一種治療皮炎的單克隆抗體的製備方法
2023-05-09 07:22:01
一種治療皮炎的單克隆抗體的製備方法
【專利摘要】本發明涉及的是一種治療皮炎的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，通過同位素標記，多維液相色譜-質譜聯用的方法分析在皮炎細胞中特異表達的細胞因子，對這些蛋白進行分離純化；用分離純化出來的皮炎細胞中特異表達的細胞因子對6-8周齡的雌性BALB/c小鼠進行免疫，如果抗體滴度在1∶10000以上時，可將免疫小鼠脾細胞的單細胞懸液與對數生長期的骨髓瘤細胞融合併篩選，得到分泌皮炎細胞中特異表達的細胞因子的單克隆抗體的雜交瘤細胞；向6-8周齡的BALB/c小鼠腹腔注射雜交瘤細胞，注射細胞後10天左右收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得純度較高的治療皮炎細胞因子的單克隆抗體。
【專利說明】一種治療皮炎的單克隆抗體的製備方法
(—)【技術領域】:
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，特別是一種治療皮炎的單克隆抗體的製備方法。
(二)【背景技術】:
[0002]皮炎是皮膚的常見病多發病。在世界各國人群中的發病率約為2-5 %，中國的皮炎病人約3千萬。其發病的細胞和分子機理已在近幾年中得到闡明。它是由於機體內在的遺傳和外界的環境等綜合因素引起的炎症性疾病。表皮角質化細胞在各種因素刺激下可誘導和產生多種細胞因子，特別是白細胞介素-8(IL-8)，IL-8是一種強烈的嗜中性白細胞化學趨向因子，能強力地募集和激活嗜中性白細胞。在外源或內源性的刺激下，多種細胞(包括單核細胞，巨噬細胞，T淋巴細胞，嗜中性粒細胞，成纖維細胞，角質化細胞等)會分泌過量的白細胞介素_8，使IL-8在皮膚局部的濃度高於正常水平。IL-8就會和攜帶IL-8受體的細胞表面受體結合，激活這些細胞，引起過度地增生。同時，被激活的細胞又大量分泌IL-8，募集全身的嗜中性細胞匯集到皮膚病灶部位，浸潤和損傷正常皮膚，形成惡性循環，導致難以醫治的各種皮膚炎症性疾病。
[0003]應用具有高特異性和中和活性的抗IL-8抗體，可以有效地中和及消除表皮中過量的IL-8，從而阻斷或減少嗜中性白細胞的募集和浸潤，阻斷炎症反應的惡性循環，達到治療炎症皮膚病灶，使表皮得以恢復正常的效果。
(三)
【發明內容】
:
[0004]本發明的目的在於提供一種製備可以有效治療皮炎的單克隆抗體的製備方法，它針對上述情況，發明一種操作簡便、成本低廉、高效的製備方法。
[0005]本發明的技術方案:一種製備可以有效治療皮炎的單克隆抗體的方法，其特徵在於它包括以下步驟:
[0006](I)收集大量皮炎細胞樣本及正常細胞樣本，並通過同位素標記，多維液相色譜-質譜聯用的方法分析在皮炎細胞中特異表達的細胞因子，對這些蛋白進行分離純化；
[0007](2)完成皮炎細胞中特異表達的細胞因子單克隆抗體的表達和純化；
[0008]1、用分離純化出來的細胞因子進行動物免疫。選擇6-8周齡的雌性BALB/c小鼠。按照每隻鼠10ug的量，與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點注射。2-3周後加強免疫，抗原劑量同上，與弗氏不完全佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點或腹腔內注射。免疫7-10天後小鼠尾靜脈採血，收集血清。間接法ELISA測定血清中針對的抗體滴度。如果抗體滴度在1: 10000以上，可以在融合前三天加強免疫，100 μ L的PBS溶解50ug皮炎細胞中特異表達的細胞因子腹腔內注射或靜脈注射。否則，繼續進行每兩周一次免疫，直到達到較高的抗體滴度。
[0009]2、細胞融合和篩選。為了產生分泌治療皮炎細胞因子的單克隆抗體的雜交瘤細胞，將對數生長期的骨髓瘤細胞與免疫小鼠脾細胞的單細胞懸液混合，然後在聚乙二醇(PEG)介導的條件下融合:脾細胞與骨髓瘤細胞在10: I的比例混合。將細胞的混合物用無血清MDM培養基洗滌至少3次。於37°C水浴中，向細胞團中逐滴加入50% PEG,並輕輕搖動細胞沉澱，再經無血清的MDM培養基洗滌I次。用含有HAT的完全培養基重懸融合後的細胞團，輕輕吹打至細胞團散開，並按200ul/well接種於96孔細胞培養板中。之後,每隔2-3天半量更換培養基，直到雜交瘤細胞克隆足夠大可以篩選。間接法ELISA篩選分泌針對皮炎細胞中特異表達的細胞因子的抗體陽性細胞孔。首次確定為陽性細胞孔，經過有限稀釋法，至少亞克隆3次，保證陽性率在100%，獲得可以穩定分泌皮炎細胞中特異表達的細胞因子抗體的雜交瘤細胞株。
