奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗及其製備方法

2023-05-09 15:44:06 2

專利名稱：奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗及其製備方法，特別是 經基因定點缺失的奶牛大腸桿菌重組工程菌乳房炎滅活疫苗(稱奶牛大腸桿菌乳房炎滅 活疫苗，又稱X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗)製備方法，用於大腸桿菌感染性奶牛乳房炎 的免疫預防。屬於生物製品領域。
背景技術：
奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧業發展、食品安全、人類健 康的重大傳染病，特別是近年環境改變、抗生素濫用耐藥，超級細菌出現，細菌感染奶牛乳 房炎發病率和死亡率逐年攀升，嚴重危害畜牧業發展、食品安全和人類健康，由此再次敲響 警鐘，奶牛乳房炎已成為國計民生的頭等大事，疫苗防控勢在必行。據國際奶牛聯合會報告，全球有2. 2億頭奶牛，因理化所致奶牛乳房炎發病率明 顯下降，而病原微生物感染奶牛乳房炎呈顯著上升，其發病率高達60%以上。引發奶牛乳 房炎的病原達140餘種，主要是細菌類佔主流，其中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌感 染佔90%以上，且由多種病原菌共同或單獨引起。據臨床流行病學資料顯示，我國奶牛乳 房炎以大腸桿菌、金葡菌和鏈球菌病原菌為主，佔細菌感染的91. 4%，其中大腸桿菌感染達 30%，大腸桿菌按0抗原分就有130多個型，與當前國際報導感染菌種和型及流行趨勢相一 致，均可直接由一種大腸桿菌或者多種大腸桿菌混合感染引起的乳腺炎，成為危害奶業發 展的主要病原菌。奶牛乳腺炎可分為臨床型和隱性型，臨床型乳區發熱、腫痛、泌乳量減少， 乳汁性狀發生改變，細菌數增多、體細胞增加，重者並發多器官衰竭，甚至死亡；隱性型乳腺 炎沒有特異的臨床表現，僅通過體細胞、產奶量及質量檢測才能檢出，但奶牛罹患率比臨床 型高得多，造成病原微生物的進一步播散，在一定條件下轉化成臨床型，實際損失可能比臨 床型高得多。奶牛乳房炎不但影響奶牛生活質量和產量，而且經濟損失也明顯突出，如發達 美國每年達30億美元、英國4億美元，我國35億元以上，尤其是奶製品及肉食品抗菌素及 細菌產物嚴重超標，已成為國計民生的社會現實問題。目前奶牛乳房炎治療抗生素為首選，大量抗生素使用造成耐藥，而得不到有效控 制，已嚴重影響畜牧業健康發展。人們最大願望就是通過接種疫苗有效控制奶牛乳房炎，其 目的就是增強機體免疫應答反應，特別是乳腺組織的免疫應答反應來阻止、中和、殺滅外界 進入的病原微生物，但由於乳房本身的生理特點給有效免疫力的產生帶來了 了一系列特殊 的挑戰。第一，乳房炎是乳腺組織的炎症，然而免疫應答增強在奶牛患乳房炎的情況下並不 總是有益的。免疫反應的一個重要組成部分是大量的嗜中性粒白細胞從血液遷移到感染的 乳腺來發揮作用。在現實牛奶中出現大量的體細胞並不認為是好事，因為體細胞數量增加 說明奶牛已患乳房炎，並且此時牛奶品質、產量會明顯下降。第二，乳腺中的牛奶會稀釋抗 感染的嗜中性粒細胞的濃度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降低抗感染嗜中 性粒細胞的殺菌能力。第三，奶牛飼養有大量可引起乳房炎的微生物的環境中，而且奶汁本 身給病原菌生長提供了溫床。因此，使奶牛乳腺產生有效的免疫力，降低乳房炎的發生率， 需要攻克的難題較多，給奶牛乳房炎疫苗研發提出比其它傳染病疫苗更高的要求。疫苗是通過增強機體免疫系統的功能從而使機體獲得天然的抗病能力，並且疫苗 具有安全、穩定、有效等特點，因此研製安全、有效的奶牛乳腺炎疫苗成為防控乳腺炎的必由選擇。用於預防大腸桿菌感染引發乳腺炎的大腸桿菌疫苗MastiguarcK由E. coli (0111 B4) J-5菌株研製)和沙門氏菌疫苗(S. typhimuriumR/17菌株研製)，已在美國、歐洲等地 得到了廣泛應用，隨後美國加州大學與我國合作推廣該疫苗，奶牛戶普遍反映費用很高，使 用效果不理想，沒有得到認可，其主要原因是中國奶牛飼養環境和帶菌狀況緊密相關，由此 研發適宜本國流行代表菌株和環境的疫苗勢在必行。國內研究的奶牛大腸桿菌乳腺炎疫苗 均處於實驗室研究階段，但由於乳腺炎病原菌複雜，乳腺免疫具有獨特性質，研究不深入， 菌苗製造過程中存在技術難題，使得尚無高效、商業化運作成熟、廣泛使用的奶牛大腸桿菌 乳腺炎疫苗。奶牛大腸桿菌是引起急性和亞急性乳腺炎的主要環境病原菌，種型繁多，重要 抗原有0、K、H3種，且多數有莢膜，菌毛等。為了防止不同種型細菌感染，疫苗要麼含大量的 不同抗原，要麼只含不同細菌共有的保護性抗原。尋找不同菌株的共同抗原是國際上通行 的做法。不同株的大腸桿菌寡糖側鏈有很大不同，而核心多糖和脂多糖A在不同菌株之間 的變異比寡糖側鏈小的多。J-5大腸桿菌乳腺炎疫苗正是把變異較大的大腸桿菌寡糖側鏈 缺失而使其共同核心抗原暴露在外，刺激產生的免疫球蛋白能夠抵抗革蘭氏陰性菌的核心 抗原，對種類繁多的大腸桿菌均產生保護。而仔豬大腸桿菌病雙價基因工程活疫苗利用基 因突變技術保留毒素的免疫原性而去除了毒性，口服免疫母豬，通過哺乳仔豬，保護仔豬抵 抗黃痢、白痢，為研發奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗提供了新思路。

發明內容
