用於組織或器官移植物誘導t細胞耐受的方法

2023-05-09 16:47:01

專利名稱：用於組織或器官移植物誘導t細胞耐受的方法
背景技術：
為了誘導抗原特異性的T細胞活化和克隆擴增，由抗原呈遞細胞(APCs)提供的兩個信號必須傳遞至靜止的T淋巴細胞表面(Jenkins，M.和Schwartz，R.(1987)《實驗醫學雜誌》，165，302-319；Mueller，D.L，等，(1990)《免疫學雜誌》，144，3701-3709；Williams，I.R和Unanue，E.R(1990)《免疫學雜誌》，145，85-93)。第一個信號，授與特異性給免疫反應，是由T細胞受體(TCR)介導，接著識別呈現於主要組織相容性複合物(MHC)中的外來抗原多肽。第二個信號稱為共刺激，它誘導T細胞增殖和變成功能性的T細胞(Schwartz，R.H(1990)《科學》248，1349-1356)。共刺激既不是抗原特異性的，也不是MHC限制性的，被認為是由APCs表達的一個或多個獨特性的細胞表面分子所提供(Jenkins，M.K，等，(1988)《免疫學雜誌》，140，3324-3330；Linsley，P.S.，等，(1991)《實驗醫學雜誌》，173，721-730；Gimmi，C.D.，等，(1991)《美國國家科學院院刊》，88，6575-6579；Young，J.W，等，(1992)《臨床研究雜誌》，90，229-237；Koulova，L，等，(1991)《實驗醫學雜誌》，173，759-762；Reiser，H.，等，(1992)《美國國家科學院院刊》，89，271-275；Van-Seventer，G.A，等，(1990)《免疫學雜誌》，144，4579-4586；Lasslle，J.M，等，(1991)《免疫學雜誌》，144，774-80；Dustin，M.I.，等，(1989)《實驗醫學雜誌》，169，503；Armitage，R，J，等，(1992)《自然》，357，80-82；Liu，Y.，等，(1992)《實驗醫學雜誌》，175，437-445)。參與T細胞激活的一個共刺激路徑包括T細胞表面的CD28分子。此分子能夠接受由B細胞或其它APCs細胞上的配體所傳遞的共刺激信號。CD28分子的配體包括B淋巴細胞激活抗原的B7家族成員，例如B7-1和/或B7-2(Freedman，A.S，等，(1987)《免疫學雜誌》，137，3260-3267；Freeman，G.J.等，(1989)《免疫學雜誌》，143，2714-2722；Freeman，G.J.等，(1991)《實驗醫學雜誌》，174，625-631；Freeman，G.J.等，(1993)《科學》，262，909-911；Azuma，M.等，(1993)《自然》，366，76-79；Freeman，G.J.等，(1993)《實驗醫學雜誌》，178，2185-2192)。B7-1和B7-2也是另一分子CTLA4的配體，CTLA4呈現於激活的T細胞表面，然而CTLA4在共刺激中的作用並不清楚。
傳遞給T細胞一個抗原特異性信號和一個共刺激信號導致T細胞激活，它包括T細胞增殖和細胞因子的分泌。相反地，傳遞給T細胞一個抗原特異性信號而缺少共刺激信號時，則被認為在T細胞中誘導了一種無應答性或無反應性狀態，所以在T細胞中誘導了抗原特異性耐受。
T細胞和B細胞的相互作用在免疫反應中起了主要的作用。誘導對胸腺依賴性抗原的體液免疫需要由T輔助細胞(此後稱Th)提供的「幫助」。儘管提供給B淋巴細胞的某些幫助是由Th細胞釋放的可溶性分子介導的(例如淋巴因子IL-4和IL-5)，B細胞的激活也需要B細胞和Th細胞接觸依賴性的相互作用。Hirohata等《免疫學雜誌》，1403736-3744(1988)；Bartlett.等，《免疫學雜誌》1431745-1754(1989)；這表明B細胞的激活包括了B細胞和Th細胞的細胞表面分子之間必需的相互作用。T細胞上的分子因而介導了T細胞的接觸依賴性輔助效應物的功能。B細胞和T細胞上的分子之間接觸依賴性相互作用被下列觀察進一步支持，分離的激活的T細胞的原生質膜，能夠提供對B細胞的激活必需的幫助功能。Brian，《美國國家科學院院刊》，85564-568(1988)；Hodgkin等，《免疫學雜誌》，1452025-2034(1990)；Noelle等，《免疫學雜誌》，1461118-1124(1991)。
一個分子，CD40，已被確認存在於未成熟和成熟的B淋巴細胞表面，當它被抗體交聯時，誘導B細胞增殖。Valle等，《歐洲免疫學雜誌》，191463-1467(1989)；Gordon等，《免疫學雜誌》，1401425-1430(1988)；Gruber等，《免疫學雜誌》， 424144-4152(1989)。CD40已經被分子克隆和確認特性。Stamenkovic等《歐洲分子生物學組織雜誌》，81403-1410(1989)。CD40的一個配體，gp39(也稱CD40配體和或CD40L)也已被分子克隆和確認特性。Armitage等，《自然》，35780-82(1992)；Lederman等，《實驗醫學雜誌》1751091-1101(1992)；Hollenbaugh等，《歐洲分子生物學組織雜誌》，114313-4319(1992)。gp39蛋白表達是在激活的，而不是靜止的CD4+Th細胞上。Spriggs等，《實驗醫學雜誌》1761543-1550(1992)；Lane等，《歐洲免疫學雜誌》，222573-2578(1992)；Roy等，《免疫學雜誌》，1511-14(1993)。轉染gp39基因並在表面表達gp39蛋白的細胞能啟動B細胞的增殖，並與別的刺激信號一起可以誘導抗體的產生。Armitage等《自然》，35780-82(1992)，Hollenbaugh等，《歐洲分子生物學組織雜誌》，114313-4319(1992)。發明簡述細胞表面分子介導T細胞的接觸依賴性輔助效應物功能，它對於誘導需要T細胞幫助的免疫反應是重要的。例如，T細胞上的gp39與B細胞上的CD40的相互作用對於激活B細胞對抗原的反應起了關鍵性的作用。本發明至少是部分依據此發現，即細胞表面介導T細胞接觸依賴性輔助效應物功能的分子在T細胞對同種抗原的反應中也起重要作用，特別是已經發現在適宜的條件下，幹擾gp39與同種細胞上的配體相互作用能夠誘導T細胞耐受，同種的這類細胞向T細胞呈遞同種抗原。優選地說，向T細胞呈遞同種抗原的同種細胞為了提供T細胞活化所必需的信號，需要此細胞上的gp39配體與T細胞上的gp39相互作用。抑制同種細胞上的gp39配體與T細胞上的gp39相互作用防止了T細胞的激活，也就誘導同種抗原特異性的T細胞耐受，這裡說明的誘導T細胞對同種抗原的耐受可以做為組織和器官移植的一種預備性制度。
