Piv-5和piv-2的f蛋白的突變蛋白的製作方法

2023-05-09 16:56:16

專利名稱：Piv-5和piv-2的f蛋白的突變蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及副流感病毒(PIV)融合蛋白(F蛋白)的突變蛋白，副流感病毒目前被索引為 5 型 PIV (PIV-5 或 PIV5)和 2 型 PIV (PIV-2 或 PIV2)。本申請還涉及由其衍生的產物，如 核酸、載體、細胞； 抗體、適體、幹擾RNA類型的融合抑制劑； 骨髓瘤、雜交瘤； 肝細胞和祖細胞。本申請還涉及這些突變蛋白和由其衍生的產物在醫藥和生物技術應用的用途。
背景技術：
目前被索引為5型PIV (PIV-5或PIV5)的副流感病毒(PIV)，是副粘病毒科 (paramyxoviridae)腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)的包膜病毒。以前PIV-5被稱為SV5 (猿病毒幻，因為它最初是從原代猴細胞培養物分離的。然而，PIV-5的天然宿主看起來是狗， 其在狗中引起稱為犬舍咳的咳嗽。隨後，從收集自人類但是培養於動物細胞中的樣品獲得幾個PIV-5分離物。此外， 在人類中沒有症狀或疾病與PIV-5相關。因此，人類實際上是否是PIV-5的宿主的問題，仍然處於熱烈的爭論中。目前，無論如何，都認為Ρ ν-5病毒是動物病毒。目前被索引為2型PIV(PIV_2或PIV2)的副流感病毒(PIV)也是副粘病毒科腮腺
炎病毒屬的包膜病毒。目前，僅僅鑑定了人類的PIV-2分離物(hPIV-2)，因此，認為PIV-2是人類病毒。PIV-5和PIV-2病毒在核酸序列、蛋白序列、組織、結構和形態方面彼此非常相似。因為選自人副流感病毒，PIV-2與在人類中發現的PIV-5最密切。可以認為PIV-2是PIV-5的人類等同物，至少本發明人是這麼認為的。PIV-5或PIV-2感染導致稱為合胞體的多核結構形成，合胞體是由感染的宿主的細胞融合形成的。PIV-5和PIV-2病毒通過病毒包膜與細胞膜的融合進入宿主細胞。該融合涉及兩種病毒糖蛋白血細胞凝集素-神經醯胺酶附著蛋白(HN)和融合蛋白(F)0PIV-5和PIV-2的融合蛋白F以簡單前體(FO)的形式合成，並且採用糖基化的同型三聚體形式。PIV-5和PIV-2的融合蛋白F需要宿主的宿主弗林蛋白酶的蛋白水解切割， 以產生由通過二硫鍵連接的兩個亞基組成的「預激活」形式大羧基末端亞基Fl和小氨基末端亞基F2。亞基Fl由疏水融合肽(FP)以及具有捲曲螺旋型構象的兩個7肽重複結構域 (HR-1和HR-2)組成。在被HN激活後，融合蛋白經歷一系列構象變化，導致融合肽插入靶細胞膜中。接著，在使病毒包膜接近細胞膜的HR-I和HR-2結構域之間發生相互作用(Russellet al，2006)。已知這些結構域形成非常穩定的一束由三聚體捲曲螺旋結構組成的六螺旋， 在該六螺旋中，三個HR-I結構域與三個HR-2結構域在反平行方向上相連。這種構象代表了 F 蛋白的融合後形式(Baker et al, 1999, Sergel-Germano et al,2000, West et al, 2005)。PIV-5和PIV-2的融合蛋白F需要用於促進融合的來自相同病毒類型的HN蛋白 (Yao et al，1997)。然而，存在於F和HN之間的相互作用的確切本質，仍然沒有完全清楚。然而，幾項研究已經表明，PIV-5和PIV-2的某些毒株的不同之處在於，它們需要 HN觸發融合。作為實例，Ito et al，1997描述了〃 SV5〃(PIV-5)的兩株毒株，即W3A和WR，它們的F蛋白的差異僅在於三個胺基酸(殘基22、443和516)。W3A毒株的F蛋白能以自主方式誘導融合，即在缺少HN蛋白的情況下，而WR毒株的F蛋白不能如此。Ito et al，1997指出，WR毒株F蛋白的融合活性可通過以胺基酸脯氨酸取代該蛋白位置22的胺基酸再次建立。Ito et al，2000認為，W3A和WR毒株的F蛋白的位置132的胺基酸E和位置四0 的胺基酸A可能參與這些毒株的F蛋白成為自主HN蛋白的能力。Paterson et al，2000指出，W3A毒株F蛋白位置22的胺基酸脯氨酸的存在，以及 WR毒株F蛋白胺基酸443的存在能夠增加這些病毒毒株的融合能力。Russell et al，2003指出，用芳族胺基酸取代毒株W3A的F蛋白的殘基L447和 1449能夠增加該病毒毒株F蛋白的融合活性。Gardner and Dutch，2007 指出，野生型〃 SV5〃(PIV-5)病毒 F 蛋白的突變 I49A
