食品風味增強用原材料的製造方法
2023-05-08 23:33:16 2
專利名稱：食品風味增強用原材料的製造方法
技術領域：
本發明涉及以固體成分中以1％(重量％)以上的高含量含有γ-穀氨醯半胱氨酸(在本說明書中，除非另有說明，γ-穀氨醯半胱氨酸包含其氧化型的二硫化物)的酵母浸出物及酵母菌體等的食品原材料作為原料，將其在pH酸性乃至中性區域加熱，或者，通過γ-穀氨醯肽水解酶作用於這些原料，可容易地製得半胱氨酸(在本說明書中，除非另有說明，半胱氨酸包含其氧化型二硫化物即胱氨酸)含量高的食品原材料的方法。
本發明還涉及以γ-穀氨醯半胱氨酸或以固體成分中以1％(重量％)以上的高含量含有γ-穀氨醯半胱氨酸的酵母浸出物以及酵母菌體等的食品原材料作為原料，在pH酸性乃至中性區域將其加熱，或者，通過γ-穀氨醯基肽水解酶作用於這些原料，然後，添加還原糖，由此可容易地製得食品的風味增強用原材料的方法，以及，通過加熱用這些方法製得的食品的風味增強用原材料，可容易地製得食品的風味增強劑的方法。
本發明另外還涉及以高含量含有γ-穀氨醯半胱氨酸的用於食品用酵母菌體本身，進而，酵母浸出物本身，或者它們的製造方法。
背景技術：
半胱氨酸，其目的是用於改善食品的風味等。關於半胱氨酸的製法，已知有蛋白分解法及半合成法等，而且目前主要採用的方法也正是蛋白分解法和半合成法。
把半胱氨酸用於上述目的時，迫切要求以高含量含有它的食品原材料，然而，以高含量含有半胱氨酸的食品原材料，早先幾乎是不知道的。
例如，作為γ-穀氨醯半胱氨酸在酵母菌體內蓄積的例子，在基因工程學方面，使γ-穀氨醯半胱氨酸的合成酶過量表達，有的報告稱，每單位菌體乾重最高可蓄積2％的γ-穀氨醯半胱氨酸(大竹，バイサイエンスとインダストリ-，50卷，10號，989～994頁，1992年)。然而，該結果最終只能在基因工程學實驗室酵母中作為模型，是以在自然界中通常不可能得到的形式製成的γ-穀氨醯半胱氨酸的高蓄積酵母。另外，在該報告中，用該酵母作為食品的原材料的想法並未記載。
另外，當把γ-穀氨醯半胱氨酸或含γ-穀氨醯半胱氨酸的酵母浸出物等添加到食品中時，已知可使濃味增強。另外，γ-穀氨醯半胱氨酸或含γ-穀氨醯半胱氨酸的酵母浸出物等與糖共存時，加熱而得到的食品原材料，可有效增強食品的風味，例如，從特開平4-66069號公報、特開平4-91762號公報等早已知道這一點。
詳細說明如下，按照前者(特開平4-66068號公報)，「為了得到更好的肉味調味料，進行悉心的研究結果發現，在含2～20％(重量)(固體物濃度)的穀胱甘肽、半胱氨酸或穀氨醯半胱氨酸等含硫化合物的酵母浸出物中，添加糖類，以及根據需要添加胺基酸類，通過在無脂肪存在下進行加熱，將消除來自上述酵母的令人不愉快的臭味及不愉快的味道，可以得到質量好、穩定性優良的燒烤肉味的調味料」(參照該公報的「用於解決問題手段」)，基於這種發現，「往含一定量的穀胱甘肽、半胱氨酸，或者穀氨醯基半胱氨酸等含硫化合物(單位浸出物含2～20％重量)的酵母浸出物中，添加糖類，並且根據需要添加胺基酸，在無脂肪存在的情況下，於溫度70～180℃，加熱10～180分鐘，而完成調味料的製造法」(該公報的「權利要求範圍」)。
另外，按照後者的方法(特開平4-91762號公報)公開了，「已有的肉味調料有各種各樣，然而，人們希望有著一種與天然的肉燒烤香味不同，而又具有與天然的燒烤肉香味很相似的質量的調味劑。」(該公報「發明擬解決的問題」)、「以解決這些缺點作為目的，對涉及各種胺基酸和糖類的加熱焦化香味進行研究的結果發現，往γ-穀氨醯基半胱氨中添加糖類後，溶於水中，於溫度70～180℃，加熱10～180分鐘，進行反應，製成原來沒有的，具有良好燒烤肉香的味組合物，完成本發明。」(該公報的「用於解決問題的手段」)，「香味組合物的製造法，其特徵是，往γ-穀氨醯半胱氨酸中添加糖類，於溫度70～180℃，加熱10～180分鐘的製造方法」。
但是，用這些香味調味料，雖然肉香味增加，但與此同時，苔蘚臭味增強，這些問題也被指出。
發明的公開在上述原有技術的背景下，本發明的目的是提供一種半胱氨酸含量高的食品原材料。
