一種具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法
2023-05-09 11:25:41 2
專利名稱：一種具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法
技術領域：
本發明涉及化工、食品、環境、生物等行業的拉曼光譜儀器分析和檢測領域，特別是一種具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法。
背景技術：
拉曼光譜屬於分子振動光譜，反映分子的特徵結構，可以用於包括固體、液體、氣體等的樣品的分析和檢測。然而拉曼散射效應是一個非常弱的過程(一般僅為入射光強的10-1°)，使其應用受到很大的局限。Fleischman等人於1974年首次獲得吸附在粗糙的銀電極表面上的單分子層吡啶分子的高質量拉曼光譜，從而發現了表面增強拉曼光譜效應。近三十多年來，利用了金或者銀材料的納米增強技術的表面增強拉曼光譜(SurfaceEnhanced Raman Spectroscopy, SERS)技術的發明將拉曼光譜檢測靈敏度提高了百萬倍，使傳統的拉曼光譜技術具備了超高的靈敏度，因而其應用領域得到了一定的拓展。作為一 種分析檢測技術，SERS具有很多優點，例如1)拉曼光譜的譜峰窄、具有高度的分子特徵性；2)很少受光漂白的影響；3)檢測靈敏度高。因此，儘管目前SERS增強機理的解釋尚未達成完全共識，SERS技術在細胞、生物大分子的組成鑑定與結構表徵、生物分子之間的相互作用、以及生物組織的體外和活體檢測中已有諸多應用。SERS技術的核心就是拉曼增強基底。拉曼增強基底目前主要有表面粗糙的金、銀、銅等少數金屬電極、各類金屬納米粒子組成的溶膠、金屬沉積島膜等。其中，由金、銀納米粒子組成的溶膠型拉曼增強試劑因其製備相對較簡單、增強效果好、以及適用於細胞內生物分子的檢測等優點而廣泛用於生物分析領域中SERS檢測的基底。但是SERS技術所存在的缺點如其優點一樣突出。由於SERS信號的獲得依賴於納米級粗糙的金屬基底(如納米銀或金膠體)，因此SERS光譜的絕對強度不但取決於待測物質的濃度，而且與SERS基底的物理性質(如納米銀或金膠體的粒徑大小、形狀以及聚集度等)以及雷射光源功率和聚焦位置有關。而作為SERS基底主要組成的銀(金)納米粒子的可重現性和穩定性均較差，嚴重影響SERS信號的可靠性和重現性，導致SERS定量分析結果的準確度遠遠達不到實際分析的要求。雖然已有一些將SERS技術用於定量分析的嘗試，但目前SERS技術僅屬於定性或半定量分析技術，尚未成為一項成熟的定量分析檢測技術。SERS技術的這一缺陷大大削弱了其高檢測靈敏度所帶來的技術優勢，從而嚴重限制了SERS技術的推廣應用和相關儀器的市場開發。因此在現階段，如何提高SERS定量分析結果的精確度及其成熟的應用技術，將成為SERS技術開發與應用的核心內容。在文獻中，目前主要採用以下三種途徑來提高SERS定量分析結果的準確度1)提高SERS基底的製作技術和工藝，儘量減小SERS基底之間的差異。國際上在提高SERS定量分析結果精確度的工作主要集中在這一方面。然而製作各項物理性質指標高度一致、且性質穩定的SERS基底(特別是銀或金納米溶膠)是一項十分艱巨的任務。目前尚沒有一項製作技術能保證製備出的SERS基底物理性質完全一致。因此依靠製作完全一致的SERS基底來達到實現SERS準確定量分析的目的至少在目前是不太現實的。2)採用內標法結合微流控技術可在一定程度上消除SERS基底物理性質以及雷射光源功率和聚焦位置的不同對SERS定量分析結果精確度的影響。採用內標法時，要求內標必須具有與待測樣本中所有組分的SERS光譜峰均不重疊的峰，而且所測得的SERS光譜中不能有顯著的背景幹擾。