應具有促融合作用。Gardner et al，2007指出，野生型〃 SV5" (PIV-幻病毒F蛋白的突變V402A應具有促融合作用。對於蛋白PIV-2，看起來不存在描述將所述類型的突變引入該病毒F蛋白的序列中以便試圖據此增加自主性和融合能力的現有技術文獻。此外，存在許多能融合的其他病毒蛋白，如流感蛋白HA1/HA2、棒狀病毒G蛋白或 HIV 的 gp41/gpl20 蛋白。有關這些不同病毒蛋白的融合性能力和自主性的現有知識仍然非常有限。無論如何，有關病毒融合蛋白的現有知識未能提供設想有效醫療和/或生物技術應用的充分技術知識。發明_既述本發明人認為，擁有可用的高融合性且在融合能力方面表現出實質自主性的融合蛋白能夠為若干醫療和生物技術情況提供了解決方案。本發明人因此從一系列其他病毒融合蛋白選擇性地選擇了 PIV-5和/或PIV-2的 F蛋白，所述其他病毒融合蛋白如來自流感的HA1/HA2蛋白、來自棒狀病毒的G蛋白或來自 HIV 的 gp41/gpl20 蛋白。然後構建它們，並產生在缺少HN蛋白的情況下能融合的突變的F蛋白。已證實，本發明的突變蛋白具有高融合能力和高自主性。它們不需要HN蛋白的存在來誘導細胞融合和合胞體形成。
本發明人還顯示，將不同於F蛋白在其天然狀態下所呈現的切割位點的切割位點特別是組織特異性切割位點弓I入這些突變蛋白中是可能的。本發明人還提出了本發明的突變蛋白和/或衍生於所述蛋白的產物或所述蛋白的後續產物的醫療(治療、預防、緩和還有診斷)和/或生物技術應用。具體而言，本發明人提出使用本發明的突變蛋白或編碼它們的核酸來體內或離體治療、預防或減輕疾病或功能障礙，如癌症(特別是轉移性癌，優選轉移性黑素瘤)或胎盤發育缺陷，對這些疾病或功能障礙而言，誘導或增加合胞體形成是期望的。本發明人還提出，用阻斷PIV-5和/或PIV-2的F蛋白的試劑，如抗體、重組樹突細胞、反義細胞、siRNAs、核酸適體，來體內或離體治療、預防或減輕疾病或功能障礙，如包膜病毒感染、過敏反應、自身免疫病或移植排斥，對這些疾病或功能障礙而言，抑制或阻斷合胞體形成是期望的。本發明人還提出了檢測合胞體形成過量或相反形成不足的診斷手段。本發明人還特別為篩選能減少合胞體形成的活性成分提出了不同的生物技術手段。本發明人還提出了包含本發明突變蛋白的癌細胞，特別是骨髓瘤。本發明人還提出了包含本發明突變蛋白的雜交瘤。本發明的癌細胞特別是骨髓瘤能與另一細胞特別是與 B淋巴細胞融合，而無需使用聚乙二醇(PEG)，也無需使用電穿孔，也無需使用任何其他融合誘導手段。本發明的癌細胞，特別是骨髓瘤，能自主融合。本發明的雜交瘤可以，通過融合(B淋巴細胞與黑素瘤的融合)來產生，不需要使用聚乙二醇(PEG)、也無需使用電穿孔、也無需使用任何其他融合誘導手段。本發明的雜交瘤實際上可以通過使用本發明的至少一種癌細胞特別是至少一種骨髓瘤產生。本發明人還提出了表達本發明突變蛋白的重組幹細胞或祖細胞，以及它們在產生肌纖維中的應用。本發明的其他方面將在下文「本發明的詳細描述」部分中描述。附圖
簡要說明所提交的本申請的這組附圖以彩色形式提交。其可以通過查閱在國際局的案卷而訪問ο圖IA :PIV-5的F蛋白的參考序列(SEQ ID NO 31 ；WR分離物的F蛋白的序列)和相應的CDS序歹Ij (SEQ ID NO 30 ；編碼SEQ ID NO 31的蛋白的核酸序列)。SEQ ID NO 31 序列中粗體和加下劃線的字符表示以下位置的胺基酸-22 (L)，-49(1),-132 (E，該分離物中預先存在的突變)，-147 (T)，-158(T)，-290 (A，該分離物中預先存在的突變)，-402 (V)，-443 (P，該分離物中理論上預先存在的突變)，-447 (L)，
-449 (I)以及-463 (A)。圖IB :PIV-2的F蛋白的參考序列(SEQ ID NO 33 ；Greer分離物的F蛋白的序列) 以及相應的CDS序列(SEQ ID NO 32 ；編碼SEQ ID NO 33的蛋白的核酸序列)。SEQ ID NO 33的序列中的粗體和加下劃線的字符表示以下位置的胺基酸-24(1),-53(1)，-133 (K)，-151 (T)，-162 (S)，-294(1),-406 (A)，-428 (S)，-439 (S)，-445 (I)，-474 (S)。圖 2A :PIV-5 的 F 蛋白(SEQ ID NO 31 的胺基酸 4-5 )與 PIV-2 的 F 蛋白(SEQ ID NO :33的胺基酸8-533)的比對這兩種蛋白間的蛋白同一性為47. 7%。來自該比對的共有序列稱為SEQ ID NO :34ο圖2Β :PIV-2的F蛋白中的胺基酸和突變，其對應於PIV-5的F蛋白的胺基酸和突變。圖3:圖示PIV-5的F蛋白的天然切割位點(SEQ ID NO :23)被組織特異性切割位點取代，在這種情況下，即轉移性腫瘤組織所特異性表達的酶即基質金屬蛋白酶9 (MMP-9) 的位點。