在上述原有技術的背景下，本發明的另一個目的是提供一種消除上述強烈苔蘚臭味等的上述問題的，在飲食品中使牛肉味及木魚味等風味增強的食品風味增強用的原材料以及風味增強劑。
在上述原有技術的背景下，其次，本發明的再一個目的是提供一種以適當的高含量含有γ-穀氨醯半胱氨酸的食用酵母菌體，乃至酵母浸出物作為上述食品原材料、食品風味增強用的原材料或風味增強劑的製造原料。
本發明人為了達到上述目的而悉心探討的結果發現，γ-穀氨醯半胱氨酸，將其在pH1～7、50～120℃進行加熱時，用3～300分鐘分解成半胱氨酸和PCA(吡咯烷酮羧酸)，所以，可以整體高收率地得到半胱氨酸；另外，當採用γ-穀氨醯肽水解酶使γ-穀氨醯半胱氨酸水解時，由於γ-穀氨醯半胱氨酸分解成半胱氨酸和穀氨酸，所以，半胱氨酸作為整體可高收率地得到；其次，γ-穀氨醯半胱氨酸含量在1％(重量)以上的酵母菌體或酵母浸出物，在糖不存在的條件下，以含水狀態進行同樣加熱，或者，使γ-穀氨醯肽水解酶作用於它，可以得到半胱氨酸含量高的酵母浸出物，基於這些發現，完成本發明的第一發明。
也就是說，本發明涉及一種半胱氨酸含量高的食品原材料的製造方法，以及作為該法原料的食品原材料的酵母浸出物或酵母菌體，其特徵是，把γ-穀氨醯半胱氨酸在固體成分中所佔的比例達到1％(重量)以上的食品原材料，在不存在糖而存在水的條件下，且在pH1～7下保持在50-120℃，或者，在pH3～9的條件下，於15～70℃的溫度下使γ穀氨醯基肽水解酶作用於它。
本發明人為了達到上述目的而進一步悉心研究的結果發現，γ-穀氨醯半胱氨酸或γ-穀氨醯半胱氨酸在固體成分中所佔的比例為1％(重量)以上的高含量的酵母菌體或酵母浸出物，在無還原糖存在下，在酸性乃至中性的pH區域，於50～120℃加熱3～300分鐘，或者，在pH3～9、15～70℃，在γ-穀氨醯基肽水解酶作用後，再添加還原糖，所得到的原材料可有效增強食品的風味；以及，當加熱這些原材料時，製成優良的食品風味增強劑，基於這樣的發現，完成本發明的第二發明。
也就是說，本發明涉及一種食品風味增強用的原材料的製造方法，其特徵是，把γ-穀氨醯半胱氨酸，或γ-穀氨醯半胱氨酸在固體成分中所佔的比例為1％(重量)以上的食品原材料，在無還原糖但有水存在下，在pH1～7，於50～120℃保持3～300分鐘，或者，在pH3～9、15～70℃，與γ-穀氨醯肽水解酶作用後，添加佔上述γ-穀氨醯半胱氨酸的比例達到1～10倍(摩爾)的還原糖；以及，涉及一種食品風味增強劑的製造方法，其特徵是，把這樣得到的食品風味增強用的原材料，在50～180℃保持10～300分鐘。
本發明人為了達到上述目的而進一步悉心研究的結果發現，在作為食用酵母代表的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，制出單位乾燥菌體超過1％的γ-穀氨醯半胱氨酸高含量的酵母，以該酵母菌體製造酵母浸出物的方法(在該浸出物中，含有高濃度的γ-穀氨醯半胱氨酸)，並且，通過加熱處理該酵母浸出物，可以成功地得到半胱氨酸含量比加熱前高的酵母浸出物，基於這一點完成本發明的第三發明。也就是說，本發明涉及的食用酵母菌體或酵母浸出物，其特徵是，γ-穀氨醯半胱氨酸在固體成分中所佔的比例達到在1％(重量)以上的高含量。
因此，上述本發明的第一、第二及第三發明，從早先的說明以及從上述說明可知，它們是由與單一的一般的發明概念相關連的一群發明所構成的。
下面詳細地說明本發明。
首先，對上述第一發明進行說明。
在本發明的製造法中，作為原料的食品原材料，是γ-穀氨醯半胱氨酸佔固體成分1％(重量)以上的高含量的食品原材料。γ-穀氨醯半胱氨酸的含量1％以下的食品原材料，所得到的風味差，工業上無法實用，是不理想的。
作為這樣的食品原材料，例如，可以舉出，γ-穀氨醯半胱氨酸在固體成分中佔的比例1％(重量)以上的酵母菌體及酵母浸出物。因此，這種γ-穀氨醯半胱氨酸高含量的酵母菌體，例如，可以用下述實施例7中記載的方法，或者，將用突然變異法使γ-穀氨醯半胱氨酸達到高含量的酵母從自然界分離出來，或者通過變異處理得到。另外，酵母浸出物是從這種酵母菌體萃取出來，或通過自已消化，或在γ-穀氨醯半胱氨酸的含量達不到上述規定量的酵母浸出物中，通過補加γ-穀氨醯半胱氨酸來製造。
