洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(fps)基因真核表達載體的構建及轉化的製作方法

2023-05-09 14:52:46 1

專利名稱：洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(fps)基因真核表達載體的構建及轉化的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說是一種洋甘菊法尼基焦磷酸合酶基因克隆及真核表達與應用。
背景技術：
洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)為菊科母菊屬的一年生草本植物，全草芳香，含有芳香性揮髮油。洋甘菊具有消炎、抑制真菌、解痙[1_3]、改善肺癌病人症狀等作用。洋甘菊原產歐洲，本世紀初引種我國，現北京，上海、江蘇、湖南等地少有栽培。洋甘菊含有多種化學成分揮髮油、黃酮苷類、愈創奧內醋類、香豆精素、多糖類、有機酸等成分。洋甘菊揮髮油是花序中最主要的有效成分，其揮髮油由於獨特的香氣而廣泛用於食品、飲料、菸草、日化、醫藥等領域中，是一種極具開發價值的藥用植物和香料植物。洋甘菊花中精油含量在
0.2% 0.8%，最高可達1.9%。洋甘菊揮髮油呈暗藍色，芳香，久置或在日光照射下不久既可變成綠色，直至呈褐色。作為一種很有經濟價值的植物，在我國尚未得到充分的開發及利用。母菊奧(I，4- 二甲基-7-乙基奧)屬於倍半萜類物質，是母菊揮髮油中最有價值的成分之一，歐洲各國常根據它在揮髮油中的含量，作為評定藥材質量的標準。因產地、生長條件的差異及化學變種的存在，各地洋甘菊揮髮油中的藍香油奧的含量往往變化很大，據歐洲某些國家的資料，藍香油奧在揮髮油中的含量可在0 18. 8%之間。母菊奧在花盛開時的含量最高。母菊奧及其合成衍生物愈創奧均有消炎作用。愈創奧對大鼠的右旋糖配性浮腫有顯著抑制作用對透明質酸酶、甲醛、組織胺性浮腫僅有中等程度的抑制。為了更好地開發利用我國引種的洋甘菊資源，楊彥松等對新疆洋甘菊頭狀花序中的黃酮類化學成分進行了研究，從其95%乙醇提取物中分離得到2個黃酮類化合物。目前，雖然國內外很多文章報導了洋甘菊揮髮油成分分析，及洋甘菊揮髮油抗炎，抗腫瘤及對小鼠傷口癒合的促進作用等。但尚未有洋甘菊揮髮油中控制母菊奧代謝途徑有關酶類及基因的研究。母菊奧的代謝途徑為異戊二烯生物合成途徑，此過程有三個比較重要的限速酶，分別是HMG-CoA還原酶(HMGR)，法尼基焦磷酸合酶(FPS)和倍半萜合酶。法尼基焦磷酸合酶(FPS)是控制母菊奧合成的關鍵酶，利用基因工程技術克隆FPS基因，藉助根癌農桿菌侵染洋甘菊的愈傷組織，可提高母菊奧產量，對醫藥行業貢獻極大。

發明內容
本發明的目的是提供一種洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因真核表達載體的構建及轉化方法。本發明採用如下技術方案一種洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因真核表達載體的構建及轉化方法，具體按如下步驟進行
(I)洋甘菊FPS RNA的提取從洋甘菊花瓣中提取RNA，保存在_70°C冰箱中備用；(2)洋甘菊FPS基因RT-PCR擴增根據洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全長序列設計引物上遊引物5』(BamHI) CG GGATCC ATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3』下遊引物5，(SacI)CGAGCTC CTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3』
其中GGATCC與GAGCTC分別為BamHI和SacI的酶切位點；以洋甘菊總RNA為模板，反轉錄為cDNA ;然後以反轉錄的單鏈cDNA為模板,採用TransStart Taq DNA Polymerase進行PCR擴增；用PCR純化回收試劑盒回收目的片段，_20°C保存；(3) PCR擴增產物的陽性克隆和鑑定克隆載體pEASY_T4Zero Cloning vector連接4. 5iUPCR產物+0. 5iUT載體，25°C連接13分鐘；轉化取50 ill DH5a感受態加入5 U I上述連接產物，冰上放置20_30min. 42°C熱激30s，立即放在冰上2-3min，加入400 U I不加AMP的液體LB培養基；37°C，200轉孵育培養Ih ;取IOOu I培養液均勻塗布於AMP, IPTG, X-gal的平板上；37°C倒置培養12_16h ;挑白色單菌落於Iml含AMP的LB培養基中，37°C振蕩培養5_6h，採用M13引物進行菌液PCR鑑定，以降低假陽性的幹擾；篩選陽性重組克隆進行DNA測序，用DNAMAN序列分析軟體對測序結果進行分析；(4)質粒提取按照質粒提取試劑盒的步驟分別提取克隆載體T和表達載體PBI121 ；(5)雙酶切使用BamHI和SacI兩種限制性內切酶對T質粒和PBI 121質粒進行切割，20 iU體系37°C切3小時，然後加IOXBufTer 2ml終止反應，跑膠觀察質粒是否被切開；切開後，切膠回收T質粒和PBI121質粒中實驗所需要的片段；雙酶切體系lul, SacI Iul,IOx K Buffer I U I,質粒8 U 1，滅菌水定容至20 U I ;(6)切膠回收針對雙酶切後的克隆載體T和表達載體PBI121，採用切膠回收試劑盒根據實驗所需進行回收基因片段；(7)重組質粒pBI121/FPS的構建T4連接酶連接體系T4連接酶I yl，T4Buffer lul,表達載體I. 