因此，本發明的方法在組織和器官的受體中誘導對供體組織和器官的T細胞耐受尤其有用。此方法包括施子移植受體1)一種同種或異種的細胞，它至少表達一種供體抗原，它的細胞表面的配體能與受體T細胞表面的受體相互作用，這種T細胞表面的受體介導了接觸依賴性輔助效應物功能；2)一種拮抗劑，它能夠拮抗存在於受體T細胞表面的分子，此分子介導了接觸依賴性輔助效應物功能。這種拮抗劑抑制了T細胞上的分子與同種或異種細胞上的配體之間的相互作用。
在優選實施方案中，受體T細胞表面介導接觸依賴性輔助效應物功能的受體分子是gp39。在此實施方案中，拮抗劑是一種分子，它抑制了T細胞上的gp39與同種或異種細胞上gp39配體相互作用。一個特別優選的gp39拮抗劑是抗-gp39抗體。在另一實施方案中，gp39拮抗劑是gp39配體的一種可溶形式，如可溶性的CD40。給予受體的同種或異種的細胞優選淋巴樣細胞，比如B細胞。同種或異種細胞也可選擇小的靜止期的B細胞。同種或異種細胞和拮抗劑(如抗gp39抗體)一般在移植組織和器官進入受體以前施予受體。例如在移植組織和器官進入受體以前，把從組織或器官的供體中取得的淋巴樣細胞(如B細胞)與拮抗劑一起給予受體。
本發明的方法能被用於誘導T細胞對移植的組織和器官的耐受，例如肝、腎、心臟、肺、皮膚、肌肉，神經組織、胃和腸。在一實施方案中，移植的組織包括胰島。因此，本發明提供了一種治療糖尿病的方法，包括給予需要治療的受體1)表達供體抗原的同種或異種的細胞；2)一種受體T細胞其表面受體的抑制劑，此T細胞表面受體可以介導接觸依賴性輔助效應物功能，抑制劑例如gp39抑制劑(如抗-gp39抗體)；3)供體胰島。附圖簡述

圖1是圖解描述在化學性糖尿病小鼠中移植的胰島同種移植物的存活，此小鼠或單獨用抗-gp39抗體預處理或者單獨用全部或部分同種脾細胞預處理。
圖2是圖解描述在化學性糖尿病小鼠中，通過血漿葡萄糖濃度的降低來測定移植胰島同種移植物的存活，此小鼠用單一劑量的部分同種的脾細胞和抗gp39抗體提前處理2周(A組)或者7周(B)組，每條曲線示得自一個獨立的小鼠的數據開放的符號表明在受體內胰島同種移植物自發失敗，閉合的符號表明小鼠的胰島移植物在實驗結束時是有功能的。
圖3A、B和C是流式細胞計數輪廓圖，它說明了用CD40Ig(A組)或mAb4D9-8(B組)或mAb4D9-9(C組)來染激活6小時的人外周血淋巴細胞。
圖4A，B和C是流式細胞計數輪廓圖，它說明了用mAb4D9-8(A組)或mAb4D9-9(B組)或CD40Ig(C組)來染培養在加有環孢黴素A(cycloporinA)的激活6小時的人外周血淋巴細胞。
圖5A和B是流式細胞計數輪廓圖，它說明了在加有未標記的mAb4D9-8(A組)或未標記的mAb4D9-9的條件下，用CD40Ig來染激活6小時的外周血淋巴細胞。
圖6是圖解描述當細胞培養於加有抗人gp39mAbs4D9-8，4D9-9，24-31，24-43，89-76或89-79時，用gp39和I2-4來誘導的B細胞增殖的抑制。
圖7是圖解描述當細胞培養於加有抗人gp39mAbs24-31或89-79時，同種特異性混合淋巴細胞反應的抑制。發明詳述本發明的特色是該方法為在移植接受體內，體內誘導T細胞對供體組織或器官移植物耐受。此方法包括給予移植接受體1)一種同種或異種的細胞，它表達供體抗原，其細胞表面的配體能與接受體T細胞表面介導接觸依賴性輔助效應物功能的受體相互作用；2)一種拮抗劑，它通過拮抗T細胞表面受體來抑制配體與受體的相互作用。這裡所用的術語「接受體」指的是組織和器官移植物將要、正在或已移植入的接受治療者。本文所定義的「同種細胞」是從和接受體同種的不同個體中獲取的，它表達的「同種抗原」不同於由接受體細胞表達的抗原，「異種細胞」是從和接受體異種的個體中獲取的，它表達的「異種抗原」不同於由接受體細胞表達的抗原。這裡所用的術語「供體抗原」指的是移植到接受體內的供體組織或器官移植物所表達的抗原。供體抗原依據移植物的來源可以是同種抗原或異種抗原，給予接受體的同種或異種細胞，做為耐受制度的一部分，表達供體抗原，比如表達呈現於移植的供體組織或器官的部分或全部相同的抗原。同種或異種的細胞優選地從組織或器官移植物的供體中獲取，但也可以從與供體有相同的抗原決定簇的一個或更多來源中獲取。
除了同種或異種的細胞，做為耐受制度的一部分，T細胞上介導接觸依賴性輔助效應物功能的分子的拮抗劑也給予接受體。這裡所定義的介導接觸依賴性輔助效應物功能的分子或受體是指表達於Th細胞上並與效應物細胞(如B細胞)上的配體相互作用的分子或受體，這裡所說的分子與其配體相互作用對於產生效應物細胞反應(如B細胞激活)是必需的。除了參與效應物細胞反應外，目前已經發現這些分子或受體還參與了T細胞對抗原的反應。優選的，T細胞上介導接觸依賴性輔助效應物功能的分子是gp39。因此，在優選實施方案中，本發明的方法包括給予移植接受體同種或異種細胞和gp39拮抗劑。由同種或異種細胞來激活接受體T細胞包括接受體T細胞上gp39和同種或異種細胞上gp39配體的相互作用。通過用gp39的拮抗劑來抑制此相互作用，接受體的T細胞就不能被同種或異種細胞所表達的供體抗原所激活，而是對供體抗原耐受。在接受體中誘導對供體抗原的耐受則使得供體組織或器官移植成功，而沒有免疫介導的供體移植物的排斥。
本發明的各個方面在下列小節中被更詳細說明。I.gp39拮抗劑依據本發明的方法，gp39拮抗劑施用於接受體，來幹擾接受體T細胞上gp39與給予接受體的同種或異種細胞如B細胞上的gp39配體相互作用。gp39的拮抗劑被定義為幹擾這種相互作用的一種分子。gp39的拮抗劑可以是gp39的抗體(如gp39的單克隆抗體)，gp39抗體的片段或衍生物(如Fab或F(ab)』2片段，嵌合性抗體或人源化抗體)gp39配體的可溶形式(如可溶性CD40)，gp39配體的融合蛋白的可溶形式(如可溶性CD40Ig)，或能分解或幹擾gp39-CD40相互作用的藥劑。A.抗體哺乳動物(如小鼠、倉鼠或家兔)用gp39蛋白或蛋白片段(如多肽片段)的免疫原性形式來免疫，以誘導抗體反應。表面表達gp39的細胞也可以做為免疫原。另一種免疫原包括純化的gp39蛋白或蛋白片段。通過標準的純化技術，gp39可以從表達gp39的細胞中純化出來。此外，gp39的cDNA(Armitage等，《自然》，35780-82(1992)；Lederman等，《實驗醫學雜誌》，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh等，《歐洲分子生物學組織雜誌》，114313-4319(1992))也能在宿主細胞中表達，例如細菌或哺乳類細胞系，通過標準技術， gp39蛋白能從細胞培養物中純化出來。此外，利用已知技術(如F-moc或T-moc化學合成)，gp39多肽依據gp39的胺基酸序列可以合成(說明見於Armitage等，《自然》，35780-82(1992)；Lederman等，《實驗醫學雜誌》，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh等《歐洲分子生物學組織雜誌》，114313-4319(1992))給蛋白授予免疫原性的技術包括與載體的結合或此領域已熟知的其它技術。例如，蛋白在佐劑存在下被給藥。通過檢測血清或血漿中抗體的效價來監視免疫過程的發展。標準ELTSA或其它免疫學測定法與免疫原如抗原一起被用來估計抗體的水平。