按照本發明，這樣的食品原材料在水存在下，在酸性乃至中性區域，即在pH1～7，保持在50～120℃進行加熱。水的存在量，從操作觀點來決定，例如，對1份(重量)(換算成乾重)食品原材料，可以用1～100份(重量)。當pH在上述範圍外時，半胱氨酸的生成量變少，是不理想的。還有，pH的調節，當然可以用食品所允許的鹽酸等酸以及氫氧化鈉等鹼來進行。加熱溫度，如過低，γ-穀氨醯半胱氨酸的分解反應進行緩慢，反之，如溫度過高，已經生成後的半胱氨酸由於副反應而減少，是不理想的。當在上述條件下進行食品原材料的加熱處理時，在3～300分鐘，半胱氨酸大量生成，蓄積，從而得到半胱氨酸含量高的食品原材料。加熱時間，如果過短，則反應未完成，反之，如果過長，同樣是已經生成後的半胱氨酸由於副反應而減少，是不理想的。
γ-穀氨醯半胱氨酸分解反應，是在不添加糖，特別是不添加葡萄糖、果糖、木糖和麥芽糖等還原糖，在它們不存在的情況下進行是重要的。這就可以防止所生成的半胱氨酸與糖，特別是與這些還原糖反應產生焦臭及褐變反應。
另外，還可以舉出用酶與γ-穀氨醯半胱氨酸作用生成半胱氨酸的方法。也就是說，把可以水解γ-穀氨醯半胱氨酸肽鍵的酶(γ-穀氨醯基肽水解酶)，在pH3～9、15～70℃作用於上述食品原材料。水的存在量，從操作觀點來決定，例如，對每1份(重量)(換算成乾重)的食品原材料，可達到1～100份(重量)。如pH和溫度處於上述範圍以外，γ-穀氨醯基肽水解酶的活性差，是不理想的。在上述條件下，當用酶處理食品原材料時，在1～300分鐘之間，半胱氨酸大量生成、蓄積，得到半胱氨酸含量高的食品原材料。
γ-穀氨醯基肽水解酶存在多種，特別是，作為實施本發明有用的，可以舉出γ-穀氨醯轉移酶、γ-穀氨醯環化轉移酶以及穀氨醯胺酶等。
這樣製成的半胱氨酸含量高的食品原材料，以原有的液態，或加以濃縮製成糊狀，或乾燥成粉狀，或其他的顆粒狀等以便於流通。
下面對上述第二發明加以說明。
第一，對本發明的食品風味增強用的原材料的製造方法加以說明。例如，如上所述，在pH酸性乃至中性區域，把γ-穀氨醯半胱氨酸，或γ-穀氨醯半胱氨酸含量1％(重量)以上的酵母菌體或酵母浸出物，在不存在還原糖的條件下加熱，或者，使γ-穀氨醯基肽水解酶作用於它們，繼而加糖來製造。
在這樣的製造法中，作為原料的食品原材料，與先前本發明第一發明的說明同樣，是γ-穀氨醯半胱氨酸在固體成分中所佔的比例1％(重量)以上的高含量的食品原材料。如γ-穀氨醯半胱氨酸的含量1％以下，則所得到的風味差，工業上不實用，是不理想的。
作為這樣的原材料，例如，可以舉出γ-穀氨醯半胱氨酸在固體成分中所佔的比例1％(重量)以上的酵母菌體及酵母浸出物。因此，這種γ-穀氨醯半胱氨酸高含量的酵母菌體，例如，可以採用下面的實施例7中記載的基因工程學方法製得。另外，酵母浸出物，可以從這樣的酵母菌體萃出或通過自己消化，或者，通過增補γ-穀氨醯半胱氨酸來配製。這也與本發明第一發明先前的說明同樣。
按照本發明，首先，把γ-穀氨醯半胱氨酸高含量的上述食品原材料，在無還原糖存在而存在水的條件下，在酸性乃至中性區域，即在pH1～7，於50～120℃保持3～300分鐘進行加熱。這樣的pH、溫度及時間條件，其本身與本發明第一發明涉及的上述說明同樣。
水的存在量，從操作觀點來決定，例如，對γ-穀氨醯半胱氨酸，或其高含量的食品原材料，其1份重量(換算成乾重)可以達到1～100份(重量)。
因此，本發明人另外還發現，把γ-穀氨醯半胱氨酸在pH1～7，於50～120℃，例如，加熱3～300分鐘時，由於γ-穀氨醯半胱氨酸分解成半胱氨酸和PCA(吡咯烷酮羧酸)，所以，半胱氨酸作為整體可以高收率得到，其次，把γ-穀氨醯半胱氨酸含量1％(重量％)以上的酵母菌體或酵母浸出物，在無還原糖存在下，在含水狀態下同樣加熱時，可以得到半胱氨酸含量高的酵母浸出物，然而，本發明涉及的食用組合物的風味增強作用，可通過從γ-穀氨醯半胱氨酸這樣生成的半胱氨酸來實現。
然而，pH在上述範圍以外時，半胱氨酸的生成量減少，是不理想的。還有，pH的調節，不言而喻，要採用作為食品所允許的鹽酸等酸以及氫氧化鈉等鹼來進行。這點與本發明的第一發明涉及的上述說明同樣。