本發明的目的是提供一種奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗及其製備方法，特別是 經基因定點缺失的奶牛大腸桿菌重組工程菌乳房炎滅活疫苗(稱奶牛大腸桿菌乳房炎滅 活疫苗，又稱X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗)製備方法；本發明的目的還在於公開該疫苗 可用於大腸桿菌感染性奶牛乳房炎的免疫預防。發明目的是通過如下技術方案實現的1、通過對我國內蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東等東西南北中30個省 市90個中大型奶牛場、近3萬頭奶牛乳腺炎奶汁樣品，分離、鑑定奶牛乳房炎大腸桿菌株， 確定了我國大腸桿菌0 008、01216、02138、02555等菌株為奶牛乳腺炎疫苗候選優勢菌株。在本發明的方法中，包括但不限於0 008、01216、02138、02555大腸桿菌株作為 奶牛大腸桿菌乳腺炎疫苗候選優勢菌株；包括任何適宜於製備奶牛乳房炎大腸杆疫苗生產 的當前和今後廣泛流行大腸桿菌野生株。2、通過構建自殺致死質粒pCVD442-galE，運用同源重組技術敲除0 008、01216、 02138和02555等大腸桿菌候選優勢菌株的LPS編碼基因galE以暴露其核心抗原，而不影 響除0抗原之外的其它抗原的免疫原性，篩選到X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大 腸桿菌重組工程菌株，在體外普通培養基中生長良好，傳代穩定、免疫原性良好的奶牛大腸 桿菌乳房炎疫苗優勢候選菌株。在本發明的方法中，包括但不限於乂-10、乂-89、乂-326、乂-2138和乂-2555等大腸杆 菌重組工程菌株作為奶牛乳腺炎疫苗候選優勢菌株；包括通過該方法製備的其它突變菌疫 苗株。3、本發明選用X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大腸桿菌優勢疫苗株，制 備優勢流行菌株的兔血清，與已有國內外臨床分離奶牛大腸桿菌乳房炎菌野生株及從ATCC購買標準株免疫交叉中和保護達97%以上，由此選用的奶牛乳房炎X-10、X-89、X-326、 X-2138和X-2555等大腸桿菌優勢疫苗株具有代表國內外流行株和疫苗株。4、選用X-IO大腸桿菌突變株為代表的優勢疫苗株，接種於TSB等培養基中， 35-36°C培養24小時，然後劃線接種TSA瓊脂和5%綿羊血瓊脂培養基上培養，選取符合標 準的典型菌落10個混合接種TSB半固體、液體培養基和斜面培養基若干、置35-36°C培養 20-24小時，斜面培養基細菌用脫脂牛奶衝下，第二代建立了奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗 原始種子批、第三代建立主種子批、第四代建立工作種子批庫，菌種分裝，凍幹後-80°C保 存。進-步通過理化性質、基因特徵、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的X-IO大腸杆 菌疫苗菌株三級種子批庫符合疫苗生產用要求。在本發明專利中，包括但不限於X-IO大腸桿菌建立種子批庫；包括通過該方法 製備的大腸桿菌基因工程菌(稱奶牛大腸桿菌，又稱X-大腸桿菌)株建立疫苗株種子批庫 的疫苗生產。5、通過奶牛X-IO大腸桿菌苗工作種子批株，從IOL到1000L發酵放大培養，培養 基是TSB，製備了 X-IO奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗原液，經甲醛滅活、離心分離、生化提取制 備了純化大腸桿菌滅活全菌，抗原純度達95% ；通過對溫度、時間、接種量等培養條件的優 化，獲得了規模化生產滅活全菌抗原原液；進一步進行血清型別、理化性質、基因特徵、外源 因子、免疫原性等全面鑑定。在本發明專利中，包括但不限於X-IO大腸桿菌工作種子批菌株、TSB和LB培養基 用於疫苗原液規模化生產；包括適用於大腸桿菌基因工程菌株、及LB等培養基作為生產介 質。6、製備的奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌抗原，有效劑量抗原與適量不含有 佐劑或含有白花油、FIA、鋁鹽、MF59、SP01和SP02等疫苗佐劑中的一種或幾種，製備有或無 佐劑的奶牛大腸桿菌滅活疫苗注射劑型，分別免疫BALB/c鼠、家兔和奶牛動物，間隔28天， 皮下免疫2次，間斷採集奶汁、血清、血細胞及脾細胞，觀察奶牛產奶量與質量、體溫、體重、 體細胞計數、細菌計數及ELISA、ELISP0T測定抗體效價、細胞免疫水平及死亡情況。試驗結 果可見，這幾種佐劑均能提高奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗抗體滴度、依次是FIA、白花油、 SP0UMF59和鋁鹽佐劑，且在不同動物呈現一致性趨勢。由此SP01、SP02、MF59、白花油、FIA 和鋁鹽均可有效的作為奶牛乳房炎滅活疫苗的佐劑。在本發明專利中，包括但不限於製備X-IO大腸桿菌滅活疫苗，包括X-89、X-326、 X-2138和X-2555等其它大腸桿菌疫苗株用於製備奶牛大腸桿菌滅活疫苗注射劑型；包含 但不限於SPO1、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽佐劑，還包括免疫刺激複合物、免疫分子、脂 質體、TLR和NLR配體等佐劑；製備有或無佐劑的奶牛大腸桿菌滅活疫苗注射劑型。7、本發明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗注射劑型可皮下注射，也可以肌肉注 射、乳頭管注射，也可以一種或幾種聯合，製備有或無佐劑的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫 苗，分別免疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛動物，觀察過敏性反應、異常毒性、熱源質反應、一般 毒性。