MMP-9位點的共有位點SEQ ID NO :27的序列(PXXhyS/T位點，其中X =任何胺基酸，且Hy =任何疏水胺基酸，即選自F、M、V、L、I的任何胺基酸)。MMP-9位點的示例性序列:SEQ ID NO :28的序列、SEQ ID NO 29的序列。圖4 質粒pcDNA3. 1的結構，已經將編碼PIV-5的F蛋白的序列克隆到該質粒上。Amp 氨苄青黴素抗性基因pCMV 巨細胞病毒啟動子MCS:多克隆位點F PIV5 :PIV-5 的 F 蛋白BGHpolyA:牛生長激素 polyA (聚 A)。圖5A、5B、5C、5D 顯示本發明人在PIV-5的F蛋白中所產生的突變。圖6A 圖示在半定量融合試驗中所完成的顯微鏡觀察結果(本發明人所產生的突變體的大圖面)。圖6B 呈現半定量融合試驗後所獲得的融合得分的圖表(本發明人所產生的突變體的大圖面)。圖7A 說明在半定量融合試驗中所完成的顯微鏡觀察結果(選擇本發明人所產生的突變體)。圖7B 呈現半定量融合試驗後所獲得的融合得分的圖表(選擇本發明人所產生的突變體)。圖8A、8B、8C 半定量融合試驗的結果(選擇本發明人所產生的突變體)。圖9 圖示利用本發明的突變蛋白的免疫螢光而製備的共聚焦顯微鏡觀察結果， 本發明的突變蛋白具有除了 PIV-5蛋白的天然切割位點以外的切割位點(本發明的突變蛋白Fus8M和Fus8. 7M，其與本發明的突變蛋白Fus8和Fus8. 7的不同之處在於，SEQ ID NO 28的切割位點MMP-9取代了天然切割位點)。發明的詳細描述在本申請的範圍內，術語「蛋白」在其範圍內包括術語「糖蛋白」。對於實際上是糖蛋白的F和HN蛋白而言，情況尤其如此。PIV-5和PIV-2的F蛋白(非突變蛋白)PIV-5的F蛋白的序列呈現於圖IA(SEQ ID NO 31的蛋白序列；SEQ ID NO 30的編碼核酸序列)中。它是WR分離物的序列，WR分離物是猿分離物。這些序列是可從基因庫(GenBank)資料庫獲得的序列，登錄號為AB021962。WR分離物的樣品，是本發明人從ATCC接受的，並且用它構建和產生下文實施例所述的突變蛋白，然而，其不具有F蛋白位置443的胺基酸P (與根據從Genbank獲得的序列對其期望的相反)，而具有胺基酸S。WR分離物的F蛋白的該可選序列，因此等同於SEQ ID NO 31的序列，例外是位置443的胺基酸是S而不是P。出於簡潔的目的，該可選序列會在本文中表示為「在443處具有S的SEQ ID NO :31」。SEQ ID NO :31的序列和可選序列「在443處具有S的SEQ ID N0:31」，優選可選序列「在443處具有S的SEQ ID NO :31 」，在本專利申請中充當PIV-5的F蛋白的參考序列。然而，顯然存在除了 WR分離物以外的分離物，特別是 其他猿分離物，如W3A分離物； 來自其他非人類動物的分離物，如〇犬分離物，例如犬分離物0 1+、0 1_、!1221、785對、11 ；〇豬分離物，例如豬分離物SER ； 稱為「人類」分離物的分離物，其衍生於從人類採集但是已經培養於動物細胞中的樣品(參閱上文的介紹部分)，如MIL分離物、DEN分離物、LN分離物、MEL分離物以及在 WO 02077211描述為〃隱病毒〃的分離物。這些不同PIV-5分離物的F蛋白序列中的變化非常微小。這些變化的描述由Chatziandreou et al，2004給出，其內容，特別是該文章的表 3以及與表3有關的注釋，在此通過引用併入本申請。該文章的表3複製於此
權利要求
1.突變蛋白，其胺基酸序列包含通過以下方式衍生於PIV-5或PIV-2病毒的F蛋白序列的序列 通過〇胺基酸P取代在所述PIV-5F蛋白序列中位於位置22或在所述PIV-2F蛋白序列中位於位置M的的胺基酸；以及〇胺基酸E取代在所述PIV-5F蛋白序列中位於位置132或在所述PIV-2F蛋白序列中位於位置133的胺基酸；以及〇胺基酸A取代在所述PIV-5F蛋白序列中位於位置290或在所述PIV-2F蛋白序列中位於位置四4的胺基酸；以及〇胺基酸P取代在所述PIV-5F蛋白序列中位於位置449或在PIV-2F蛋白序列中位於位置439的胺基酸； 和任選地〇通過由另一酶促切割位點取代所述F蛋白的天然切割位點，和/或通過將除了所述 F蛋白的天然切割位點以外的酶促切割位點插入所述F蛋白；和/或〇通過使所述F蛋白的C末端部分缺失，所述C末端部分從所述蛋白C末端的最後胺基酸開始在N末端方向上延伸，但是延伸不超出所述F蛋白的HR2結構域。
2.如權利要求1所述的突變蛋白，其特徵在於所述PIV-5或PIV-2病毒的F蛋白的序列包含SEQ ID NO 34的序列。
3.如權利要求1或2所述的突變蛋白，其特徵在於所述F蛋白的序列是PIV-5的F蛋白。