加熱溫度，當溫度過低時，γ-穀氨醯半胱氨酸的分解反應進行緩慢，反之，當溫度過高時，已經生成的半胱氨酸由於發生副反應而減少，是不理想的。加熱時間，當過短時，反應未完成，反之，當過長時，已經生成的半胱氨酸同樣由於發生副反應而減少，是不理想的。這也與本發明的第一發明涉及的上述說明同樣。
按照本發明人的發現，如同前面說明的那樣，當把γ-穀氨醯半胱氨酸在pH1～7的酸性乃至中性區域，於特定的溫度下加熱特定的時間時，γ-穀氨醯半胱氨酸分解成半胱氨酸和PCA(吡咯烷酮羧酸)，最終可高收率得到半胱氨酸，另外，γ-穀氨醯半胱氨酸的含量1％(重量％)以上的酵母菌體或酵母浸出物，在無還原糖存在下，在含水狀態下同樣進行加熱時，可以得到半胱氨酸高含量的酵母浸出物。
γ-穀氨醯半胱氨酸的這種分解反應，例如，不添加葡萄糖、果糖、木糖和麥芽糖等還原糖，在它們不存在的條件下進行是重要的。這樣可以防止所生成的半胱氨酸，與這些還原糖反應，發生焦臭及褐變反應。這點與本發明的第一發明涉及的上述說明同樣。
另外，還可以舉出，利用酶從γ-穀氨醯半胱氨酸生成半胱氨酸的方法。也就是說，把水解γ-穀氨醯基的肽鍵的酶(γ-穀氨醯基肽水解酶)，於pH3～9、15～70℃的條件下與γ-穀氨醯半胱氨酸或上述食品原材料作用1～300分鐘。水的存在量，以操作觀點來決定，例如，對食品原材料每1份(重量)(換算成乾重)達到1～100(重量)。pH及溫度，如在上述範圍外，則γ-穀氨醯肽水解酶活性差，是不理想的。這點與本發明的第一發明涉及的上述說明相同。
γ-穀氨醯肽水解酶存在多種，然而，作為實施本發明特別有用的，可以舉出γ-穀氨醯轉移酶、γ-穀氨醯環化轉移酶以及穀氨醯胺酶等。
這樣製成的半胱氨酸高含量的加熱處理生成物，往其中添加上述還原糖，其添加比例為上述γ-穀氨醯半胱氨酸的1～10倍(摩爾)，由此，可以得到本發明的食品風味增強用的原材料。
作為還原糖，可以舉出葡萄糖、果糖、木糖和麥芽糖等，這些糖廉價易得，並且從可作為食品使用考慮是理想的。
還原糖的添加量，如上所述，對原料γ-穀氨醯半胱氨酸，或含其的酵母菌體，或者，酵母浸出物等天然食品原材料中，含有的γ-穀氨醯半胱氨酸1摩爾，可添加1～10摩爾。當添加量低於上述範圍時，效果差，另一方面，添加量大時，甜味增強，是不理想的。這樣製造的風味增強用的原材料，以其原來的液態，或濃縮成糊狀，或乾燥成粉末狀，或製成其他的顆粒態等適於流通的狀態。本發明的風味增強用原材料，當在以後的食品加工的場合使用時，在進行加工處理的加熱工序，其中所含的半胱氨酸和還原糖反應，呈現風味增強的效果。
其次，對本發明的食品風味增強劑的製造方法加以說明。例如，把上述本發明的風味增強用的原材料，在適當的條件下，通過加熱處理可以得到。
在進行加熱處理時，為了得到風味增強效果，半胱氨酸濃度0.1％(重量)以上，理想的要根據需要濃縮達到0.6％(重量)以上，然後進行加熱。加熱條件要在50～180℃、10～300分鐘的範圍內不發生焦臭及褐變反應的範圍內進行。這樣的加熱條件，例如，包括在50～60℃的低溫及180～300分鐘的長時間，以及在90～100℃(沸點前後)的高溫和30～120分鐘的短時間的加熱條件。
例如，這樣製成的本發明的食品風味增強劑，與先前的風味增強用的原材料同樣，以原有的液態，或濃縮成糊狀，或乾燥成粉狀及其他的顆粒狀等適於流通的形態。
最後，對上述第三發明進行說明。
γ-穀氨醯基半脫氨酸高含量的本發明食用酵母(菌體)，按下法製成。也就是說，首先，把穀胱甘肽合成酶基因GSH2破壞，製成沒有穀胱甘肽合成酶功能的酵母，然後，用普通方法進行培養。
因此，以往的報告(Chris M.Grant，Molccular Biology of theCell，8卷，1699～1707，9月，1997年)認為，GSH2基因不是生育所必須的基因。對不是生育必須的基因的破壞，是人們已知的即使1個基因的自然突然變異也容易產生的現象，所以，本發明後面的實施例7可以說是自然狀態下產生的結果之一例。
另外，在本發明中，從製成的酵母製造實際的酵母浸出物，可以明確表明其是γ-穀氨醯半胱氨酸，乃至半脫氨酸高含量的食品原材料。