結果表明奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗製品接種動物是安全的。8、本發明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗有或無佐劑的滅活疫苗，分別免疫 BALB/c、家兔和奶牛動物，間斷採集奶汁、血清、血細胞及脾細胞，觀察奶牛奶產量、奶汁質 量、體溫、體細胞計數、細菌數、抗體效價、脾細胞計數及細胞因子變化，通過量效、時效、次效測定抗體和細胞免疫水平以評價免疫原性；進一步在2-3歲即將進入泌乳期(即產前 25d，懷孕8個月20d)健康奶牛，免疫劑量是有效抗原劑量(比如1 5X IOltlCFU)的滅活 全菌疫苗，0，28，56天各免疫1次(即產前25天，產後3天、31天)，末次免疫後14天用 1000CFU大腸桿菌野生菌株乳區內注射攻毒，間斷採集奶汁、血清、血細胞及脾細胞，觀察奶 牛奶產量、奶汁質量、體溫、體細胞計數、細菌數、抗體效價、脾細胞計數及細胞因子等指標 評價免疫保護率。結果顯示，製備的不管是皮下或是以肌肉或是乳頭管注射、不管是有佐劑 或是無佐劑奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗都有產生高效價抗體滴度，與劑量呈相關，加佐 劑好於無佐劑組，在不同動物有一致免疫應答趨勢，在奶牛體內免疫保護率85%以上。9、本發明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗有或無佐劑的滅活疫苗製品，分別置於 4°C、室溫(20-25) °C和37°C，從外觀、pH、蛋白含量、動物免疫原性等指標觀察疫苗穩定性。 結果表明，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗製品放置2 8°C穩定性良好，有效期2年以上。10、本發明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗用於不同品種、不同年齡奶牛免疫接 種預防奶牛乳房炎發生。綜上所述，該疫苗經基因定點缺失的大腸桿菌重組工程菌乳房炎滅活疫苗(稱奶 牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，又稱X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗)，具有代表國內外大腸 桿菌感染所致奶牛乳房炎優勢流行菌株。用奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗優勢菌株，製備 奶牛乳房炎大腸桿菌等株兔抗血清，與現有國內外臨床分離奶牛乳房炎大腸桿菌代表株免 疫交叉中和達97%以上，由此選擇奶牛乳房炎大腸桿菌疫苗株具有代表國內外大腸桿菌感 染奶牛乳房炎廣譜流行株特徵。建立X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種子批 和工作種子批庫，經全面鑑定符合疫苗生產的要求。TSB或LB等培養基放大培養工業化生 產，製備奶牛大腸桿菌乳房炎菌苗原液，經甲醛滅活、離心分離、生化提取等工藝，製備了純 化奶牛乳房炎大腸桿菌滅活全菌抗原；為奶牛大腸桿菌乳房炎滅活全菌疫苗。該疫苗中可 以不含有佐劑，製備無佐劑的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗。該疫苗中可以含有佐劑，佐 劑為如下的一種①SP01，為2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚混勻水包油樣； ②SP02，為2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug細菌鞭毛混勻水包油；③白 花油，為商品化佐劑；④MF59，為商品化佐劑；⑤FIA，為商品化佐劑；⑥鋁鹽，為氫氧化鋁或 磷酸鋁。佐劑也可如上的兩種或多種組合或其它佐劑。製備有佐劑的奶牛大腸桿菌乳房 炎滅活疫苗。該疫苗製備成臨床適用的注射劑型皮下注射劑型、肌肉注射劑型、乳頭管注 射劑型；微針透皮劑型等。該疫苗有或無佐劑的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，通過皮下 或肌肉或乳頭管注射，表明該疫苗都能產生良好的免疫應答，皮下注射高於肌肉、乳頭管途 徑；免疫加佐劑好於無佐劑組，在不同動物有一致免疫應答趨勢，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活 疫苗在奶牛體內免疫保護率90 %以上。該疫苗製品在動物體內使用安全，無不良反應。該疫苗製品放置2 8°C穩定性 良好，有效期暫定2年。該疫苗製品通過皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮的一種 或幾種聯合用於不同品種、不同年齡奶牛的免疫接種，可安全、穩定、有效預防大腸桿菌感 染性奶牛乳房炎的發生。本發明的優點是選擇我國奶牛乳房炎優勢大腸桿菌流行菌株，採用同源重組進 行大腸桿菌寡糖側鏈缺失，使其缺乏鳥苷二磷酸半乳糖異構酶，篩選共同核心抗原暴露在 外的大腸桿菌突變株作為候選疫苗株、進一步通過滅活全菌為疫苗靶抗原、與加入或不加入疫苗佐劑製備奶牛大腸桿菌重組工程菌滅活菌苗(稱奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，又 稱X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗)注射劑型、微針透皮劑型，為安全、高效、全面有效預防 大腸桿菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保證，是奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗發展的一個重大 突破。