5 iU，目的片段6. 5 ill ;在PCR儀中16°C連接16h ;取上述連接產物5 U I加入50 的DH5a的感受態細胞中進行轉化；搖菌I. 5h，塗板，37°C倒置培養16h ;挑單菌落搖菌，PCR鑑定和酶切驗證重組子。(8)重組子導入感受態農桿菌取_70°C保存的EHA105農桿菌感受態細胞置於冰上融化，分別向200 感受態細胞中加入8 ii I表達載體質粒,混勻；冰浴30min,轉入液氮中速凍lmin,37°C溫育5min,迅速放置冰上2min ;然後加入800iilLB液體培養基，28°C，200rpm/min振蕩培養5h ;取300 u I培養液均勻塗布於含80ii g/mlKan的平板上，待菌液被吸收後倒置培養皿；28°C暗培養1-2天，挑取單菌落，280C，200rpm/min振蕩培養；取上述轉化菌液用PCR法進行檢測。
法尼基焦磷酸合酶(FPS)是控制母菊奧合成的關鍵酶，本發明利用基因工程技術克隆FPS基因，藉助根癌農桿菌侵染洋甘菊的愈傷組織，可提高母菊奧產量，對醫藥行業貢獻極大。以下結合附圖通過具體實施方式
對本發明技術方案做進一步說明。


圖I是洋甘菊總RNA電泳圖。圖2是洋甘菊FPS基因ORF框的PCR結果。圖2中M為DNA分子量標準I為PCR產物。圖3是切膠純化回收前後的目的DNA圖譜。
圖3中M為DNA分子量標準I為膠回收產物。圖4是藍白斑篩選照片。圖5是M13引物菌液PCR。圖5中M是.DNA分子量標準I是菌液PCR產物。圖6為提取的T質載體電泳圖譜。圖6中M為DNA分子量標準；I為提取的T質粒.圖7為提取的表達載體PBI121電泳圖譜。圖7中M為DNA分子量標準；1為提取的表達載體PBI121。圖8是雙酶切電泳圖。圖8中M是DNA分子量標準，I是雙酶切的T質粒，2是未酶切的T質粒，3是雙酶切的PBI121質粒，4.是未酶切的PBI121質粒。圖9是PBI121/FPS的PCR鑑定電泳圖。圖9中M是DNA分子量標準，I是菌液PCR產物。圖10是轉化到根癌農桿菌EHA105的PBI121-FPS質粒菌液PCR鑑定電泳圖。圖10中M是DNA分子量標準I是菌液PCR產物。
具體實施例方式I.材料與方法I. I實驗材料I. I. I植物材料洋甘菊花(採自安徽農業大學農萃園)、雲煙85菸草無菌苗(安徽農業大學生命科學學院組織培養室提供)。I. I. 2菌株和質粒大腸桿菌DH5a感受態細胞購於TAKARA公司，農桿菌EHA105，PBI121載體是安徽農業大學生命科學院江海洋老師惠贈，pEASY-T4 Zero Cloning Vector和Transl-Tl感受態細胞均購自北京全式金生物技術有限公司。I. I. 3主要生物學試劑限制性內切酶SacI、BamHI，T4DNA連接酶，rtaq均購於TAKARA公司，TransStart Taq DNA Polymerase購自北京全式金生物技術有限公司，RNAisoplus, DNA分子量標準，DNA膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒購於TAKARA公司，引物合成及DNA序列測定由英駿生物技術有限公司完成，其他試劑均為國產分析純。I. 2試驗方法
I. 2. IRNA 的提取液氮研磨0. 2g洋甘菊花瓣至粉末狀,2ml RNAiso plus,覆蓋樣品，室溫靜置15min。至樣品完全融化，再用研杵研磨至裂解液呈透明狀。將勻漿轉移至離心管，室溫靜置5min。12000rpm，4°C，15min，吸取上清。加200ul氯仿，劇烈震蕩15s，待溶液充分乳化。12000rpm，4°C，15min，吸取上層水相。加600ul異丙醇，上下顛倒混勻，15_30°C下靜置IOmin. 12000rpm, 4°C, IOmin,去上清。加 lml75% 乙醇，12000rpm, 4°C, 5min,去乙醇。室溫乾燥2-5min，加入20ulDEPC水。將提取的RNA保存在_70°C冰箱中備用。I. 2. 2洋甘菊中FPS基因RT-PCR擴增根據洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全長序列設計出引物上遊引物5』(BamHI) CG GGATCC ATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3』下遊引物5，(SacI)CGAGCTC CTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3，其中GGATCC與GAGCTC分別為BamHI和SacI的酶切位點。以洋甘菊反轉錄的單鏈cDNA為模板，設定一定梯度的引物退火溫度，採用TransStart Taq DNAPolymerase 進行 PCR 擴增。TransStart Taq DNA Polymerase 延伸速度為l-2kb/min，擴增產物3』端帶「A」鹼基，可直接用於TA載體克隆。反應體系25iU反
