多拷貝陽性重組菌株。
將多拷貝陽性重組菌株接種在BMGY培養基中發酵培養30h，離心收集細胞；再將細胞置於含有0.5% (體積百分比)甲醇的BMMY培養基中誘導培養144h，離心收集細胞， 用水衝洗後，接種至YGC培養基中30°C培養120h，然後3000g離心分鐘收集菌體，蒸餾水洗滌後再用50mM pH7. 0磷酸緩衝液洗滌，然後與2倍體積油酸混合，-80°C下預凍後再經德國 Christ真空冷凍乾燥機乾燥Mh，用己烷洗滌除去油酸，再進行再真空乾燥去除己烷，即得到經生物印跡處理的酵母展示脂肪酶。實施例2酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯實例1取L-抗壞血酸0. 176g、棕櫚酸2. 308g，加入含有IOmL四氫呋喃的磨口三角瓶，混合、預熱lOmin，然後加入上述酵母展示脂肪酶0. 5g，充隊密封，置於85_1型磁力攪拌器中攪拌開始反應，轉速為250轉/分鐘，反應溫度保持在45°C，反應他後加入0. 5g分子篩(孔徑小於2nm)，繼續反應1 後停止攪拌，離心沉澱除去酵母展示脂肪酶及分子篩， 取上清液進行旋轉蒸發除去四氫呋喃，水洗3次後加入正己烷於4°C結晶得L-抗壞血酸棕櫚酸酯產品，烘乾、粉碎即可。實例2取L-抗壞血酸0. 352g、棕櫚酸4.616g加入含有IOmL四氫呋喃的磨口三角瓶，混合、預熱lOmin，然後加入上述酵母展示脂肪酶lg，充隊密封，置於85-1型磁力攪拌器中攪拌開始反應，轉速為200轉/分鐘，反應溫度保持在50°C，反應他後加入1. 5g分子篩(孔徑小於2nm)，繼續反應1 後停止攪拌，離心沉澱除去全細胞催化劑及分子篩，取上清液進行旋轉蒸發除去四氫呋喃，水洗3次後加入正己烷於4°C結晶得L-抗壞血酸棕櫚酸酯產品，烘乾、粉碎即可。 實施例3採用傳統化學法合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯實例1取L-抗壞血酸0. 176g、棕櫚酸2. 308g，加入含有IOmL四氫呋喃的磨口三角瓶，混合、預熱lOmin，充N2密封，置於85_1型磁力攪拌器中攪拌開始反應，轉速為250轉 /分鐘，反應溫度保持在45°C，反應Mi後加入0. 5g分子篩(孔徑小於2nm)，繼續反應1 後停止攪拌，離心沉澱除去分子篩，取上清液進行旋轉蒸發除去四氫呋喃，水洗3次後加入正己烷實施例4測定轉化產率和轉化率取ImL未分離的反應產物，離心去除催化劑和分子篩，旋轉蒸發溶劑，用100%甲醇準確定容至10mL，該溶液經0. 22 μ m有機濾膜過濾後用高效液相色譜(HPLC)測定溶液各組分濃度。HPLC條件如下Agilent Technologies 1200系列高效液相色譜液，色譜柱Grace Prevail Organic Acid5u 150mmX 4. 6mm，柱溫40°C，流動相甲醇 / 水 / 磷酸 (85/15/0. 1)，流速lmL/min，進樣量10 μ L，檢測波長:254nm0產率計算公式如下產率=C ester/ (C L-ascorbic acid+C ester),式中C ester為HPLC測定樣品中L_抗壞血酸棕櫚酸酯的濃度，CL-ascorbic acid為樣品中L-抗壞血酸的濃度。酯化反應效率轉化率=CL-ascorbic acid(反應後)/C L-ascorbic acid(反應前)X 100%。通過上述方法檢測計算，實施例2中，實例1合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯的產率和反應效率分別為87%和90%，實例2合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯的產率和反應效率分別為
588%和87%。而實施例3採用傳統化學法合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯的產率和轉化效率分別為68%和75%。
權利要求
1.一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯的方法，包括將L-抗壞血酸和棕櫚酸溶於有機溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，無氧條件下於50 60°C反應4 8小時，分離、純化製得L-抗壞血酸棕櫚酸酯； 所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法製備將經線性化處理的重組質粒轉入畢赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，將所得轉化子接種於BMMY培養基中，誘導培養72 144小時後離心收集菌體，菌體經衝洗、生物印跡和冷凍乾燥製得酵母展示脂肪酶；所述的重組質粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體pPIC9K中MFa 1信號肽下遊的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因組成。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，以每升有機溶劑計，L-抗壞血酸、棕櫚酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為15 35g、200 500g、50 100g。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的有機溶劑為四氫呋喃。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物印跡中採用的配體為油酸。
全文摘要
本發明公開了一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯的方法，包括將L-抗壞血酸和棕櫚酸溶於有機溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，無氧條件下於50～60℃反應4～8小時，分離、純化製得L-抗壞血酸棕櫚酸酯；將經線性化處理的重組質粒轉入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115，將所得轉化子接種於BMMY培養基中，誘導培養72～144小時後離心收集菌體，菌體經衝洗、生物印跡和冷凍乾燥製得酵母展示脂肪酶；本發明通過將脂肪酶展示在細胞外，利用該酶製劑催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯，不僅提高了轉化效率，而且縮短了反應時間，降低了生產成本。
文檔編號C12N15/63GK102212575SQ20111011043
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月28日 優先權日2011年4月28日
發明者何國慶, 周陳偉, 地裡熱巴, 徐娟, 林吉恆, 王睿之, 阮暉 申請人:浙江大學