附圖的簡單說明
圖1表示在pH3，還原型γ-穀氨醯半胱氨酸的分解所生成的半胱氨酸量隨時間的變化(檢查例1)。
圖2表示在pH5，還原型γ-穀氨醯半胱氨酸的分解所生成的半胱氨酸量隨時間的變化(檢查例1)。
圖3表示在pH7，還原型γ-穀氨醯半胱氨酸的分解所生成的半胱氨酸隨時間的變化(檢查例1)。
圖4表示在pH5，用穀氨醯胺酶的還原型γ-穀氨醯半胱氨酸的分解生成的半胱氨酸量對穀氨醯胺酶量的依賴性(檢查例2)。
圖5表示在pH7，用穀氨醯胺酶的還原型γ-穀氨醯半胱氨酸的分解生成的半胱氨酸量對穀氨醯胺酶量的依賴性(檢查例2)。
圖6表示在pH9，用穀氨醯胺酶的還原型γ-穀氨醯半胱氨酸的分解生成的半胱氨酸量對穀氨醯胺酶量的依賴性(檢查例2)。
圖7表示H4ΔGSH2菌株體中的含硫化合物量(實施例7)。
圖8表示H4ΔGSH2酵母浸出物中含硫化合物量的變化(實施例7)。
實施本發明的最佳方案下面通過檢查例及實施例更詳細地說明本發明。
首先舉出本發明第一發明的檢查例及實施例。
檢查例1(採用加熱，從γ-穀氨醯半胱氨酸生成半胱氨酸)對pH不同的(即pH3、5及7的)還原型γ-穀氨醯半胱氨酸1mmol濃度的水溶液，在98℃加熱時生成的半胱氨酸量隨時間的變化進行調查。結果示於下列圖1～3。圖中，PCA表示吡咯烷酮羧酸，γ-Glu-Cys表示還原型γ-穀氨醯半胱氨酸，而Total Cysteine表示半胱氨酸。
由圖1～3可知，加熱，可從γ-穀氨醯半胱氨酸高收率地得到半胱氨酸。
檢查例2(用酶，從γ-穀氨醯半胱氨酸生成半胱氨酸)往pH不同的(即pH5、7及9的)還原型γ-穀氨醯半胱氨酸1mmol濃度的水溶液中，添加各種濃度的「穀氨醯胺酶大和」(大和化成社製造的穀氨醯胺酶，比活性為3.0mM/min/mg)，對37℃反應10分鐘時生成的半胱氨酸量進行調查(γ-穀氨醯半胱氨酸的水解酶量依賴性)。結果示於下列圖4～6中。圖中，γ-Glu-Cys表示還原型γ-穀氨醯半胱氨酸，而Total Cysteine表示半胱氨酸。
從圖4～6可知，用穀氨醯胺酶水解γ-穀氨醯半胱氨酸，可同時等摩爾得到半胱氨酸(高收率)。
實施例1往含4.5％γ-穀氨醯半胱氨酸的酵母浸出物粉中加水，用鹽酸調節pH到5，製成濃度2％的水溶液，將其於98℃加熱180分鐘後，冷凍乾燥，得到含2.0％半胱氨酸的酵母浸出物粉。
因此，該酵母浸出物粉用於調味製造時，可以得到具有良好的燒烤肉香味的調味料。
實施例2往含4.5％γ-穀氨醯半胱氨酸的酵母浸出物粉中加水，用1N NaOH調節pH至7，製成濃度2％的水溶液。往該溶液添加穀氨醯胺酶(與在檢查例2中使用的相同)，使濃度達到1mg/ml，於37℃孵化10分鐘後，冷凍乾燥，得到含2.5％半胱氨酸的酵母浸出物粉。
因此，把該酵母浸出物粉用於調味料製造時，結果可以得到與實施例1同樣的具有良好的燒烤肉香味的調味料。
下面，舉出本發明第二發明的實施例及檢查例。
實施例3(γ-穀氨醯半胱氨酸)用1N NaOH把pH調到5的γ-穀氨醯半胱氨酸4％的水溶液，於98℃加熱3小時。加熱後，添加葡萄糖，使對溶液達到4％(每1摩爾γ-穀氨醯半胱氨酸，相當於1.4摩爾)(風味增強用的原材料)。將其於60℃加熱180分鐘後，冷凍乾燥(風味增強劑)。
用這樣得到的冷凍乾燥物(本發明的食品風味增強劑)，在從市場購得的牛肉清湯羹汁體系進行官能評價。添加本冷凍乾燥物，使對市場購得的牛肉清湯羹汁固體成分達到0.05％，與未添加的進行對照，用15名品嘗員，對各評價項目，用選擇比較理想的或比較強的樣品的方法進行評價。
結果示於下列表1。表中的人數是作為選擇味道比較理想的或比較濃的樣品的品嘗員人數。
第1表評價結果
實施例4(γ穀氨醯半胱氨酸)往用1N NaOH調節pH至7的γ-穀氨醯半胱氨酸的4％水溶液中添加穀氨醯胺酶，使達到1mg/ml，於37℃孵化2小時。反應後，添加葡萄糖，使對溶液達到4％(每1摩爾γ-穀氨醯半胱氨酸，相當於1.4摩爾)(風味增強用的原材料)。將其於60℃加熱180分鐘後，進行冷凍乾燥(風味增強劑)。