免疫作用後，可以得到抗血清，如果想要的話，從血清中可以分離多克隆抗體，為了產生單克隆抗體，抗體產生細胞(淋巴細胞)從被免疫的動物中收穫，通過標準體細胞融合技術與骨髓瘤細胞融合，然後使這些細胞不死，產生雜交瘤細胞。此技術在本領域內是熟知的，例如，最初由Kohler和Nilstein所發展的雜交瘤技術(《自然》(1975)256495-497)以及別的技術，比如人B細胞雜交瘤技術(Kozbar等，《今日免疫學》，(1983)472)，EBV-雜交瘤技術來生產人單克隆抗體(Cole等，《腫瘤治療中的單克隆抗體》(1985)(Allen R Bliss.Inc.77-96頁)，和篩選結合的抗體文庫，(Huse等，《科學》(1989)2461275)。雜交瘤細胞可用免疫化學篩選以產生能與蛋白或多肽特異性反應的抗體，單克隆抗體被分離。
這裡所用的術語抗體也包括其片段，此片段與gp39蛋白或其多肽或gp39融合蛋白特異性反應。能應用傳統技術將抗體片段化，片段能夠與上述的完整抗體以同樣方式被篩選應用，例如，用胃蛋白酶處理抗體產生F(ab』)2片段，得到的F(ab』)2片段被處理以減少二硫鍵來產生Fab』片段。本發明的抗體進一步還包括有抗gp39部分的雙特異性的和嵌合的分子。
當在非人類實驗體中產生的抗體被治療性地用於人類時，它們被作為外來物不同程度被識別，在病人中可能產生免疫反應。減少或去除此問題的方法是生產嵌合的抗體衍生物，該方法對一般的免疫抑制是可取的如抗體分子是由非人類動物的可變區域和人類的穩定區域聯合組成。嵌合的抗體分子包括，比如從小鼠、大鼠或其它種的抗體而來的抗原連結區和人的穩定區。製造嵌合抗體的許多方法已被說明，並且能夠用於製造含有免疫球蛋白可變區域的嵌合抗體，此抗體識別gp39。例如，Morrison等，《美國國家科學院院刊》，816851(1985)；Takeda，等，《自然》314452(1985)，Cabilly等，U.S.Patent No.4,816,567Boss等，U.S.Patent No.4,816,397；Tanaguchi等，歐洲專利公開EP171496；歐洲專利公開0173494，英國專利GB2177096B。期望這些嵌合抗體在人體中比相應的非嵌合抗體會少一些免疫原性。
為了人類治療的目的，特異性與gp39蛋白或多肽反應的單克隆或嵌合抗體通過產生人的可變區域嵌合體被進一步人源化，其中嵌合體中，可變區的部分，尤其是抗原連結區域的保守框架結構區域是人類來源的，只有超變區是非人類來源的。此種變化的免疫球蛋白分子可以通過本領域已知的幾種技術中的任一個被製造，(例如Teng等，《美國國家科學院院刊》，807308-7312(1983)；Kozbor等，《今日免疫學》，47279(1983)；Olsson等，《酶學方法》，923-16(1982))，更優選地可以依據PCT公開WO92/06193或者EP0239400上的指導來製造。人源化的抗體能被商業性地生產，例如Scotgen Limited，2 HollyRoad，Twickenham，Middlesex，Great Britain。
產生能與gp39蛋白或多肽反應的特異性抗體或抗體片段的另一方法是用gp39蛋白或多肽來篩選表達於細菌內的表達文庫，該文庫編碼免疫球蛋白基因或其部分。例如，完整的Fab片段，VH區域和FV區域能夠用噬菌體表達文庫表達於細菌內。例子見於Ward等，《科學》，341544-546(1989)；Huse等，《科學》，2461275-1281(1989)；和Mc Cafferty等，《自然》，348552-554(1990)。用例如gp39多肽來篩選此文庫可以確定與gp39反應的免疫球蛋白片段。另外，SCID-hu小鼠(從Genpharm獲得)也能用來生產抗體或其片段。
生產gp39，包括人gp39和鼠gp39單克隆抗體的方法學和本發明方法中所用的適宜的單克隆抗體在實例2中進一步作詳盡說明。
本發明的抗人gp39單克隆抗體被優選用於誘導抗原特異性T細胞耐受。優選的抗體包括單克隆抗體3E4，2H5，2H8，4D9-8，4D9-9，24-31，24-43，89-76和89-79，在實例2中將被說明。尤其優選的抗體是單克隆抗體89-76和24-31。分別產生89-76和24-31抗體的89-76和24-31雜交瘤在Budapest條約的規定下，於1994年9月2號貯存於美國典型培養物保藏中心，Parklawn Drive，Rockville，Md，89-76雜交瘤被指定為ATCC，登記號HB11713，24-31雜交瘤被指定為登記號HB11712。24-31和89-76抗體是IgG1同型。
在另一實施方案中，用於本發明的方法中的抗人gp39mAb結合一個表位，此表位可以被選自3E4，2H5，2H8，4D9-8，4D9-9，24-31，24-43，89-76和89-79的單克隆抗體識別。更優選地，抗人gp39單克隆抗體結合一個由單克隆抗體24-31或89-76所識別的表位。一個mAb結合到一個由前面提到的任一抗體識別的表位的能力可通過標準交叉競爭試驗來確定。例如一種抗體，它結合的表位與mAb24-31所識別的表位相同，則該抗體會競爭標記的24-31同已被激活的T細胞的結合，而如果一個抗體結合的表位不同於mAb24-31所識別的表位，則該抗體不會競爭標記的24-31同已被激活T細胞的結合。B. 可溶性gp39配體其它被施用以誘導T細胞耐受的gp39拮抗劑包括gp39配體的可溶形式。單一效價的gp39可溶性配體，如可溶性CD40，能夠與gp39連結，因此抑制了gp39與B細胞上CD40的相互作用。術語「可溶的」指的是配體並非永久性結合到細胞膜上。可溶的gp39配體可以通過化學合成來製備，或優選地通過重組DNA技術來製備，例如通過只表達配體細胞外的區域(缺少跨膜和細胞質區域)。優選的可溶性gp39配體是可溶性CD40。此外，可溶性gp39配體可以是融合蛋白的形式，此融合蛋白包括至少gp39配體的一部分，此部分附著於第二種分子上，例如CD40與免疫球蛋白被做為融合蛋白表達(如CD40Ig融合蛋白)。