顯然，採用SERS技術對不同的體系進行定量分析時，需要採用不同的內標。對於複雜的體系(如細胞內蛋白質的定量分析)來說，通常很難找到合適的內標。這在很大程度上限制了內標法的廣泛應用。3)另外，採用多元數據分析方法如偏最小二乘回歸法(Partial LeastSquares, PLS)等取代傳統的建立在峰高或峰面積基礎上的單變量數據分析法，在一定程度上也能提高SERS定量分析結果的精確度。但是由於PLS等模型並沒有明確地闡明SERS基底物理性質變化與待測物質SERS信號強度變化之間的定量關係，因而不能有效地消除SERS基底之間的差異對SERS定量分析結果的影響，所獲得的定量結果通常也達不到實際分析的要求。如上所述，現有用於提高SERS定量分析結果精確度的方法和途徑有著各種局限性和不足，致使SERS技術很少用於複雜體系的準確定量分析。既然目前不太可能獲得各項 物理性質指標高度一致且性質穩定的SERS基底，那麼為了實現應用SERS技術對複雜體系進行準確的定量分析，必須發展新型的方法來將待測物質濃度變化所引起SERS信號貢獻與SERS基底物理性質變化所帶來的SERS信號貢獻分離開來，從而消除SERS基底物理性質變化對SERS定量分析結果的影響，實現複雜體系的SERS準確定量分析。迄今為止國內外尚未出現能有效解決這一問題的理論和方法。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術不足，提供一種具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法，將待測物質濃度變化所引起SERS信號貢獻與SERS基底物理性質變化對樣本SERS信號的乘子效應影響進行有效分離，以解決複雜化學生物體系的SERS光譜準確定量分析問題。為解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案是一種具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(I)在納米粒子上標記適量的內標物質，得到具有準確定量功能的表面增強拉曼光譜基底，其中內標物質在納米粒子上的覆蓋率小於100% ；(2)採用上述定量表面增強拉曼光譜基底對校正樣本集中待測物質進行表面增強拉曼光譜分析檢測，獲得所有校正樣本集的表面增強拉曼光譜數據，並建立新型表面增強拉曼光譜定量分析模型，即乘子效應模型；(3)利用校正樣本集表面增強拉曼光譜數據Xeal和校正樣本集中待測化學組分的濃度矢量c來估計校正樣本集的表面增強拉曼光譜信號中由於表面增強拉曼光譜基底物理性質以及雷射光源功率和聚焦位置的變化而導致的乘子效應矢量b ；(4)測得未知待測樣本的表面增強拉曼光譜信號Xun，然後採用『雙校正』策略消除未知待測樣本中表面增強拉曼光譜信號的乘子效應，並實現對未知待測樣本中待測物質濃度的準確預測。(I)樣本SERS光譜信號的新型分解模型當使用銀(金)納米溶膠作為SERS基底對待測物質進行SERS定量分析時，銀(金)納米粒子的粒徑大小、形狀、以及聚集度等物理性質的變化均對待測物質的SERS信號強度有十分顯著的影響(見圖2)。另外，雷射光源的功率和聚焦位置的變化也會顯著地影響待測物質的SERS信號強度。而在使用SERS技術對待測物質進行定量分析時，很難(甚至是不可能)保證每次檢測所用的SERS基底的物理性質和雷射光源的聚焦位置完全一樣。因此所獲得的SERS光譜信號不但包含了待測物質濃度變化的SERS信號強度貢獻，而且還包含有SERS基底物理性質和雷射光源聚焦位置變化的SERS信號強度貢獻Ik(V)=Ck rchem(v) gphys,k ginstrum，k I0，k+dk(v)(I)其中，Ik(V)代表第k個樣本(或第k次測量)在拉曼位移V處的SERS信號強度；Ck代表第k個樣本中待測物質的濃度^ctol(V)代表第j個化學組分在單位濃度下的表面增強拉曼光譜信號強度，取決於待測物質分子在拉曼位移V處的散射性質；gphys，k代表SERS基底物理性質變化對第k個樣本SERS信號強度的乘子效應影響部分；ginstram，k代表光譜儀器的整體響應特性以及雷射光源聚焦位置對第k個樣本SERS信號的乘子效應影響；1。