用這樣得到的冷凍乾燥物(本發明的食品風味增強劑)，在市場購得的牛肉清湯羹汁體系內進行官能評價。添加本冷凍乾燥物，使在市場購得的牛肉清湯羹汁固體成分中達到0.05％，與未添加的進行對照，用15名品嘗員，對各評價項目，用選擇比較好的或比較強的樣品方法進行評價。
結果示於下表2。表中的人數是作為選擇味道比較理想的或比較濃的樣品的品嘗員人數。
第2表
實施例5(酵母浸出物)把含4.5％γ-穀氨醯半胱氨酸的酵母浸出物，用1N NaOH調節pH至5的20％水溶液(在該水溶液中，γ-穀氨醯半胱氨酸濃度為0.9％)，於98℃加熱3小時。加熱後，添加葡萄糖，使對溶液達到1.8％(對γ-穀氨醯半脫氨酸1摩爾，相當於2.8摩爾)(風味增強用原材料)。將其與實施例3同樣進行加熱，濃縮後，進行噴霧乾燥(風味增強劑)。
用本乾燥物(本發明的食品風味增強劑)，在(a)市場購得的牛肉清湯羹汁、(b)咖喱、(c)清湯汁的各種體系中，進行官能評價。結果示於下表3。還有，本乾燥物，對固體成分按表中所示的量進行添加，與未添加的進行對照，用15名品嘗員，與實施例3同樣進行評價。
第3表評價結果(a)牛肉清湯羹汁
(b)咖喱
(c)清湯汁
實施例6(酵母浸出物)往含4.5％的γ-穀氨醯半胱氨酸的酵母浸出物經1N NaOH調節pH至7的20％水溶液(該水溶液中的γ-穀氨醯半胱氨酸的濃度，0.9％)中，添加穀氨醯胺酶，使達到1mg/ml，於37℃孵化2小時。反應後，添加葡萄糖，使對溶液達到1.8％(對γ-穀氨醯半胱氨酸1摩爾，相當於2.8摩爾)(風味增強用的原材料)。將其與實施例3同樣操作，加熱，濃縮後，進行噴霧(風味增強劑)。
用本乾燥物(本發明的食品風味增強劑)在(a)市場購得的牛肉清湯羹汁、(b)加喱及(c)清湯汁的各種體系中進行官能評價。結果示於下表4。還有，本乾燥物按表中所示的量對固體成分添加，與未添加的進行對照，用15名品嘗員，與實施例3同樣進行評價。
第4表評價結果(a)牛肉清湯羹汁
(b)咖喱
(c)清湯汁
檢查例3往4％的γ-穀氨醯半胱氨酸溶液添加4％葡萄糖，調節至pH5後，於98℃加熱3小時，立即冷凍乾燥。
採用這樣得到的冷凍乾燥物試樣(比較試樣)及上述實施例3製造的本發明風味增強劑(冷凍乾燥物＝本發明試樣)，往市場購得的牛肉清湯羹汁試樣添加，對市場購得的牛肉清湯羹汁的固體成分達到0.05％，用15名品嘗員進行比較評價，按表下的評價標準評分，取其平均值。
第5表評價結果
評價標準評價等級5非常濃，或理想4濃，或理想3稍濃，或稍理想2稍弱，或稍不理想1弱，或不理想最後，舉出本發明第三發明的實施例。
實施例7(a)下面對單位乾燥菌體(重量)含γ-穀氨醯半胱氨酸1％以上的食用酵母的育種加以說明。
在酶母的細胞內代謝時，γ-穀氨醯半胱氨酸是作為穀胱甘肽(GSH)生成的第一步中間代謝產物存在的。將γ-穀氨醯半胱氨酸轉變成穀胱甘肽的酶是穀胱甘肽合酶。這裡，通過使穀胱甘肽合酶失去遺傳基因(下面稱GSH2)的功能企圖使γ-穀氨醯半胱胺酸蓄積在食用酵母細胞內。
(1)作為使GSH2失去遺傳基因功能的方法，可採用一段遺傳基因破壞法(one-step-gene-disruption法)。為此，首先要進行必要的GSH2遺傳基因破壞盒(cassette)的製造。
詳述如下，把市場購得的食用酵母(麥麵酵母)啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)用通常的方法形成孢子，使所得到的孢子發芽，用PCR法，從所得株的1株(這裡稱作H4株)的GSH2遺傳基因的上遊區域至GSH2遺傳基因的末端區域進行擴增。條件如下表6所示。
第6表酵母染色體基因 1μl10X PCR緩衝劑 10μl10mM dNTPs 10μl10pmol/μl GAL11F(引物)1μl序列5′-TATGAAGACTGTACAGTCTCC-3′(下示序列編號1的序列)10pmol/μl GSH2R3(引物)1μl序列5′-CCGGGGAGCTCAGCTAAATGGTGTACTTCGCTAC-3′(下示序列編號2的序列)毫當量水 76μlTaq聚合酶 1μl合計 100μl備考在94℃、1分鐘-94℃、30秒-60℃、40秒-74℃、1分30秒反覆30次循環。