4.如權利要求3所述的突變蛋白，其特徵在於所述F蛋白的序列由以下組成 SEQ ID NO 31的序列，或與SEQ ID NO 31的序列相同的可選序列，例外是位置433 的胺基酸在所述可選序列中為S(代替SEQ ID NO 31中的P)；或 所述SEQ ID NO 31的序列的變異序列或所述可選序列的變異序列，所述變異序列 〇大小與SEQ ID NO 31的序列相同，或大小比SEQ ID NO 31的序列大最多7個胺基酸，或大小比SEQ ID NO 31的序列小最多7個胺基酸；以及〇相對於所述SEQ ID NO :31的序列或所述可選序列具有超過95%、優選至少96%、更優選至少97%的序列同一性，所述同一性利用所述SEQ ID NO :31的序列長度或如果合適， 利用所述可選序列的序列長度來計算。
5.如權利要求4所述的突變蛋白，其特徵在於所述F蛋白由SEQID NO :35-46的序列之一組成。
6.如權利要求3-5中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於其胺基酸序列相對於所述 PIV-5F蛋白序列不包含其他突變。
7.如權利要求6所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F蛋白序列的序列是SEQ ID NO 65的序列。
8.如權利要求3-5中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列 至少一個選自以下的融合前突變 〇位置49的胺基酸被胺基酸A取代；〇位置402的胺基酸被胺基酸A取代； 〇位置443的胺基酸被胺基酸P取代； 〇位置447的胺基酸被胺基酸P取代； 和/或通過 至少一個選自以下的融合後突變 〇位置147的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置158的胺基酸被疏水胺基酸取代。
9.如權利要求3-5和8中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列 至少一個選自以下的融合前突變 〇位置49的胺基酸被胺基酸A取代； 〇位置402的胺基酸被胺基酸A取代； 和/或通過 至少一個選自以下的融合後突變 〇位置147的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置158的胺基酸被疏水胺基酸取代。
10.如權利要求8或9所述的突變蛋白，其特徵在於所述疏水胺基酸選自V、I、L，優選V。
11.如權利要求3-5和8-10中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F 蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列 至少一個選自以下的融合後突變 〇位置147的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置158的胺基酸被疏水胺基酸取代；和 至少一個其他融合後突變，即位置463的胺基酸被疏水胺基酸優選V、I或L更優選 V取代。
12.如權利要求3-5和8-11中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F 蛋白序列的序列是選自SEQ ID NO 67-79的序列的序列。
13.如權利要求3-5和8-12中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F 蛋白序列的序列還通過至少一個選自以下的融合後突變衍生於所述F蛋白序列〇位置147的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置158的胺基酸被疏水胺基酸取代。
14.如權利要求13所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F蛋白序列的序列是選自SEQ ID NO 68-79的序列的序列。
15.如權利要求3-5和8-11中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F 蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列 至少一個選自以下的融合前突變 〇位置49的胺基酸被胺基酸A取代； 〇位置402的胺基酸被胺基酸A取代； 和通過 至少一個選自以下的融合後突變 〇位置147的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置158的胺基酸被疏水胺基酸取代。
16.如權利要求15所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F蛋白序列的序列是選自SEQ ID NO :68、69、70的序列的序列。