[0010]3、腹水製備:選擇6-8周齡的BALB/c小鼠，每隻小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油，7-10天後注射雜交瘤細胞。注射細胞後10天左右收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得純度較高的治療皮炎細胞因子的單克隆抗體。
(四)【具體實施方式】:
[0011]以下將通過【具體實施方式】的形式再對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅局限於以下的【具體實施方式】，凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
[0012]實施例1:皮炎細胞中特異表達的細胞因子的獲得
[0013]通過同位素標記、多維液相色譜-質譜聯用的方法分析200多個皮炎細胞樣本與200多個正常細胞樣本，找出5-8個在皮炎細胞中特異表達的細胞因子，分離純化出這幾個細胞因子；
[0014]實施例2:皮炎細胞中特異表達的細胞因子單克隆抗體的表達
[0015]1、用分離純化出來的細胞因子進行動物免疫。
[0016]選擇6-8周齡的雌性BALB/c小鼠。按照每隻鼠10ug的量，與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點注射。2-3周後加強免疫，抗原劑量同上，與弗氏不完全佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點或腹腔內注射。免疫7-10天後小鼠尾靜脈採血，收集血清。間接法ELISA測定血清中針對的抗體滴度。如果抗體滴度在1:1w以上，可以在融合前三天加強免疫，100 μ L的PBS溶解50ug皮炎細胞中特異表達的細胞因子腹腔內注射或靜脈注射。否則，繼續進行每兩周一次免疫，直到達到較高的抗體滴度。
[0017]2、細胞融合和篩選。
[0018]為了產生分泌皮炎細胞中特異表達的細胞因子的單克隆抗體的雜交瘤細胞，將對數生長期的骨髓瘤細胞與免疫小鼠脾細胞的單細胞懸液混合，然後在聚乙二醇(PEG)介導的條件下融合:脾細胞與骨髓瘤細胞在10: I的比例混合。將細胞的混合物用無血清MDM培養基洗滌至少3次。於37°C水浴中，向細胞團中逐滴加入50% PEG，並輕輕搖動細胞沉澱，再經無血清的MDM培養基洗滌I次。用含有HAT的完全培養基重懸融合後的細胞團，輕輕吹打至細胞團散開，並按200ul/well接種於96孔細胞培養板中。之後，每隔2-3天半量更換培養基，直到雜交瘤細胞克隆足夠大可以篩選。間接法ELISA篩選分泌針對皮炎細胞中特異表達的細胞因子的抗體陽性細胞孔。首次確定為陽性細胞孔，經過有限稀釋法，至少亞克隆3次，保證陽性率在100%，獲得可以穩定分泌皮炎細胞中特異表達的細胞因子抗體的雜交瘤細胞株。
[0019]實施例3:皮炎細胞中特異表達的細胞因子的單克隆抗體的純化
[0020]選擇6-8周齡的BALB/c小鼠，每隻小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油，7_10天後注射雜交瘤細胞。注射細胞後10天左右收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得純度較高的皮炎細胞中特異表達的細胞因子的單克隆抗體。
【權利要求】
1.一種治療皮炎單克隆抗體的製備方法，其特徵在於它包括以下步驟:(1)皮炎中特異表達細胞因子的分離純化；(2)皮炎中特異表達細胞因子的單克隆抗體的表達；(3)皮炎中特異表達細胞因子單克隆抗體的純化。
2.根據權利要求1所述的一種製備治療皮炎細胞因子單克隆抗體的方法，其特徵在於通過同位素標記、多維液相色譜-質譜聯用的方法找出在皮炎細胞中特異表達的細胞因子。
3.根據權利要求1所述的一種製備治療皮炎單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，用在皮炎細胞中特異表達的細胞因子對小鼠進行免疫，如果抗體滴度在1: 8000-1: 12000以上時，可將免疫小鼠脾細胞與對數生長期的骨髓瘤細胞融合併篩選。
4.根據權利要求1所述的一種製備治療皮炎單克隆抗體的製備方法，其特徵在於向小鼠腹腔注射雜交瘤細胞，注射細胞後8-12天收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得治療皮炎的單克隆抗體。
【文檔編號】C07K16/24GK104356235SQ201410696927
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月25日 優先權日:2014年11月25日
【發明者】李鳳娟, 胡曉晨, 劉雲鵬, 馮煥龍, 陳寶龍 申請人:天津工業大學