在一實施方案中，融合蛋白的生產，包括CD40細胞外區域部分的胺基酸殘基被連結到免疫球蛋白重鏈例如Cr1的對應於鉸鏈CH2和CH3區域的序列的胺基酸殘基上，來形成CD40Ig融合蛋白(見Linsley等(1991)《實驗醫學雜誌》，1783721-730；Capon等，(1989)《自然》337，525-531；和Capon U.S.5,116,964)。融合蛋白可以通過化學合成來生產，或優選地依據CD40的cDNA通過重組DNA技術來生產(Stamenkovic等，《歐洲分子生物學組織雜誌》，81403-1410(1989))。II. 誘導抗原特異性耐受用的細胞本發明是依據，至少是部分依據此發現，即在gp39拮抗劑存在時，由同種細胞呈遞同種抗原給T細胞則誘導了T細胞對同種抗原的耐受。由此機制誘導耐受的細胞包括那些呈遞抗原組通過與gp39相互作用來激活T細胞的細胞，(即T細胞上gp39與呈遞的細胞上的gp39配體的相互作用對於傳遞適宜於T細胞激活的信號給T細胞是必須的)。抑制同種或異種細胞上的配體與接受體T細胞上gp39的相互作用阻止由同種或異種抗原引起的T細胞激活，這樣，誘導了T細胞對抗原的耐受。通過gp39幹擾T細胞的激活也可以阻止同種細胞或異種細胞上共刺激分子的誘導(如B細胞上B7家族分子)，這樣在缺少共刺激信號時細胞只傳遞抗原信號給T細胞，誘導了耐受。
因此，在發明的方法中，同種或異種的細胞被給予接受體受治療者。同種或異種的細胞能夠呈遞抗原給受體的T細胞，例如B淋巴細胞，「職業性」的抗原呈遞細胞(如單核細胞，樹突狀細胞，郎格爾漢細胞)或其它呈遞抗原給免疫細胞的細胞(如角化細胞、內皮細胞、星形細胞、成纖維細胞、少突神經膠質細胞)。而且，更優的是，同種或異種的細胞有一種減弱的在接受體T細胞中刺激產生共刺激信號的能力。例如，同種或異種的細胞可以不表達，或只低水平表達共刺激分子如蛋白B7家族(如B7-1和B7-2)。用於本發明方法中的可能的同種細胞或異種細胞上共刺激分子的表達能夠通過標準技術來估測，例如用共刺激分子的抗體進行流式細胞計數。
誘導T細胞耐受優選的同種或異種的細胞是淋巴樣細胞，例如外周血淋巴細胞，或脾細胞。誘導T細胞耐受的優選淋巴樣細胞是B細胞。通過標準的細胞分離技術，B細胞可以從混合的細胞群體中純化出來(如外周血或脾中其它細胞類型)，例如把脾細胞培養於塑料平皿中粘附性細胞被去除，重新獲得非粘附性細胞。用抗T細胞抗體(如抗Thy1.1和/或Thy1.2)和補體處理，T細胞可以從混合的細胞群體中去除。在一實施方案中，靜止期的淋巴樣細胞，優選地用靜止期B細胞做為抗原呈遞細胞。通過本領域已知技術，靜止期的淋巴樣細胞，例如靜止期的B細胞依據它們較小的大小和密度能夠被分離出來。通過例1所說明的對流離心淘洗，靜止期的淋巴樣細胞能夠分離出來。應用對流離心淘洗，通過收集在14-19ml/min的級分，優選19ml/min(3,200rpm)級分，小的、靜止期的淋巴樣細胞群體可以獲得，此群體中排淨了能夠激活T細胞反應的細胞。此外，通過不連續密度梯度離心比如用Ficoll或Percoll梯度，小的靜止期的淋巴細胞(如B細胞)能被分離，離心後一層含有小的靜止期的淋巴細胞能被獲取。通過標準技術(如免疫螢光)檢測激活B細胞表面共刺激分子如B7-1和B7-2的表達，小的靜止期的B細胞也能從激活的B細胞中區分出來。
施予接受體的同種或異種的細胞的功能是，至少部分呈遞供體抗原給接受體T細胞。這樣，供體組織或器官所表達的抗原在細胞中也表達。典型地，這可以用從組織或器官移植物的供體中獲取的同種或異種的細胞來完成。例如，從組織或器官供體中來源的外周淋巴樣細胞，B細胞或脾細胞能被分離並用於本發明的方法中。此外，同種或異種的細胞也能從除了組織或器官的供體之外的來源獲取，只要細胞與組織或器官的供體有相同的抗原決定簇。例如與供體組織或器官表達相同的主要組織相容性複合物抗原的同種或異種的細胞能被使用，這樣從組織或器官的供體有著MHC單倍型相匹配的來源而來的同種或異種的細胞可以被使用(如移植供體的近親)。III.細胞和gp39拮抗劑的施用依據本發明，通過給移植接受體施用gp39拮抗劑和同種或異種的細胞，此細胞表達供體抗原，並通過gp39與受體T細胞相互作用，這樣可誘導了T細胞對組織或器官移植物的耐受。在優選的實施方案中，同種或異種的細胞和gp39拮抗劑被同時給予接受體。另一可選擇的方法是在給予同種或異種細胞之前，gp39拮抗劑被給予受體，例如當gp39拮抗劑是一個有著長的半衰期的抗體。在優選的實施方案中，拮抗劑和同種或異種的細胞在組織或器官移植進接受體之前給予受體。(即受體用拮抗劑和細胞提前處理)。例如給予同種或異種的細胞和拮抗劑可以在組織或器官移植之前幾天(如5-8天)進行。
給予單劑量的同種的細胞同拮抗劑一起已發現足夠誘導T細胞對供體組織或器官的耐受(見例1)給予細胞的數目依據所用細胞類型、組織或器官移植物類型，接受體的重量，接受體總的條件，以及熟練的技術人員已知的其它變量而變化。用於本發明方法中的適宜的細胞數可以通過本領域中一個普通技術人員，通過傳統的方法來確定(例如例1中所描述的)細胞以有利於在接受體中誘導T細胞耐受的方式和路徑被給予。細胞可以在生理的可接受的溶液中給予受體，象緩衝鹽溶液或類似載體。優選地細胞可以靜脈注射給接受體。
在適宜於體內給藥的生物相容的形式內，本發明的拮抗劑給予受試驗體以誘導T細胞耐受。「適宜於體內給藥的生物相容的形式」意味著給予拮抗劑的一種形式，其中形式內，任何毒性效應不超過此化合物治療的效應。術語受試驗體包括在其體內免疫反應可以被誘導的活的有機體如哺乳動物，受試驗體的例子包括人、狗、貓、小鼠、大鼠、和其轉基因種屬。gp39拮抗劑能夠以任何藥理學的形式，可選擇和藥用載體一起被給予。拮抗劑治療活性量的給予定義為在劑量和必須的一段時間內，取得想要結果(如T細胞耐受)的有效量。例如，gp39的拮抗劑的治療活性量可能依據下列因素而變化，例如疾病的狀態、年齡、性別、個體重量和拮抗劑在個體內誘導預期反應的能力。為了產生理想的治療反應，劑量可以調整。例如，幾個分開的劑量可以每日給藥，或依據治療情況的緊急狀態所顯示的量，把劑量成比例降低。就象例1中所說明的用抗gp39抗體來治療，一個有效的治療制度包括在組織或器官移植前(如5-8天)開始給予抗體，接著在移植後幾周內(如2-7周)再次給予抗體(如每隔一天)。
有活性的化合物(例如拮抗劑如抗體)可以以方便的方式給藥，例如注射(皮下的，靜脈的等等)，口服給藥，吸入給藥，經皮膚給藥或直腸給藥。依據給藥的途徑，有活性的化合物可以包裹在一種物質內防止化合物遭受可以使此化合物失活的酶，酸或其它自然條件的作用。優選地給藥途徑是靜脈注射。