把這樣放大的遺傳基因片斷(GSH2)，用通常的方法，使連接在質體pGEM-T Easy(Promega社製造)上，進行克隆(下面稱作GSH2/pGEM)。
同樣操作，作為在一段基因破壞法(one-step-gene-disruption法)中所用的選擇遺傳基因標記，也可以用RCR法使URA3基因放大。條件如下表7所示。
第7表10ng/μl pYES2(Invitrogen社) 1μl10X PCR緩衝劑 10μl10mM dNTPs10μl10pmol/μl URA3F2(引物) 1μl序列5′-ATTAACCCGGGTTGATTCGGTAATCCCG-3(下示序列編號3的序列)10pmol/μl URA3R2(引物) 1μl序列5′-ATTAACCCGGGGTTTTTTAGTTTTGCTGGC-3′(下示序列編號4的序列)毫當量水 76μlTaq聚合酶 1μl合計 100μl備考在94℃、1分鐘-94℃、30秒-52℃、30秒-74℃、40秒反覆30次循環。
接著，用控制酶MunI切斷GSH2/pGEM，用通常的方法使基因末端變平滑。在該切斷末端，用控制酶SmaI使基因末端變平滑的URA3基因，用通常的方法，進行再吸入使其導入(下面稱作URA3-GSH2/pGEM)以URA3-GSH2/pGEM作為模型，採用GSH2兩端加以標記的遺傳基因引物(上述GAL11F、GSH2R)進行PCR，製造GSH2基因破壞盒。PCR的條件示於下列表8中。
第8表10ng/μl URA3-GSH2/pGEM1μl10X PCR緩衝劑 10μl10mM dNTPs 10μl10pmol/μl GAL11F(引物)1μl序列上面記載的(下示序列編號1的序列)10pmol/μl GSH2R(引物) 1μl序列5′-AGCTAAATGGTGTACTTCGCTAC-3′(下示序列編號5的序列)毫當量水 76μlTaq聚合酶 1μl合計 100μl備註在94℃、1分鐘-94℃、30秒-56℃、30秒-74℃、1分鐘反覆30次循環。
(2)採用以上的方法製造的GSH2遺傳基因破壞盒(下面稱作URA3-GSH2)，進行食用酵母H4株的GSH2遺傳基因的破壞。
首先，在3ml YPD培養基中，把H4株於30℃振蕩培養24小時，進行前培養。把該培養菌體液1ml移至50ml YDP培養基中，培養達到對數增殖期後，在1M山梨糖醇中成懸浮狀態，與URA3-GSH2混合，用通常的方法，進行電濁孔法處理，把GSH2基因放入破壞盒，得到變化的H4株(下面稱作H4ΔGSH2)。
(b)含單位乾燥菌體重1％以上的γ-穀氨醯半胱氨酸的食用酵母的培養，按下法進行。
把H4ΔGSH2株，用含1mM穀氨甘肽的3ml合成的基幹培養基，於30℃振蕩培養24小時，進行前培養。把該培養菌體液1ml移至含5mM半胱氨酸50ml的合成的基幹培養基中，進行48小時培養，取得菌體。用蒸鎦水洗滌該菌體3次後，將其於70℃進行萃取處理10分鐘，萃出細胞內容物。
將其進行離心處理，測定得到的上清液(酵母浸出物萃取液)中的γ-穀氨醯半胱氨酸含量。結果得到的單位乾酵母菌體中的γ-穀氨醯半胱氨酸含量示於圖7。還有，乾燥菌體重量，把一定培養基中所含的酵母菌體放在濾紙上，於105℃加熱4小時後，測定所具有的菌體重量。
另外，把上述酵母浸出物萃取液用通常的方法進行冷凍乾燥，製成粉末後，取該粉末20.2mg溶於1ml水中，溶液的pH達到5。將其一部分於98℃加熱3小時，測定加熱前後酵母萃取物(酵母浸出物)中的γ-穀氨醯半胱氨酸及半胱氨酸的含量。結果示於圖8。
在上述圖7及圖8中，Total Cysteine表示半胱氨酸，γ-Glu-Cys表示還原型γ-穀氨醯半胱氨酸，而GSH表示穀胱甘肽。
還有，用本發明的製造方法得到的γ-穀氨醯半胱氨酸高含量的酵母菌體及酵母浸出物，不僅可以用作本發明涉及的食品原材料、食品風味增強用的原材料或食品風味增強劑的製造原料，而且，在其他的用途中，γ-穀氨醯半胱氨酸或半胱氨酸不能不說是一種優良的原料。
工業上利用的可能性按照本發明，可以容易地得到一種對食品風味改善等有用的半胱氨酸含量高的酵母浸出物等半胱氨酸含量高的天然食品原材料。