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1 篩選並確定奶牛大腸桿菌乳房炎流行優勢菌株作為候選疫苗菌株從覆蓋我國東西南北中的內蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東等30個省 市地90個中大型奶牛場採集近3萬份臨床奶牛乳房炎奶汁樣品，分離檢定，篩選並確定奶 牛大腸桿菌感染乳房炎優勢流行菌株；1.奶牛乳樣的採集選取出現臨床症狀(或者懷疑為亞臨床型乳房炎)乳房炎奶 牛，先用溫水，再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房，最後用70%的酒精擦拭乳頭。採樣者同時進 行手指擦拭消毒。每個乳室先擠去頭2 3把奶，以排除汙染的雜菌，每頭奶牛取乳樣至少 5mL於無菌乳樣杯中，待檢。2.將乳樣搖勻，分別取適量接種於營養肉湯、TSB培養基、鮮血瓊脂、新鮮脫纖維 綿羊血平板、麥康凱瓊脂平板、TSA平板後，置於37°C溫箱培養24 48h。觀察每個平板中 細菌生長的情況，記錄菌落生長表現。普通瓊脂平板和TSA平板上，37°C，24 72h培養後，可見到光滑、溼潤、表面有 光澤、隆起的圓形乳白色菌落。挑取典型菌落塗片、染色、鏡檢呈直杆狀，單個或成對。革蘭 氏陰性，並挑取單個可疑菌落移植於肉湯和斜面培養基，經37°C培養24 48h。營養肉湯 中呈渾濁生長；在麥康凱培養基上，菌落呈圓形、粉紅色、光滑、溼潤、表面有光澤、全緣。血 瓊脂上生長並形成灰白色菌落，無溶血現象，但在選擇性羊血培養基上不生長。大腸桿菌生 化鑑定，氧化酶試驗陰性；糖發酵試驗能分解葡萄糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、麥芽糖、木 糖、棉子糖產酸，不能利用丙二酸鹽、枸櫞酸鹽、山梨醇、側金盞花醇。甲基紅陽性，苯丙氨酸 脫氫酶試驗為陰性，硫化氫試驗為陰性，脲酶試驗陰性，硝酸鹽還原反應為陽性，明膠液化 反應為陰性，凝固酶反應為陰性，DNA酶試驗陰性，接觸酶反應陽性。3.酶切質粒圖譜分析將分離0 008、01216、02138、02555等奶牛大腸桿菌乳房炎 菌株提取質粒DNA，質粒DNA大小及酶切片斷符合奶牛乳房炎大腸桿菌特徵。4. SDS分析菌體主要蛋白組分將其分離0 008、01216、02138、02555奶牛大腸杆 菌乳房炎菌株進行SDS-PAGE，可見呈26-30餘條大小不等蛋白條帶，進一步免疫印跡符合 奶牛乳房炎大腸桿菌蛋白條帶特徵。5.致病性分析將其分離0 008、01216、02138、02555等奶牛金葡菌乳房炎菌株在 LB培養基培養傳代，分離純化各血清型金葡菌菌株分別注入6-18周BALB/c鼠腹腔3 X IO8 個活菌、1. 5-2歲家兔腹腔IX IO9個活菌數、3-4歲奶牛乳管1000個活菌，可使小鼠、家兔 動物發病，有些動物甚至在1周內死亡，對奶牛觀察奶產量與質量、體溫、體重、體細胞數、 排菌數等檢測。對接種後發病、死亡動物等觀察。進行菌落塗片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查， 觀察所分離菌株為奶牛大腸桿菌乳房炎主要的致病菌。以上通過選擇性培養基上分離與篩選、生化鑑定、基因分析、BALB/c、家兔、奶牛 動物的致病性等評價，確定並命名為0 008、01216、02138、02555等大腸桿菌為我國流行優 勢株，佔奶牛乳房炎大腸桿菌90%以上，為候選奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗優勢株提供了依據。實施例2 構建奶牛乳房炎大腸桿菌基因工程優勢菌株及篩選確定疫苗菌株1、採用致死質粒同源重組方法，通過構建自殺致死質粒pCVD442_galE，運用同源 重組常規方法敲除0 008、01216、02138和02555等大腸桿菌候選優勢菌株的LPS編碼基因 galE以暴露其核心抗原，影響脂多糖合成，而不影響除0抗原之外的其它抗原的免疫原性， 篩選缺乏大腸桿菌鳥苷二磷酸半乳糖異構酶突變菌株。2、從中篩選並命名為X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大腸桿菌基因工程 菌株，在體外普通培養基中傳代生長良好，該菌株免疫Balb/c小鼠、豚鼠具有良好安全性 和免疫原性，初步確定為奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗優勢候選菌株。實施例3 製備奶牛大腸桿菌乳房炎優勢疫苗菌株免疫血清及檢定從確定具有代表性X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大腸桿菌基因工程菌 株，製備純化菌株抗原，分別用5 X 107CFU/lml劑量皮下免疫家兔(大腸桿菌抗原及抗體陰 性)，免後21天心臟放血，血清抗體效價達到1 3200以上，再分別與臨床分離奶牛乳房 炎大腸桿菌毒株、購買美國ATCC和中國菌種庫主要奶牛乳房炎大腸桿菌標準株進行免疫 試驗，結果顯示免疫中和交叉率達97%，由此確定所選用的奶牛X-10、X-89、X-326、X-2138 和X-2555等大腸桿菌基因工程菌(X-大腸桿菌)株優勢疫苗株具有廣泛的代表性。實施例4 建立奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗株三級種子批庫及檢定以確定X-IO乳房炎大腸桿菌優勢疫苗株為例，接種於TSB培養基中，37°C培養24 小時，收取菌液，建立三級種子批庫及全面檢定。1.