，，為第 k次測量時入射雷射強度；dk(v)代表在拉曼位移V處的背景幹擾以及SERS基底物理性質變化對第k個樣本SERS信號的非乘子效應影響部分。式⑴中只有在分析測量中保持相對不變，其他各項則隨著SERS基底物理性質和雷射光源聚焦位置和功率的變化而變化。當只有一個物質(即待測物質)在SERS基底表面有增強效應、產生SERS信號時，顯然無法將gphys，k、gins_，k和Icu的變化對樣本SERS信號總強度的貢獻與待測物質濃度Ck的變化所帶來的SERS信號強度貢獻區分開來。這正是SERS技術難以用於準確定量分析的根本原因。目前，人們主要採用內標法來提高SERS定量分析結果的精確度。內標法的原理很簡單首先選擇具有與待測物質SERS光譜峰不重疊的光譜峰的物質做內標，將其加入待測溶液或修飾在SERS基底上，然後將待測物質的SERS光譜峰的峰高(或峰面積)除以內標所獨有光譜峰的峰高(或峰面積)來消除gphys，k、gins_，k和Icu的變化對SERS定量分析結果的影響。顯然，採用內標法對不同的待測物質進行SERS定量分析時，通常需選用不同的內標，以滿足內標具有與待測物質SERS光譜峰不重疊的光譜峰這一嚴苛要求；此外，普通內標法的使用還要求樣本SERS信號中不存在顯著的背景幹擾。在很多情況下，要找到一個合適的內標是一件很不容易的事。因此普通內標法難以作為一個普適性的SERS定量分析方法而加以推廣。(2)新型SERS光譜定量分析模型設現有K個校正樣本，這些校正樣本中有J(J ^ 2)個化學組分能在SERS基底表面上產生SERS信號(任意假定校正樣本中第I個組分是人工加入到樣本中的內標組分；在所有樣本中，該組分的濃度是已知的)；且SERS基底物理性質以及雷射光源聚焦位置的變化對各個化學組分SERS信號的乘子效應基本相同，則第k個樣本在拉曼位移V處的SERS光譜強度Ik(V)可分解為
J
h(v) = K4 ■ Vchemx(V) + ZcKj Tchem j(V)} gphys—k ■ g,咖Im_k IoJ( +dk(v)( 2 )
/=2其中，Clu代表第k個樣本中第j個化學組分的濃度Jctenu(V)代表第j個化學組分分子在拉曼位移V處的散射性質。設現已獲得K個校正樣本的SERS光譜。假定在所考察的相對較窄的拉曼位移範圍內(V i vn)，gphys，k和ginstram，k均不隨拉曼位移V變化而變化，貝1J第k個校正樣本在拉曼位移V I Vn範圍內的拉曼光譜Xk=IiIk(V1), . . .，Ik(Vn)]可表
示為
權利要求
1.一種具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟 (1)在納米粒子上標記適量的內標物質，得到具有準確定量功能的表面增強拉曼光譜基底，其中內標物質在納米粒子上的覆蓋率小於100% ； (2)採用上述定量表面增強拉曼光譜基底對校正樣本集中待測物質進行表面增強拉曼光譜分析檢測，獲得所有校正樣本集的表面增強拉曼光譜數據，並建立新型表面增強拉曼光譜定量分析模型，即乘子效應模型； (3)利用校正樣本集表面增強拉曼光譜數據Xeal和校正樣本集中待測化學組分的濃度矢量c來估計校正樣本集的表面增強拉曼光譜信號中由於表面增強拉曼光譜基底物理性質以及雷射光源功率和聚焦位置的變化而導致的乘子效應矢量b ； (4)測得未知待測樣本的表面增強拉曼光譜信號Xun，然後採用『雙校正』策略消除未知待測樣本中表面增強拉曼光譜信號的乘子效應，並實現對未知待測樣本中待測物質濃度的準確預測。