按照本發明，另外，可容易地得到一種焦臭味濃等問題得到解決的，在飲食品中，牛肉味及木魚味等風味得到增強的食品風味增強用的原材料及風味增強劑。
按照本發明涉及的方法，可容易地製得γ-穀氨醯半胱氨酸高含量的酵母菌體。
序列表110味之素株式會社(Ajinomoto Co.，Inc.)120食品的風味增強用原材料的製造方法130DF26PCT/B508150JP 10-3353851511998-11-26150JP 10-3353861511998-11-28150JP 11-1941721511999-07-08150JP 11-1942091511999-07-081605210121121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4001tatgaagact gtacagtctc c21210221134212DNA213人工序列
220
223人工序列的描述引物4002ccggggagct cagctaaatg gtgtacttcg ctac 34210321129212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4003attaacccgg gtgattcgg taatctccg 29210421130212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4004attaacccgg ggttttttag ttttgctggc 30210521123212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4005agctaaatgg tgtacttcgc tac 2權利要求
1.一種半胱氨酸含量高的食品原材料的製造方法，其特徵是，在水存在下，在pH3～9、15～70℃時，使γ-穀氨醯肽水解酶作用於以固體成分中所佔比例在1重量％以上的含量含有γ-穀氨醯半胱氨酸的食品原材料。
2.權利要求1中記載的半胱氨酸含量高的食品原材料的製造方法，其特徵是，γ-穀氨醯肽水解酶是γ-穀氨醯轉移酶、γ-穀氨醯環化轉移酶或穀氨醯胺酶。
3.權利要求1或2中記載的半胱氨酸含量高的食品原材料的製造方法，其特徵是，原料的食品原材料為酵母浸出物或酵母菌體。
4.一種食品風味增強用的原材料的製造方法，其特徵是，使γ-穀氨醯肽水解酶，在水的存在下，於pH3～9、15～70℃下與γ-穀氨醯半胱氨酸或者γ-穀氨醯半胱氨酸在固體成分中所佔比例為1重量％以上的食品原材料作用1～300分鐘後，添加還原糖，其加量相對於上述γ-穀氨醯半胱氨酸的比例為1～10倍摩爾。
5.權利要求4中記載的食品風味增強用的原材料的製造方法，其特徵是，γ-穀氨醯肽水解酶為γ-穀氨醯轉移酶、γ-穀氨醯環化轉移酶或穀氨醯胺酶。
6.一種食品風味增強劑的製造方法，其特徵是，將權利要求4或5中記載的食品風味增強用的原材料，在50～180℃保持10～300分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種半胱氨酸含量高的食品原材料製造方法，其特徵是，γ－穀氨醯半胱氨酸在固體成分中所佔的比例大於1％(重量)的酵母浸出物、酵母菌體等食品原材料，在無糖但有水存在下，在pH1～7，保持在50～120℃，或者，在pH 3～9，15～70℃，使其與γ－穀氨醯基肽水解酶進行作用。另外，還公開了一種，在γ－穀氨醯基肽水解酶作用後，通過再添加還原糖，則可解決焦臭味濃等問題，製造出使飲食品中牛肉味及木魚味等風味得到增強的食品風味增強用的原材料的製造方法。
文檔編號A23L1/221GK1537461SQ200410043398
公開日2004年10月20日 申請日期1999年11月25日 優先權日1998年11月26日
發明者香村正德, 西村康史, 佐野公一朗, 川口宏和, 日比野嶽, 杉本玲子, 西內博章, 若林秀彥, 石黑恭佑, 上田要一, 一, 一朗, 佑, 史, 和, 子, 嶽, 彥, 章 申請人:味之素株式會社