原始種子批的建立選取X-IO乳房炎大腸桿菌優勢株菌落劃線接種TSA培養 基上培養，置37°C培養20-24小時培養，用脫脂牛奶衝下，第二代作為原始種子批庫，加入 5 %脫脂奶粉分裝於凍存管，凍幹後-70 V以下長期保存。2.主種子批的建立取第二代X-IO大腸桿菌奶牛乳房炎原始種子批菌株接種於 TSB培養基，37°C培養20-24小時，第三代作為主種子批庫，加入5%脫脂奶粉分裝於凍存 管，凍幹後-70°C以下長期保存。3.工作種子批的建立取第三代X-IO大腸桿菌奶牛乳房炎原始種子批菌株接種 於TSB培養基，37°C培養24小時，第四代作為主種子批庫，加入50 %的甘油分裝於菌種管 內，-70°C保存。4.三級種子批的檢定通過對奶牛乳房炎X-IO大腸桿菌疫苗菌株原始種子批、 主種子批、工作種子批菌株以及傳代30代菌株的外觀、血清型別、PH值、溶解時間、水分含 量、菌落變異率、形態與染色、菌株質粒圖譜、莢膜多糖、菌株毒性和免疫原性進行了全面檢 定。結果顯示，建立的奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗三級種子批庫安全、穩定，符合疫苗生產的 要求。實施例5 規模化發酵培養奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗原液及滅活取X-IO大腸桿菌乳房炎疫苗工作種子批庫菌株，先平板活化，挑單菌落接種 100ML液體培養基擴增，後轉入IOL細菌培養罐的TSB培養基，37°C培養24h ；然後轉接於 1000L發酵罐中進行培養，37°C培養約20h，收穫菌液，取樣作純檢並計算菌數；隨後加入終 濃度為0. 4%的甲醛溶液(ν/ν)，37°C，轉速150rpm，滅活36_48h。隨機取樣連傳三代無細 菌生長，用無熱源的PBS洗菌三次，每次4°C，6500rpm離心15min，要沉澱，用PBS溶解，測定含量，凍幹或液體為純化的滅活全菌疫苗抗原。實施例6 製備奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗及檢定X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗①將純化X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌抗原 不加佐劑，配製lX1010CFU/lml,5X1010CFU/5ml無佐劑注射劑型；②將純化X-10大腸 桿菌乳房炎滅活全菌抗原加入氫氧化鋁或磷酸鋁，配製1 X 101(lCFU/0. 5mg(鋁鹽)/lml、 5X1010CFU/2. 5mg(鋁鹽)/5ml有鋁鹽佐劑注射劑型；③將純化X_10大腸桿菌乳房炎滅 活全菌抗原加入等量SPOl佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02 佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、5ug單磷醯脂A)混勻水包油樣，配 制 1 X 10lclCFU+0. 5ml SPOl (或 SP02)/lml、5X 1010+2. 5ml SPOl (或 SP02CFU)/5ml 有 SPOl 或SP02佐劑注射劑型；④將純化X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌抗原加入等量白花油佐 劑混勻油包水樣，配製1X101qCFU+0. 5ml白花油(IFA)/lml、5X 10lclCFU/+2. 5ml白花油 (IFA)/5ml有白花油佐劑注射劑型，以上注射疫苗劑型可為皮下注射、肌肉注射、乳頭管注 射劑型，放2-8 °C備用。實施例7 本發明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在動物體內的免疫效果評價1.將本發明實施例6製備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌疫苗加入或不加入相 應佐劑，製備的皮下、肌肉、乳頭管注射疫苗劑型，並用PBS、鋁鹽、SP01、SP02、白花油、IFA、 單磷醯脂A為對照組，分別免疫6-8周Balb/C小鼠、18月家兔，每組10隻，其免疫劑量按 實施例6疫苗劑量組(抗原1X101QCFU/Iml、抗原5X101QCFU/5ml)，免疫兩次(0，28天)； 末次免疫後14天將各組小鼠、家兔取血、分離血清和免疫細胞，及通過ELISA法測定血清 1 6400，採用MTT法測定中和抗體效價都在1 6400以上，採用流式細胞儀、ELISP0T儀 測定免疫細胞與血清中重要細胞因子、炎性分子、趨化因子及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等 動態變化使得TH2/Thl應答平衡，採用ELISA法測定乳汁SlgA抗體效價都在1 3200以 上。說明製備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗不管是加入佐劑或沒加入佐劑均都能產生滿 意的雙重免疫應答，且呈現出試驗組有佐劑優於無佐劑組、高劑量組高於低劑量組免疫應 答效果，而對陰性照組沒有產生雙重免疫應答；製備的奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗 不管是皮下注射還是肌肉、乳頭管注射劑型均都能產生滿意的雙重免疫應答，且注射劑血 清抗體效價高於乳頭管內注射劑型，乳管內注射的黏膜和細胞免疫效應好於肌肉和皮下免 疫途徑，由此製備的奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在小鼠、家兔體內具有好的免疫應 答效果；加佐劑優於無佐劑組，SPOl或SP02佐劑整體優於鋁鹽、白花油和IFA佐劑組，且在 不同動物有一致免疫應答趨勢。