17.如權利要求3-5和8-11中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F 蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列〇位置147的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置158的胺基酸被疏水胺基酸取代。
18.如權利要求17所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F蛋白序列的序列是選自SEQ ID NO 76,78的序列的序列。
19.如權利要求1或2所述的突變蛋白，其特徵在於所述F蛋白的序列是PIV-2F蛋白。
20.如權利要求19所述的突變蛋白，其特徵在於所述F蛋白的序列由以下組成 SEQ ID NO 33的序列；或 所述SEQ ID NO 33的序列的變異序列，所述變異序列〇大小與SEQ ID NO 33的序列相同，或大小比SEQ ID NO 33的序列大最多2個胺基酸，或大小比SEQ ID NO 33的序列小最多2個胺基酸；以及〇相對於所述SEQ ID NO 33的序列具有超過95%、優選至少96%、更優選至少97% 的序列同一性，所述同一性利用所述SEQ ID NO :33的序列長度來計算。
21.如權利要求19或20所述的突變蛋白，其中所述衍生於所述F蛋白序列的序列是選自SEQ ID NO =90-103的序列的序列。
22.如權利要求19或20所述的突變蛋白，其特徵在於其胺基酸序列相對於所述 PIV-2F蛋白序列不包含其他突變。
23.如權利要求19或20所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列 至少一個選自以下的融合前突變 〇位置53的胺基酸被胺基酸A取代； 〇位置406的胺基酸被胺基酸A取代； 〇位置428的胺基酸被胺基酸P取代； 〇位置445的胺基酸被胺基酸P取代； 和/或通過 至少一個選自以下的融合後突變 〇位置151的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置162的胺基酸被疏水胺基酸取代。
24.如權利要求19、20、23中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述F蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列 至少一個選自以下的融合前突變 〇位置53的胺基酸被胺基酸A取代； 〇位置406的胺基酸被胺基酸A取代；和/或通過 至少一個選自以下的融合後突變 〇位置151的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置162的胺基酸被疏水胺基酸取代。
25.如權利要求23或M所述的突變蛋白，其特徵在於所述疏水胺基酸選自V、I、L，優選V。
26.如權利要求19、20和23-25中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述 F蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列 至少一個選自以下的融合後突變 〇位置151的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置162的胺基酸被疏水胺基酸取代；和 至少一個其他融合後突變，即位置474的胺基酸被疏水胺基酸優選V、I或L更優選 V取代。
27.如權利要求19、20和2346中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述 F蛋白序列的序列還通過至少一個選自以下的融合後突變衍生於所述F蛋白序列〇位置151的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置162的胺基酸被疏水胺基酸取代。
28.如權利要求19、20和23-27中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述 F蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列 至少一個選自以下的融合前突變 〇位置53的胺基酸被胺基酸A取代； 〇位置406的胺基酸被胺基酸A取代； 和通過 至少一個選自以下的融合後突變 〇位置151的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置162的胺基酸被疏水胺基酸取代。