除去胃腸道外給藥，要給予gp39的拮抗劑，則有必要用一物質包裹拮抗劑或與拮抗劑共同給藥以防止它的失活。例如拮抗劑能在合適的載體或稀釋劑中與酶的抑制劑共同給藥，或在合適的載體如脂質體中給予個體。藥用稀釋劑包括鹽以及水性的緩衝溶液。酶的抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑，二異丙基氟代磷酸酯(鹽)(DEP)和抑肽酶。脂質體包括在水中的油包水乳液以及傳統的脂質體(Strejan等，(1984)《神經免疫學雜誌》727)。
有活性的化合物也可以胃腸道外或腹膜內給藥。膠體溶液也可製備於甘油、液體聚乙二醇、其混合物和油中。在通常的貯存和使用條件下，這些製備物可以含有防腐劑以防止微生物的生長。
適用於注射用的藥用組合物包括無菌水溶液(水溶的)或膠體溶液、和無菌粉末，這些粉末用於當場製備無菌注射溶液或膠體溶液。在所有情況下，組合物必須無菌，並且必須具有一定程度的流動性到以使之易於注射。在生產和貯存的條件它必須是穩定的，必須能夠在保存時防止微生物象細菌和真菌的汙染作用。載體可以是溶劑或膠體介質，含有例如水，乙醇、多聚醇(如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇和此類物質)及其適宜的混合物。通過使用包膜如卵磷脂，或在膠體溶液的情況下保持所需顆粒大小，或使用表面活性劑可以保持合適的流動性。通過各種抗細菌和抗真菌藥劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸(asorbic acid)，乙基汞硫代水楊酸鈉等等可以防止微生物的作用。在許多情況下，更可取的是在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，和氯化鈉。通過在組合物中加入延緩吸收的藥劑，如一硬脂酸鋁和白明膠，能使注射組合物的吸收延長。
無菌注射溶液也能如此製備，把在適宜溶劑中的所需量的活性化合物(如gp39拮抗劑)與上面所例舉的一個或多種成份混合，然後按照需要過濾除菌。總的來說，膠體溶液的製備是通過把活性化合物混入一無菌載體，此載體含有基本的膠體介質和上面所枚舉的所需的其它成份。如果是製備無菌注射溶液的無菌粉末，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，這些方法可從以前無菌過濾的溶液中產生一種粉末，包含活性成份(如拮抗劑)及任何所需的其它的添加成份。
當活性化合物按上面描述被適宜保護時，蛋白也可以和惰性稀釋劑或可吸收載體一起口服給藥。這裡所用的「藥用載體」包括所有溶劑，膠體溶液介質，外包膜，抗細菌和真菌藥劑，等滲劑和吸收延緩劑等等。對於藥學活性物質的這些介質和藥劑的使用在本領域內是眾所周知的。除非一些常規的介質和藥劑與活性化合物不相容，都要考慮在治療組合物中使用這些物質。輔助活性化合物也可以摻入組合物中。
為了易於給藥和劑量的統一，以劑量單位形式形成胃腸外組合物是尤其有利的。這裡所用的劑量單位形式是指物理的獨立的單位，適於做為需要治療的哺乳動物的單元劑量，每一單位含有已確定的活性化合物數量，此數量已被計算能夠和所需的藥用載體一起產生想要的治療效應。本發明中劑量單位形式的規格決定於或直接依賴於(a)活性化合物獨特的特徵和所要達到的特定治療效果，(b)化合物領域中內在的限制，如在個體敏感性治療中用到的這種活性化合物的限制。
繼這裡所說明的耐受制度之後，或與之同步，用傳統技術，將供體的組織或器官移植入接受體中。IV 發明方法的使用發明的方法可以應用到組織和器官移植的廣大範圍內。此方法可用於在組織或器官移植的接受體中誘導T細胞耐受，如胰島、肝、肺、腎、心臟、皮膚、肌肉、神經組織、胃和腸。因此發明的方法能用於治療必須移植組織或器官的疾病或情況(如肝移植治療血膽固醇過多，移植骨骼肌細胞治療骨骼肌營養障礙，移植神經組織治療亨廷頓疾病或帕金森氏病等等)。在一優選的實施方案中，移植的組織包括胰島，相對應地，本發明中包括一種方法，可通過胰島移植來治療糖尿病。這種方法包括給予需要治療的受試驗體1)表達供體抗原的同種或異種的細胞，2)對一種分子的拮抗劑，此分子表達於接受體T細胞上並介導接觸依賴性輔助效應物功能，如gp39的拮抗劑(比如抗-gp39抗體)3)供體胰島細胞，優選地，在給予胰島之前，給予接受體以同種或異種的細胞和拮抗劑。
發明通過下列例子被進一步說明，這些例子不應該理解為一種限制。在整個應用中所引用的所有文獻、專利和公開的專利申請的內容都在此引入做為參考。實施例1用同種細胞和抗-gp39處理接受體以誘導其對胰島同種移植物的耐受當前同種移植物的研究依靠非特異去除免疫效應物功能而產生全身免疫抑制。然而免疫抑制藥物能引起顯著的副作用。此外，郎格爾漢斯細胞的胰島的同種移植物用於治療糖尿病對此方法已證實是無效的(見例Robertson，R.P(1992)《新英格蘭醫學雜誌》327，1861)應用T細胞的直接抗體來治療，在齧齒動物中也可以成功地同種移植胰島，但此方法也同樣會導致全身免疫抑制(Carpenter，C.B(1990)《新英格蘭醫學雜誌》322，1224，Roark，J.H等(1992)《移植》54，1098；Kahan，B.D.(1992)《當前免疫學見解》(Curr.OpionImmunol)4，553)在本實施例中，通過操縱呈遞同種抗原給接受體T細胞以防止它們被激活，而在移植接受體中誘導對胰島同種移植物的耐受。胰島同種移植物在化學性糖尿病(57BL/6(H-2b)小鼠中的存活用下面的方法來檢測。糖尿病的誘導通過靜脈注射鏈尿黴素(Strepto gotocin)(140mg/kg)，使得雄性C57BL/6J(H-2b)小鼠產生糖尿病，一周時間內有3次隨機機會中顯示血漿葡萄糖濃度≥400mg/dl。證明其為永久性糖尿病。同種脾細胞的分級分離用於預處理移植接受體的供體同種細胞是從(C57×BALB/c)(H-2B/d)雜交F1代動物中獲取的，以防止移植物抗宿主的疾病。為了分離小淋巴細胞，來源於8周齡(C57×BALB/C)雜交F1代雌鼠中的脾細胞懸浮液去除紅細胞，然後如下的方法用淘洗法進行大小分級分離H.P等(1985)《實驗醫學雜誌》761，223，和Gosselin E.J等(1988)《免疫學雜誌》140，1408。簡言之，小淋巴細胞通過對流離心淘洗得到分離，例如用J-6B型離心(Beckman Instruments，Palo Alto CA)。存在於帶有1.5％的胎牛血清的8毫升培養基或平衡鹽溶液中的大約1-5×108細胞用脫氧核糖核酸酶處理，放入淘洗小室，開始對流速度為13.5ml/min，在4℃下以3,200rpm速度旋轉。