由此，研製的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在小鼠體內有 很好的免疫原性。2.將本發明實施例6製備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌疫苗加入或不加入相 應佐劑製備的皮下、肌肉、乳頭管注射疫苗劑型，並用PBS、鋁鹽、SP01、SP02、白花油、IFA、單 磷醯脂A為對照組，分別按皮下、肌肉、乳頭管注射途徑選擇2-3歲即將進入泌乳期(即產 前25d，懷孕8個月20d)健康(即疫苗抗體陰性，病原體陰性)奶牛，每組10頭；免疫劑量 按實施例6疫苗劑量組(抗原1 X 101(lCFU/lml、抗原5 X 101(lCFU/5ml)，免疫程序是0，28，56 天各免疫1次(即產前25天，產後3天、31天)；末次免疫後14天取血、分離血清和免疫細 胞，採集、乳汁，觀察奶牛產奶量與質量、體溫、體細胞計數、細菌計數及通過ELISA法測定 血清抗體效價25600以上、乳汁抗體效價達到1 6400以上，採用MTT法測定中和抗體效價都在1 12800以上，說明製備的奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗不管是加入佐劑與 沒有佐劑均都能產生滿意的雙重免疫應答，且呈現出試驗組有佐劑優於無佐劑組、高劑量 組高於低劑量組免疫應答效果，而對陰性照組沒有產生雙重免疫應答；製備的X-IO大腸杆 菌乳房炎滅活疫苗不管是皮下注射還是肌肉、乳管注射劑型均都能產生滿意的雙重免疫應 答，且注射劑血清抗體效價高於乳管內注射劑型，乳管內注射的黏膜和細胞免疫效應好於 肌肉和皮下免疫途徑，由此製備的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內具有好的免疫 應答效果；加佐劑優於無佐劑組，SPOU SP02佐劑整體優於鋁鹽、白花油、FIA佐劑組，且與 劑量呈正相關免疫應答趨勢。依上末次免疫14天後，用臨床分離01111、0157大腸桿菌野毒株作為攻毒株，將 1000CFU注入一個乳區。攻毒後觀測臨床症狀(發燒、乳腺腫脹)，體溫變化，奶樣質量(血 奶、異常塊、奶量減少)、進食情況(進食減少)及發病情況，通過奶樣體溫、排菌數、體細胞 數和血清抗體、奶汁抗體指標評價保護率。試驗結果顯示，研製的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活 疫苗在奶牛體內有良好的保護率，高劑量組高於低劑量組的保護率，加佐劑組高於不加佐 劑組保護率，保護率達88%。實施例8 本發明奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內的長效免疫保護評價將本發明實施例6製備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌疫苗頸部皮下注射2-3 歲即將進入泌乳期(即產前25d，懷孕8個月20d)健康(即大腸桿菌抗體陰性，病原體陰 性)奶牛，每組20頭；免疫劑量在(抗原5X101(lCFU/5ml)，免疫程序是0，28，56天各免疫1 次(即產前25天，產後3天、31天)，第二年後加強免疫1次，觀察3年(1083天)，其間每 隔3個月取血、奶汁，觀察奶牛產奶量與質量、體細胞計數、細菌計數及通過ELISA、ELISP0T 測定抗體效價、細胞免疫的長效免疫應答及保護效果。試驗結果顯示，研製的奶牛大腸桿菌 乳房炎滅活疫苗具有長效免疫應答和免疫保護，第一年免疫3次後，以後每年加強免疫一 次，其保護率達86%。實施例9 本發明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗安全性試驗1、無菌、支原體試驗將實施例6製備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗接種硫乙 醇酸鹽培養基、營養瓊脂斜面培養基和改良馬丁培養基培養14d，並以無菌生理鹽水做陰 性對照，培養溫度為25°C、35°C。結果顯示，X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗未見細菌生長。 將奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗分別用半流體和肉湯培養基，37°C初代培養21天，次代培養 21天，無菌生理鹽水做陰性對照，結果顯示X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗無支原體生長。2、溶血性試驗選取體重為350g左右的豚鼠，採集新鮮豚鼠血1ml，用PBS洗滌3 次，再將血細胞體積恢復並稀釋10倍。PBS稀釋X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗(由實施 例6製備)，分別為2倍、4倍、8倍，將豚鼠血細胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時後，評價 血球溶解以目測或者上清濃度檢測為準，並在570nm處檢測吸光度。結果顯示，沒有發生血 球破裂，無溶血現象。說明X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗中的成分不能使紅細胞裂解。因 此，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗無溶血反應。3、急性毒性試驗取實施例6製備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗0. 5ml腹腔注 射體重為12 18g Balb/C小鼠，每組10隻，同時設PBS陰性對照組，連續2周觀察小鼠的 活動狀態、體重變化和存活率。