2.根據權利要求I所述的具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法，其特徵在於，所述步驟(I)中，納米粒子為銀或者金納米粒子；內標物質為對甲苯硫酚。
3.根據權利要求I所述的具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，乘子效應模型為 其中xk代表第k個樣本的表面增強拉曼光譜；ctl代表第k個樣本中內標組分的濃度；Ctj代表第k個樣本中第j個化學組分的濃度代表第j個化學組分在單位濃度下的表面增強拉曼光譜信號強度，取決於第j個化學組分分子的散射性質；bk代表表面增強拉曼光譜基底物理性質、光譜儀器的整體響應特性以及雷射光源功率和聚焦位置的變化對第k個樣本表面增強拉曼光譜信號強度的乘子效應影響部分；dk代表背景幹擾以及表面增強拉曼光譜基底物理性質變化對第k個樣本表面增強拉曼光譜信號的非乘子效應影響部分。
4.根據權利要求I所述的具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法，其特徵在於，所述步驟(3)中，估計乘子效應矢量b的過程如下 .1)對校正樣本集的表面增強拉曼光譜數據Xm1進行奇異值分解即 Xcal=USVT，其中U、S、V為對Xcal進行奇異值分解後得到的三個矩陣，上標『T』代表矩陣轉置操作;定義Uj為由U的前J列組成的矩陣，其中J為校正樣本中能夠在表面增強拉曼光譜基底表面上產生表面增強拉曼光譜信號的化學組分數； .2)校正樣本中表面增強拉曼光譜信號的乘子效應矢量b通過求解如下二次規劃問題獲得其中…^彳為平衡上式兩部分的權重參數，。,!^〃;... ； Ck； ! ； . . . ；CK；1]為內標組分在校正樣本中的濃度矢量，Cj=[c1；J；. . . ；Ck；J；. . . ；CK；J]為目標化學組分在校正樣本中的濃度矢量，S. t.表示約束條件。
5.根據權利要求I所述的具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法，其特徵在於，所述步驟(4)中，採用『雙校正』策略消除未知待測樣本中表面增強拉曼光譜信號的乘子效應的步驟如下 1)在校正樣本集的表面增強拉曼光譜數據Xeal與(Iiag(ID)C1、以及Xeal與diag(b)Cj之間建立雙校正模型，即模型I;模型II :diag(b)Cj=a2l+U2 ;其中，diag(b)為一對角矩陣，其對角元素為矢量b的相應元素；Ci1, ^1, a 2, P2為校正模型參數； 2)測得未知待測樣本的表面增強拉曼光譜數據Xun，通過模型II和模型I的預測值的比值乘以未知待測樣本中內標化學組分的濃度Cmu求出未知待測樣本中待測化學組分的a, + XimB全文摘要
本發明公開了一種具有普適性的表面增強拉曼光譜定量分析方法，其主要內容包括1)通過在SERS基底上標記適量的巰基化合物製備出具有準確定量功能的SERS基底；2)利用定量SERS基底對待測物質進行SERS分析檢測，並建立新型SERS光譜定量分析模型，即乘子效應模型；3)採用獨特的SERS定量分析新策略，即先將校正樣本中SERS光譜信號的乘子效應估計出來，待測樣本中SERS光譜信號的乘子效應則通過『雙校正』策略予以消除，從而實現對待測樣本中待測物質濃度的準確預測。本發明很好地解決了複雜化學生物體系的SERS光譜準確定量分析問題。
文檔編號G01N21/65GK102735677SQ20121024363
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月13日 優先權日2012年7月13日
發明者俞汝勤, 金競文, 陳增萍 申請人:湖南大學