29.如權利要求19、20和23- 中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述衍生於所述 F蛋白序列的序列還通過以下方式衍生於所述F蛋白序列〇位置151的胺基酸被疏水胺基酸取代； 〇位置162的胺基酸被疏水胺基酸取代。
30.如權利要求1- 中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於其包含通過以下方式衍生於PIV-5或PIV-2病毒的F蛋白的序列的序列通過用另一酶促切割位點取代所述F蛋白的天然切割位點，和/或通過將除了所述F蛋白的天然切割位點以外的酶促切割位點插入所述F蛋白。
31.如權利要求30所述的突變蛋白，其特徵在於所述除了天然切割位點以外的切割位點是組織特異性切割位點。
32.如權利要求30或31所述的突變蛋白，其特徵在於所述除了天然切割位點以外的切割位點是一種腫瘤組織或多種腫瘤組織所特異性表達的酶的切割位點。
33.如權利要求30-32中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述除了天然切割位點以外的切割位點是一種轉移性組織或多種轉移性組織所特異性表達的酶的切割位點。
34.如權利要求30-33中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述除了天然切割位點以外的切割位點是金屬蛋白酶的切割位點。
35.如權利要求30-34中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述除了天然切割位點以外的切割位點是基質金屬蛋白酶9 (MMP-9)的切割位點。
36.如權利要求30-35中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述除了天然切割位點以外的切割位點包含序列PXXHyS/T(SEQ ID NO :27)，其中X =任何胺基酸，且其中Hy =選自F、M、V、L、I的任何胺基酸。
37.如權利要求30-36中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於所述除了天然切割位點以外的切割位點包含序列PRRIT (SEQ ID NO 28)和/或序列IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVV IGL(SEQ ID NO 29)。
38.如權利要求30-37中任一項所述的突變蛋白，其特徵在於其包含SEQID NO :88或 89的序列。
39.編碼權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白的核酸、DNA或RNA，或此類核酸的互補核酸。
40.轉染、轉導或轉化載體，包含至少一種權利要求39所述的核酸。
41.如權利要求40所述的載體，其特徵在於其是表達載體。
42.如權利要求41所述的表達載體，其特徵在於其是腺病毒載體。
43.如權利要求41或42所述的表達載體，其特徵在於其是包含調節所述核酸表達的元件的腺病毒載體，從而允許所述核酸在腫瘤細胞、優選在轉移性細胞、更優選在轉移性黑素瘤細胞中表達。
44.如權利要求41-43中任一項所述的表達載體，其特徵在於其是溶瘤腺病毒載體。
45.如權利要求40所述的載體，其特徵在於其是允許將所述至少一種核酸插入動物細胞、優選人類細胞、特別是人類腫瘤細胞、優選轉移性人類細胞、更優選轉移性黑素瘤細胞的基因組的載體。
46.細胞，其特徵在於其包含至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白，和/或至少一種權利要求39所述的核酸、DNA或RNA，和/或至少一種權利要求40-45中任一項所述的載體。
47.如權利要求46所述的細胞，其特徵在於其是人類細胞或非人類動物細胞。
48.如權利要求46或47所述的細胞，其特徵在於其是腫瘤細胞、優選轉移性細胞、更優選轉移性黑素瘤細胞。
49.如權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白，權利要求39所述的核酸、DNA或RNA， 權利要求40-45中任一項所述的載體，權利要求46-48中任一項所述的細胞，其用於治療和 /或預防和/或減輕疾病或瘤性狀況、優選轉移性腫瘤、優選轉移性黑素瘤。
50.如權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白，權利要求39所述的核酸、DNA或RNA， 權利要求40-45中任一項所述的載體，權利要求46-48中任一項所述的細胞，在治療和/或預防和/或減輕胎盤發育缺陷中的用途。