結果表明，實驗小鼠全部存活，沒有出現豎毛、精神萎靡、行 動遲緩等不良症狀，而體重呈現增加，由此證明X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在試驗的濃度下對動物是安全的，且14天後處死進行大體解剖檢查，未見臟器有病理改變。在體重為 8 IOkg的Beagle狗體內的急性毒性結果取實施例6製備的X-10大腸桿菌乳房炎滅活 疫苗肌肉注射15ML，每組10隻，同時設PBS陰性對照組，連續2周觀察行為、體重和存活率 變化。結果可見，Beagle狗未見毒性反應，行為正常，沒有死亡，與對照組狗比較無差異，各 狗體重有所增加，並處死大體解剖未見臟器有明顯的病理改變。因此，奶牛大腸桿菌乳房炎 滅活疫苗無急性毒性反應，使用是安全的。4、過敏試驗研究取實施例6製備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗皮下接種體重 為250 350g Hartley豚鼠，每個樣品接種豚鼠5隻，每隻接種0. 5ml,隔日一次，共3次。 第3次注射後21天，耳靜脈給予相同X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗0. 5ml，並用人血白蛋 白和生理鹽水以同樣的方法分別接種3隻豚鼠作為陽性、陰性對照。注射後30分鐘及3天 觀察動物，陽性、陰性對照均成立，X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗組豚鼠無死亡，且無鼻癢、 噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過敏症狀。因此，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在 動物體內無過敏反應。5、兔熱源質試驗取預檢合格的體重為2 3kg家兔3隻固定，30分鐘後測 量體溫，共測2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大於0. 2°C，各家兔2次平均溫度在 38. 6-39. 5°C。將實施例6製備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗預熱至38°C，於第2次測 溫後15分鐘內，自家兔耳邊靜脈緩緩注入0. 5ml/只。注射後每隔30分鐘測量體溫1次， 連測6次。結果顯示奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗給予家兔個體升溫未超過0. 2°C， 3隻家兔升溫總和未超過0.4°C，沒有引起家兔的發熱反應。因此，製備的奶牛大腸桿菌乳 房炎滅活疫苗無熱源質。6、免疫病理損傷試驗由實施例6製備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗通過小 鼠、家兔和奶牛外周血抗體亞型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜鹼性 細胞及氣管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等檢測。試驗結果顯示，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗 免疫接種不管在小動物，或是在奶牛體內Th2/Thl免疫應答趨於平衡，沒有免疫器官損傷 的跡象，因此具有安全性。實施例10 本發明奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗的穩定性實驗由實施例6製備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，分別置於2-8 °C、室溫 (20-25°C )、37°C 1周、2周、1個月、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月、36個月，取樣 觀察外觀、PH值、無菌、電鏡觀察粒徑、免疫動物觀察安全性和效力。結果顯示奶牛大腸杆 菌乳房炎滅活疫苗放置2-8°C 24個月內均無變色分層等現象，PH值在7. 0-7. 2之間無變 化，電鏡觀察粒徑大小保持一致，且注射給Balb/c小鼠表現正常；X-IO大腸桿菌乳房炎滅 活疫苗放置室溫25V 3個月內均有好的穩定性；X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗放置室溫 37°C 1個月內均有好的穩定性效果。由結果說明，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗放置2-8°C 理化性質、生物學性能穩定，有效期至少24個月。
權利要求
奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的製備方法，其特徵是(1)、通過對奶牛乳腺炎奶汁樣品分離、鑑定出的奶牛乳房炎大腸桿菌株，確定了我國大腸桿菌奶牛乳腺炎疫苗候選優勢菌株，包括任何適宜於製備奶牛乳房炎大腸杆疫苗生產的當前和今後廣泛流行大腸桿菌野生株；(2)、通過構建自殺致死質粒pCVD442 