儘管精確的流速依賴於懸浮細胞的介質，一個幾乎不帶有任何大細胞的小細胞級分一般在14-19ml/min得到洗脫，其中說明的本實驗中，小細胞級分在19ml/min(3200rpm)處收集，當用對兔IgG和H2d或對H2b(D10.G4)有同種反應的T細胞系來檢測時，此級分已被完全去除了輻射抵抗性(3000rads)輔助細胞功能，在尾靜脈注射到同種移植物接受體之前，小細胞和未分級細胞在無血清培養基中洗滌兩次。大約使用了40-100×106(C57×BALB/c)F1(H-2b/d)淘洗過的小的脾細胞。移植接受體的預處理移植接受體用未分級的(C57×BALB/c)F1(H-2b/d)同種脾細胞，或用淘洗的去除了APC活性(按上述說明分離)「19級分」小直徑脾細胞，抗-gp39單克隆抗體(MR1見例2，實驗3)或同種細胞和抗-gp39抗體的組合來預處理。19級分細胞用兩個不同劑量範圍來實驗，低劑量40-44×106細胞或高劑量77-88×106細胞。對照動物既不接受同種細胞也不接受抗體處理。同種細胞在胰島同種移植物移植前5-8天通過尾靜脈注射給予移植接受體，MR1抗體處理是在胰島移植前7天，以每周2次，每次劑量為250μg/每隻小鼠，連續處理2-7周或直至移植失敗。抗體的第一次注射一般和同種脾細胞的第一次注射在同一天。胰島同種移植物移植通過已作改良的膠原酶消化方法(Gottlieb，PA等(1990)《糖尿病》39，643)使同種BALB/c(H-2d)胰島得到分離，分離後，胰島以30個小島/每克體重的劑量立即移植進受體C57B1/6J(H-2b)小鼠的直腸下的被膜內，移植物的成活定義為血漿葡萄糖的濃度維持在≤200mg/dl。結果在第一組實驗中，胰島同種移植物接受體或者單獨用同種脾細胞或者用抗gp39抗體預處理。就象圖1所顯示的，在缺少脾細胞預處理的情況下，所有的胰島同種移植物在移植的13天內遭到排斥(9±2天，範圍5-13天；N＝23)。同樣，只用含有正常APC活性的未分級的脾細胞(6±3天，範圍4-12天，N＝7)或低劑量的(40-44×106細胞)去除了APC的級分19脾細胞(7±3天，範圍3-14天，N＝16)處理動物，也很少能觀察到胰島的生活。相反，注射了高劑量的去除了APC的級分19小的脾細胞(75-88×106細胞)延長了同種移植物的成活(19±10d，範圍7-40天；N＝16)，對移植物成活時間的延長的影響有著統計的顯著性(當與無任何東西、全部脾細胞，或低劑量的級分19脾細胞處理的小組相比較，F3.58＝17.3p＜0.001)，但此影響並不持久。在用去除APC的級分19小細胞處理的糖尿病接受體中，同種胰島延長但有限的成活表明，單獨這些細胞不能維持同種移植物的成活。另一組移植接受體用77-88×106個級分20細胞處理。這個級分也含有絕大多數的小淋巴細胞，但不同於級分19細胞群體是其含有可檢測的APC功能，這些細胞的接受體(N＝6)全部迅速排斥它們的移植物(平均＝8.5天，範圍6-12)。另一組移植物接受體只用抗-gp39單克隆抗體MR1單獨處理。圖1表明，在只用抗gp39mAb處理的7/11小鼠中，在15天內同種胰島移植物死亡，剩餘的4隻小鼠在實驗結束時48天有移植物功能。此結果表明，單獨把抗-gp39抗體MR1給予接受體可以延長胰島同種移植物的成活(平均20-19天；範圍9-自由度N＝5)。延長的程度在統計學上類似於單獨用高劑量級分19的脾細胞所得到的結果，顯著長於其餘三組所得到的結果(p＜0.05)。
上面描述的一系列實驗表明，高劑量級分19的去除APC的脾細胞或抗gp39mAb單獨處理與無任何處理相比能加強胰島同種移植物的成活。但是兩者中任一種單獨處理都不能在接受體中有效誘導對胰島同種移植物的長期耐受。在下面一系列實驗中，同種脾細胞和抗gp39抗體聯合處理接受體。同種脾細胞和抗gp39抗體的聯合給藥被發現比任一單獨給藥更有效。圖2中所顯示的結果，其中，每一曲線代表從一個小鼠個體中獲取的資料。空心的符號代表胰島同種移植物自發失敗的接受體，實心的符號代表胰島在實驗結束時仍有功能的個體。圖2(B組)，表示一次注射級分19的去除APC脾細胞和用gp39mAb處理7周後在所有動物中取得移植物無限期存活(N＝6)通過降低抗gp39處理延續的時間來修改此方案，會減弱，但不消除移植物成活的良好效果。當抗-gp39mAb只連續兩周給藥，同時給予19組分脾細胞，在6/8受體中取得了無限期移植物成活(圖2，A組)在用抗gp39處理2或7周同時一次注射未分部同種脾細胞的接受體中，也可以觀察到移植物的無限期成活。
為了確定胰島移植物的功能並確定缺乏那些由沒有被鏈尿黴素破壞的天然的殘餘胰島分泌的胰島素，含有腎下移植物的腎被去除。在所有情況下，單側腎切除術在3天內產生了高血糖(＞300mg/dl)的再次發生。
無論移植失敗或在實驗最後，在所有動物中用組織學方法研究胰島同種移植物和天然的胰腺。在用分級的同種小淋巴細胞和連續的(7周)MR1mAb處理的受體的腎中，胰島同種移植物組織學切片表明在腎被膜下有大量可見的完整胰島，它缺少單核細胞的浸潤，含有完整顆粒狀胰島素和胰高血糖素陽性細胞。相反，在只單獨用抗gp39mAb處理的受體的腎中，胰島同種移植物組織學切片表明的特徵性密集的單核細胞炎症和伴隨的胰島細胞的破壞。在所有宿主的胰腺中，胰島的形態與鏈尿黴素糖尿病是一致的。實施例2抗gp39抗體的產生和特徵實驗1抗人gp39的抗體為了在人受試驗體中誘導抗原特異性的T細胞耐受，優選地給予抗人gp39抗體。下面的方法用於產生鼠抗人gp39單克隆抗體。Balb/c小鼠用存在於弗氏完全佐劑(CFA)中的可溶性gp39融合蛋白gp39-CD8來免疫。6周以後用存在於弗氏不完全弗氏佐劑(IFA)中的可溶gp39-CD8使小鼠接著被激發。第二次免疫4周以後，可溶性gp39-CD8以可溶性形式被給予。2周以後，小鼠被激活的人外周血淋巴細胞促進，再過2周後，被可溶性gp39-CD8最後一次促進，依照每個標準方法，在最後一次免疫的第4天，脾細胞與NS-1融合。
基於多次篩選過程，挑選出產生抗人gp39抗體的克隆。通過平板結合實驗用gp39-CD8來進行克隆的初次篩選，篩選出的陽性克隆接著用對照CD8融合蛋白，CD72-CD8來進行篩選，在CD8-CD72平板結合實驗中顯示陽性的克隆被除去，通過流式細胞計數分析，剩餘的克隆接下來在靜止期的和6小時激活的人外周血淋巴細胞(PBL)上篩選。可染色激活的而不是靜止期的PBL的雜交被認為是陽性。最後，檢測剩下的克隆的封閉CD40Ig結合同平板結合的gp39的能力。