51.細胞融合抑制劑，其特徵在於其是 針對權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白的抗體，或此類抗體的Fab或F (ab』)2片段； 與至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白或與權利要求39所述的核酸、 DNA、RNA特異性結合的核酸適體或肽適體； 在表面表達至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白的重組免疫系統細胞，優選重組樹突細胞； 權利要求39所述的核酸的反義核酸； 包含雙鏈RNA的小幹擾RNA即siRNA，其含有能與權利要求39所述的核酸結合的 19-22個核苷酸。
52.如權利要求46所述的細胞，其是人類或非人類動物免疫系統的細胞，優選人類或非人類動物樹突細胞，所述細胞在其表面表達至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白。
53.如權利要求51所述的細胞融合抑制劑，其用於治療和/或預防和/或減輕與細胞融合性過度有關的疾病或狀況，所述疾病或狀況是包膜病毒感染(優選HIV感染和/或流感感染和/或副流感感染和/或棒狀病毒感染)、過敏反應、自身免疫病或移植排斥。
54.權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白，其在治療和/或預防和/或減輕與細胞融合性過度有關的疾病或狀況中用作免疫原性試劑，所述疾病或狀況是包膜病毒感染(優選HIV感染和/或流感感染和/或副流感感染和/或棒狀病毒感染)、過敏反應、自身免疫病或移植排斥。
55.用於治療和/或預防和/或減輕與細胞融合性過度有關的疾病或狀況的疫苗，所述疾病或狀況是包膜病毒感染(優選HIV感染和/或流感感染和/或副流感感染和/或棒狀病毒感染)、過敏反應、自身免疫病或移植排斥，其特徵在於，所述疫苗包含至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白。
56.診斷或預後與合胞體形成不足或相反合胞體形成過量有關的疾病的體外方法，其特徵在於所述方法包括檢測生物樣品中至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白或至少一種權利要求39所述的核酸。
57.篩選能夠減少或阻斷合胞體形成的化合物的體外方法，其特徵在於所述方法包括使候選化合物與至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白接觸，以便確定所述候選化合物是否減少或阻斷所述細胞的融合。
58.腫瘤細胞、更特別是骨髓瘤細胞，其包含至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白，優選在其表面包含至少一種此類突變蛋白，和/或包含至少一種權利要求39所述的核酸，和/或包含至少一種權利要求40、41、45中任一項所述的載體。
59.如權利要求58所述的腫瘤細胞，更特別是骨髓瘤細胞，其用於產生雜交瘤。
60.雜交瘤，其特徵在於所述雜交瘤包含至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白，和/或至少一種權利要求39所述的核酸，和/或至少一種權利要求41、45中任一項所述的載體。
61.幹細胞或祖細胞，其具有分化為肌細胞的能力，其特徵在於所述幹細胞或祖細胞包含至少一種權利要求1-38中任一項所述的突變蛋白，優選在其表面包含至少一種此類突變蛋白，和/或包含至少一種權利要求39所述的核酸，和/或包含至少一種權利要求40、 41、45中任一項所述的載體，所述細胞不是人類胚胎細胞。
62.如權利要求61所述的幹細胞或祖細胞，其用作肌纖維幹細胞或祖細胞。
全文摘要
本申請涉及目前被索引為5型PIV(PIV-5或PIV5)和2型PIV(PIV-2或PIV2)的副流感病毒(PIV)的融合蛋白(F蛋白)的突變蛋白。本申請涉及由其衍生的產物，如核酸，載體，細胞，抗體、適體、幹擾RNA類型的融合抑制劑；骨髓瘤、雜交瘤；幹細胞和祖細胞。本申請還涉及突變蛋白和由其衍生的產物在醫療和生物技術應用中的用途。
文檔編號C12Q1/68GK102282267SQ200980154646
公開日2011年12月14日 申請日期2009年11月17日 優先權日2008年11月21日
發明者奧利維耶·特瑞耶, 弗朗索瓦·艾多德·朱利安·杜魯特, 曼紐爾·梅爾基奧·讓-皮埃爾·羅薩卡拉特拉瓦 申請人:克洛德·貝納爾-裡昂第一大學, 國家科研中心, 裡昂奧斯皮思民用公司