galE，運用同源重組技術敲除大腸桿菌候選優勢菌株的LPS編碼基因galE以暴露其核心抗原，而不影響除O抗原之外的其它抗原的免疫原性，篩選出大腸桿菌重組工程菌株，包括通過該方法製備的其它突變菌疫苗株，在體外普通培養基中生長良好，傳代穩定、免疫原性良好的奶牛大腸桿菌乳房炎優勢疫苗菌株；(3)、選用奶牛大腸桿菌乳房炎優勢疫苗菌株，製備優勢流行菌株的兔血清，與已有國內外臨床分離奶牛大腸桿菌乳房炎菌代表株免疫交叉中和達97％以上，由此選用的奶牛乳房炎大腸桿菌優勢疫苗株具有代表國內外流行株；(4)、選用奶牛大腸桿菌乳房炎優勢疫苗菌株，建立奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種子批、工作種子批庫，菌種分裝保存；進一步通過理化性質、基因特徵、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的大腸桿菌疫苗菌株三級種子批庫符合疫苗生產用要求；(5)、通過奶牛大腸桿菌苗工作種子批庫，進行放大培養，製備奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗原液，經滅活、離心分離、生化提取製備了純化大腸桿菌滅活全菌，抗原純度達95％；通過對溫度、時間、接種量等培養條件的優化，獲得了規模化生產滅活全菌抗原原液；進一步進行血清型別、理化性質、基因特徵、外源因子、免疫原性等全面鑑定；(6)、用純化滅活全菌抗原原液，製備有或無佐劑的奶牛大腸桿菌滅活疫苗注射劑型，可用於不同品種、不同年齡奶牛通過皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮等免疫接種，也可以一種或幾種聯合免疫；奶牛大腸桿菌乳房 炎滅活疫苗製品放置2～8℃保存。
2.根據權利要求1所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的製備方法，其特徵是我國 大腸桿菌奶牛乳腺炎疫苗候選優勢菌株是由內蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東 等東西南北中30個省市90個中大型奶牛場、近3萬頭奶牛乳腺炎奶汁樣品，分離、鑑定奶 牛乳房炎大腸桿菌株，確定的我國大腸桿菌0 008、01216、02138、02555菌株為奶牛乳腺炎 疫苗候選優勢菌株。
3.根據權利要求1或2所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的製備方法，其特徵是 奶牛大腸桿菌乳房炎優勢疫苗菌株為X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大腸桿菌重組工程菌株。
4.根據權利要求3所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的製備方法，其特徵是選用 奶牛大腸桿菌乳房炎優勢疫苗菌株，建立奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種 子批、工作種子批庫的方法選用X-IO大腸桿菌株為代表的優勢疫苗株，接種於TSB等培養 基中，35-36°C培養24小時，然後劃線接種TSA瓊脂和5%綿羊血瓊脂培養基上培養，選取符 合標準的典型菌落10個混合接種TSB半固體、液體培養基和斜面培養基若干、置35-36°C培 養20-24小時，斜面培養基細菌用脫脂牛奶衝下，第二代建立了奶牛大腸桿菌乳房炎滅活 疫苗原始種子批、第三代建立主種子批、第四代建立工作種子批庫。
5.根據權利要求4所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的製備方法，其特徵是通過 奶牛大腸桿菌苗工作種子批庫，進行放大培養，獲得了規模化生產滅活全菌抗原原液的方 法是通過奶牛X-IO大腸桿菌苗工作種子批株，從IOL到1000L發酵放大培養，培養基是TSB，製備了 X-IO奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗原液，經甲醛滅活、離心分離、生化提取製備了 純化大腸桿菌滅活全菌，抗原純度達95% ；通過對溫度、時間、接種量等培養條件的優化，獲 得了規模化生產滅活全菌抗原原液。
6.根據權利要求5所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的製備方法，其特徵是疫苗 佐劑可以是SP01、SP02、MF59、白花油、FIA、鋁鹽、免疫刺激複合物、細胞因子、脂質體等當中 的任意一種或多種，或無佐劑。
7.射，表明該疫苗 都能產生良好的免疫應答，皮下注射高於肌肉、乳頭管途徑；免疫加佐劑好於無佐劑組，在 不同動物有一致免疫應答趨勢，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內免疫保護率90% 以上。
8.根據權利要求6或7所述的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，其特徵是該疫苗製品 通過皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮的一種或幾種聯合用於不同品種、不同年 齡奶牛的免疫接種，可安全、穩定、有效預防大腸桿菌感染性奶牛乳房炎的發生。
全文摘要
本發明公開了一種奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗及其製備方法，疫苗是臨床分離野毒株經基因定點缺失LPS編碼基因galE以暴露其核心抗原，而不影響除O抗原之外的其它抗原的免疫原性，篩選出大腸桿菌重組工程菌株乳房炎滅活疫苗，具有代表大腸桿菌感染所致奶牛乳房炎優勢疫苗菌株，進一步通過發酵規模化生產菌液、滅活、純化等工藝，經此形成滅活全菌抗原，加入或不加入SP01、SP02、白花油、FIA、鋁鹽、MF59、免疫刺激複合物、脂質體、免疫細胞因子等佐劑，該方法製備的疫苗劑型，通過皮下、肌肉、奶頭乳管注射、微針透皮等免疫接種奶牛後，可有效預防大腸桿菌感染性奶牛乳房炎的發生。
文檔編號C12N1/21GK101991846SQ20101055005
公開日2011年3月30日 申請日期2010年11月17日 優先權日2010年11月17日
發明者劉永祥, 孫藝萍, 李敏, 楊定興, 楊秀蘭, 王鋮, 郝國成, 高嘯 申請人:赤峰博恩藥業有限公司