在平板結合實驗中，最初被篩選出來的大約300個克隆是抗gp39CD8和CD72-CD8的，在這些克隆中，30個克隆被發現是檢測平皿連結的gp39而不是CD8接下來這些克隆被篩選檢測激活的外周血淋巴細胞上的gp39，大約15個克隆能在活化的外周血淋巴細胞上檢測到一個分子，在靜止的外周血淋巴細胞上則不能。通過決定克隆封閉CD40Ig檢測平板結合的gp39的能力，特異性進一步得到證實，其中實驗中，10個克隆中的3個被檢測到能封閉CD40Ig的結合。這三個克隆是3E4，2H5和2H8。這些克隆優選用於此處介紹的方法中。在激活的而非靜止的外周血淋巴細胞上檢測陽性的克隆也被篩選，篩選是通過其與活化的大鼠T細胞克隆，POMC8的反應性實現的。克隆2H8能與此大鼠T細胞系交叉反應。實驗2人gp39的抗體一個與實驗1類似的免疫方法用於生產另外的人gp39的抗體。Balb/c小鼠用存在於CFA中的可溶的gp39-CD8免疫，4周後用6小時活化的人外周血淋巴細胞激發，每一標準實驗方法中，在脾細胞和NS-1融合前4天，小鼠用可溶的gp39-CD8促進。通過流式細胞術檢測激活6小時的人外周血淋巴細胞的染色，來篩選雜交瘤克隆。染色激活的而非靜止的人外周血淋巴細胞的克隆被挑選，6個克隆，4D9-8，4D9-9，24-31，89-76，和89-79被挑選出來做進一步分析。
選出的克隆的特異性被下列幾個實驗證實。第一，流式血細胞計數分析表明，所有6個mAb都染激活的，而非靜止期的人外周血T細胞。(典型例子見圖3B和3C，描述了分別用4D9-8和4D9-9來染色激活的T細胞)，6種抗體中任一種所識別的分子的表達在激活4小時內是可檢測到的，激活後6-8小時之間的表達最大，激活後24小時則不能檢測到。所有mAb都識別表達在激活的CD3+外周血淋巴細胞上的一種分子，主要是CD4+表型，但一部分CD8+T細胞也表達此分子。6種mAbs所識別的分子的表達，就象gp39的表達一樣，被培養基中存在的環孢菌素A所抑制(典型的例子見圖4A和4B，描述了分別用4D9-8和4D9-9來染環孢菌素處理過的T細胞)，這些mAbs所識別的分子表達的動力學和分布與gp39的相同，gp39是用人CD40Ig融合蛋白來檢測。此外，6種mAbs都能封閉由CD40Ig來進行的gp39的染色(典型的例子見圖5A和5B，描述了分別在4D9-8和4D9-9存在下抑制了由CD40Ig來進行的gp39染色)。在ELISA實驗中，所有6種mAb都識別gp39-CD8，其為gp39分子的一種可溶的融合形式。而且，所有6種mAbs都能從35S-甲硫氨酸標記的激活的人外周血淋巴細胞中免疫沉澱一個大約36Kd的分子。此免疫沉澱的分子和由人CD40Ig融合蛋白沉澱的分子是相同的。
6種選出的mAbs(4D9-8，4D9-9，24-32，24-43，89-76和89-79)的功能活性照下列方法被檢測。首先，檢測mAbs抑制純化的人B細胞增殖的能力，此純化的B細胞培養於IL-4和可溶的gp39存在的條件下。在加有或不加劑量為0-125μg/ml的純化的單克隆抗體或CD40Ig條件下，用gp39和IL-4來培養純化的人B細胞，在培養中通過胸腺嘧啶的摻入，培養3天以後來確定B細胞的增殖。結果(顯示於圖6)表明6種mAbs都能抑制由gp39和IL-4所誘導的B細胞增殖，mAbs89-76和24-31在抑制誘導的B細胞增殖中最有效。
下一步，通過測量由抗CD3+激活的T細胞和IL-2所誘導的免疫球蛋白的產量，檢測mAbs抑制B細胞分化的能力。用FACS來陽性選擇，以此製備純化的IgD+人B細胞，此細胞在加有或不加劑量在0-10μg/ml純化的抗gp39單克隆抗體的條件下，用抗CD3激活的人T細胞(絲裂黴素C處理)和IL-2培養6天。第6天IgM、IgG和IgA的產量用ELISA檢測，結果(顯示於表1)表明，通過檢測IgM，IgG和IgA的產量，所有6種抗體都能抑制T細胞依賴的B細胞分化。
表1免疫球蛋白的產量小鼠抗體 μg/mlIgM IgG IgA- 17,500671044714D9-8 0.1 4813 213028191.0 4394 2558151910.01081 389 3964D9-9 0.1 3594 919 17311.0 2659 1233160610.0374 448 26624-31 0.1 3863 981 3441.0 1287 314 16510.01120 596 2324-43 0.1 6227 41324321.0 3193 213019210.07021 1232108189-76 0.1 3783 10693441.0 2180 352 17110.0818 551 1989-79 0.1 9763 192430211.0 2314 460 15610.0183 135 434為了檢查抗-gp39 mAbs對T細胞反應的影響，mAbs被引入標準的混合淋巴細胞反應(MLR)。300,000個人外周血淋巴細胞(應答者＝R)在加有或不加抗-gp39 mAbs(10μg/ml)的條件下同100,000個照射過的同種外周血淋巴細胞(刺激者＝S)一齊培養。培養物在4，5，6天時間用3H-胸腺嘧啶脈衝摻入，繼續培養18小時後收穫。通過測量MLR，所有6種抗人gp39都抑制同種特異的反應(典型例子見圖7，描述了R和S在加有24-31或89-76的條件下孵育時，同種特異性反應的抑制；CTLA4-免疫球蛋白融合蛋白和抗CD28 mAb做為陽性對照)。
為了確定6種mAbs在人gp39分子上是否識別獨特的表位，進行了交叉封閉實驗，激活的人外周血淋巴細胞首先用6種mAbs中的任一種封閉(25μg/ml未結合的抗體)洗滌細胞，然後用10μg/ml生物素結合的抗體染色，接著同植物赤蘚素(phytoerythrin)結合的親合素(PE-Av)反應。細胞的PE-Av染色用FACS來分析。結果顯示於表2中。表2封閉 抗體染色抗體4D9-84D9-924-31 24-43 89-76 89-79無 +++ +++ ++++++++++++ ++++4D9-8ND - ++++++++++++++4D9-9+++ ND +++ ++++++++++24-31++ ND +++ ++ ++24-43++ +++ ND ++ +89-76++ +++ +++ ND +++89-79+++ +++ +++ +++ND染色的強度和陽性細胞百分率用+號代表(++++＝MI＞200；+++＝MI＞125；++＝MI＞50；+＝MI＞25；-＝無高於背景的染色)，ND＝不確定。所有的抗體都封閉了CD40Ig同激活的人外周血淋巴細胞的結合。然而，表2中顯示的資料也清楚地表明一些抗體不能封閉別的抗體同激活的人外周血淋巴細胞的結合，說明它們識別位於人gp39分子上的不同表位。
分別產生89-76和24-31抗體的89-76和24-31雜交瘤，在Budapest條約的規定下於1994年9月2號貯存於美國典型培養物保藏中心Parklawn Drive，Rockville，Md.89-76雜交瘤被指定為ATCC增添新成員，序號HB11713，24-31雜交瘤被指定為ATCC增添的新成員，序號HB712。實驗3小鼠gp39抗體在本發明的一個實施方案中，gp39的拮抗劑是抗小鼠gp39的單克隆抗體， MR1。下列方法用於產生MR1單克隆抗體，也可以用於產生其它的抗gp39抗體。