應體系
權利要求
1.一種洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因真核表達載體的構建及轉化方法，具體按如下步驟進行 (1)洋甘菊FPSRNA的提取 從洋甘菊花瓣中提取RNA，保存在_70°C冰箱中備用； (2)洋甘菊FPS基因RT-PCR擴增 根據洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全長序列設計引物 上遊引物5』 (BamHI) CG GGATCC ATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3』 下遊引物5』(SacI)C GAGCTC CTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3』 其中GGATCC與GAGCTC分別為BamHI和SacI的酶切位點；以洋甘菊總RNA為模板，反轉錄為cDNA ;然後以反轉錄的單鏈cDNA為模板；採用TransStart Taq DNA Polymerase進行PCR擴增；用PCR純化回收試劑盒回收目的片段，_20°C保存； (3)PCR擴增產物的陽性克隆和鑑定 克隆載體pEASY_T4 Zero Cloning vector 連接4. 5ulPCR產物+0. 5ulT載體，25°C連接13分鐘； 轉化取50 μ I DH5a感受態加入5μ I上述連接產物，冰上放置20_30min. 42°C熱激.30s，立即放在冰上2-3min，加入400 μ I不加AMP的液體LB培養基；37°C，200轉孵育培養Ih ;取100 μ I培養液均勻塗布於AMP, IPTG, Χ-gal的平板上；37°C倒置培養12_16h ;挑白色單菌落於Iml含AMP的LB培養基中，37°C振蕩培養5_6h，採用M13引物進行菌液PCR鑑定，以降低假陽性的幹擾；篩選陽性重組克隆進行DNA測序，用DNAMAN序列分析軟體對測序結果進行分析； (4)質粒提取 按照質粒提取試劑盒的步驟分別提取克隆載體T和表達載體PBI121 ； (5)雙酶切 使用BamHI和SacI兩種限制性內切酶對T質粒和PBI121質粒進行切割，20ul體系.37°C切3小時，然後加IOXBufTer 2ml終止反應，跑膠觀察質粒是否被切開；切開後，切膠回收T質粒和PBI121質粒中實驗所需要的片段；雙酶切體系=BamHI I μ 1，SacIl μ I, IOx KBuffer I μ I,質粒8 μ I,滅菌水定容至20 μ I ; (6)切膠回收 針對雙酶切後的克隆載體T和表達載體ΡΒΙ121，採用切膠回收試劑盒根據實驗所需進行回收基因片段； (7)重組質粒pBI121/FPS的構建 Τ4連接酶連接體系Τ4連接酶1μ 1，T4Buffer I μ 1，表達載體I. 5 μ 1，目的片段.6.5 μ I ;在PCR儀中16°C連接16h ;取上述連接產物5 μ I加入50 μ I的DH5a的感受態細胞中進行轉化；搖菌I. 5h，塗板，37°C倒置培養16h ;挑單菌落搖菌，PCR鑑定和酶切驗證重組子。
(8)重組子導入感受態農桿菌 取_70°C保存的EHA105農桿菌感受態細胞置於冰上融化，分別向200 μ I感受態細胞中加入8μ I表達載體質粒,混勻；冰浴30min,轉入液氮中速凍lmin,37°C溫育5min,迅速放置冰上2min ;然後加入800 μ ILB液體培養基，28°C，200rpm/min振蕩培養5h ;取300ul培養液均勻 塗布於含80 μ g/mlKan的平板上，待菌液被吸收後倒置培養皿；28°C暗培養1_2天，挑取單菌落，280C，200rpm/min振蕩培養；取上述轉化菌液用PCR法進行檢測。
全文摘要
本發明公開了一種洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因真核表達載體的構建及轉化方法，從洋甘菊花瓣中提取RNA，以洋甘菊總RNA為模板，反轉錄為cDNA；然後以cDNA為模板；進行PCR擴增；得到目的片段，目的片段與T4連接酶連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，得到真核表達載體PBI121/FPS，然後將重組表達載體導入根癌農桿菌EHA105後，根癌農桿菌EHA105侵染模式植物雲煙85等過程，最終獲得抗性菸草植株。本發明利用基因工程技術克隆FPS基因，藉助根癌農桿菌侵染植株的愈傷組織，通過FPS基因在植物體內的表達為提高母菊薁產量作鋪墊。
文檔編號C12N15/66GK102816784SQ201210322250
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月4日 優先權日2012年9月4日
發明者袁藝, 楊秀梅, 邰玉玲 申請人:安徽農業大學