倉鼠用5-106激活的Th1細胞(d1.6)腹腔內免疫，以周為間隔延續6周。當抗小鼠Th1的血清效價大於1∶10,000時，用聚乙二醇對免疫的倉鼠的脾細胞和NS-1進行細胞融合。通過對靜止期的和激活的Th1進行流式細胞術，篩選從含有生長的雜交瘤的孔中取出的上清。一個特定的雜交瘤，它能夠產生能選擇性識別激活的Th的Mab，此雜交瘤被進一步檢測並被亞克隆以產生MR1。MR1在腹水中產生，並通過離子交換HPLC純化。雜交瘤MR1貯存於美國典型培養物保藏中心，保藏號HB11048。類似方案那些在本領域中有經驗的人，僅僅用常規的試驗，就能發現或確定許多類似方案，它們類似於此處提及的本發明中的特定的實施方案。這些類似方案將被包括在下面的權利要求中。在整個應用中所引用的所有文獻和公開的專利申請的內容在此被引入作為參考。
權利要求
1.一種在組織或器官接受體中誘導對供體組織或器官的T細胞耐受的方法，它包括給予接受體a)表達至少一種供體抗原的同種或異種細胞，細胞表面有一個配體，該配體能與接受體T細胞表面的介導接觸依賴性輔助效應物功能的受體相互作用；b)T細胞表面受體的拮抗劑，它抑制配體和受體分子的相互作用。
2.權利要求1的方法，其中接受體T細胞表面介導接觸依賴性輔助效應物功能的受體分子是gp39。
3.權利要求2的方法，其中拮抗劑是抗-gp39的抗體。
4.權利要求3的方法，其中抗-gp39的抗體是單克隆抗體。
5.權利要求3的方法，其中抗-gp39抗體是抗人gp39的抗體。
6.權利要求4的方法，其中單克隆抗體是MR1。
7.權利要求4的方法，其中單克隆抗體是嵌合的單克隆抗體。
8.權利要求4的方法，其中單克隆抗體是人源化的單克隆抗體。
9.權利要求1的方法，其中同種或異種細胞是淋巴樣細胞。
10.權利要求9的方法，其中淋巴樣細胞是B細胞。
11.權利要求10的方法，其中B細胞是靜止期的B細胞。
12.權利要求1的方法，其中同種或異種細胞以及拮抗劑在組織或器官移植之前給予接受體。
13.權利要求1的方法，其中組織或器官包括胰島。
14.權利要求1的方法，其中組織或器官選自肝、腎、心臟、肺、皮膚、肌肉、神經組織和胃、腸。
15.一種在組織或器官的接受體中誘導對供體組織或器官的T細胞耐受的方法，其中包括給予接受體a)表達至少一種供體抗原的同種或異種細胞；和b)gp39的拮抗劑。
16.權利要求15的方法，其中gp39的拮抗劑是抗-gp39抗體。
17.權利要求16的方法，其中抗-gp39抗體是單克隆抗體。
18.權利要求16的方法，其中抗-gp39抗體是抗人gp39抗體。
19.權利要求17的方法，其中單克隆抗體是MR1。
20.權利要求17的方法，其中單克隆抗體是嵌合的單克隆抗體。
21.權利要求17的方法，其中單克隆抗體是人源化的單克隆抗體。
22.權利要求15的方法，其中gp39的拮抗劑是gp39配體的可溶形式。
23.權利要求22的方法，其中gp39配體的可溶形式是CD40融合蛋白。
24.權利要求15的方法，其中同種或異種細胞是淋巴樣細胞。
25.權利要求24的方法，其中淋巴樣細胞是B細胞。
26.權利要求25的方法，其中B細胞是靜止期B細胞。
27.權利要求15的方法，其中同種或異種細胞以及拮抗劑在組織或器官的移植之前給予接受體。
28.權利要求15的方法，其中組織或器官包括胰島。
29.權利要求15的方法，其中組織或器官選自肝、腎、心臟、肺、皮膚、肌肉、神經組織、胃和腸。
30.一種治療糖尿病的方法，它包括給予需要治療的受試驗者a)表達至少一種供體抗原的同種或異種細胞；b)gp39的拮抗劑；c)供體胰島細胞。
31.權利要求30的方法，其中抗-gp39抗體是單克隆抗體。
32.權利要求30的方法，其中抗-gp39抗體是抗人gp39抗體。
33.權利要求31的方法，其中單克隆抗體是MR1。
34.權利要求31的方法，其中單克隆抗體是嵌合的單克隆抗體。
35.權利要求31的方法，其中單克隆抗體是人源化的單克隆抗體。
36.權利要求30的方法，其中gp39的拮抗劑是gp39配體的可溶形式。
37.權利要求36的方法，其中gp39配體的可溶形式是CD40融合蛋白。
38.權利要求30的方法，其中同種或異種細胞是淋巴樣細胞。
39.權利要求38的方法，其中淋巴樣細胞是B細胞。
40.權利要求39的方法，其中B細胞是靜止期的B細胞。
41.權利要求30的方法，其中同種或異種的細胞以及拮抗劑在胰島細胞移植之前給予接受體。
42.一種在組織或器官的接受體中誘導對供體組織或器官的T細胞耐受的方法，其中包括給予接受體a)供體同種細胞；b)抗gp39抗體，其中供體同種細胞以及抗-gp39抗體在組織或器官移植之前給予接受體。
43.權利要求42的方法，其中抗-gp39抗體是單克隆抗體。
44.權利要求42的方法，其中抗-gp39抗體是抗人gp39的抗體。
45.權利要求43的方法，其中單克隆抗體是MR1。
46.權利要求44的方法，其中單克隆抗體是嵌合的單克隆抗體。
47.權利要求44的方法，其中單克隆抗體是人源化的單克隆抗體。
48.權利要求42的方法，其中供體同種細胞是淋巴樣細胞。
49.權利要求48的方法，其中淋巴樣細胞是B細胞。
50.權利要求49的方法，其中B細胞是靜止期的B細胞。
全文摘要
一種在移植接受體中誘導對組織或器官移植物的T細胞耐受的方法被揭示。該法包括給予受實驗者1)同種的或異種的細胞，這些細胞可表達供體抗原，並在其表面有一種配體，此配體可同接受體T細胞表面上的介導接觸依賴性輔助效應物功能的受體相互作用；和2)一種能抑制配體同受體相互作用的受體的拮抗劑。在一個優選實施方案中，同種或異種細胞是B細胞，優選靜止期B細胞，T細胞表面的介導接觸依賴性輔助效應物功能的分子是gp39。優選的gp39的拮抗劑是抗-gp39抗體。同種細胞或異種細胞和gp39拮抗劑典型的是在組織或器官移植前施用於移植接受體。本發明中的方法可用來誘導對諸如下列移植物的T細胞耐受肝、腎、心臟、肺、皮膚、肌肉、神經組織、胃和腸。一種用來治療糖尿病的方法也被揭示，該法包括給予受實驗者以能表達供體抗原的同種或異種細胞，gp39的拮抗劑及胰島。
文檔編號A61P37/00GK1150760SQ95193562
公開日1997年5月28日 申請日期1995年4月25日 優先權日1994年4月25日
發明者R·J·諾爾, F·H·杜裡, D·C·帕克, M·C·阿佩爾, N·E·菲利普斯, J·P·莫迪斯, D·L·格倫尼埃, A·A·羅辛尼 申請人:達特茅斯學院理事, 麻薩諸塞州大學醫學中心