抗草甘膦基因、專用表達載體及其在獲得抗草甘膦轉基因小麥中的應用的製作方法

2023-05-09 05:08:41

抗草甘膦基因、專用表達載體及其在獲得抗草甘膦轉基因小麥中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了抗草甘膦基因、專用表達載體及其在獲得抗草甘膦轉基因小麥中的應用。本發明提供的一種蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列3所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列3所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗草甘膦相關的由序列2衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，本發明利用小麥密碼子偏好性對其進行人工設計，並在N段添加來自小麥RubisCO小亞基的葉綠體導肽，通過人工合成法獲得了改造的基因，並將其應用於小麥轉化時的作為篩選標記基因，獲得了抗草甘膦的轉基因小麥，經過研究證明，該轉基因小麥的抗性高於優化前小麥的轉基因抗性。
【專利說明】抗草甘膦基因、專用表達載體及其在獲得抗草甘膦轉基因小麥中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及抗草甘膦基因、專用表達載體及其在獲得抗草甘膦轉基因小麥中的應用。
【背景技術】
[0002]草甘膦是美國Monsanto公司生產的除草劑農達(Roundup)的主要活性成份,具有高效、廣譜、低毒、低殘留、易於被微生物分解、不破壞土壤環境，對大多數植物具有滅生性等優點。自1976年研製成功以來，在農業領域得到了廣泛應用，成為當今世界上生產最大的農藥品種。草甘膦是一種內吸傳導型除草劑，噴灑於植物莖葉後，即可被植物吸收，並迅速輸導到整個植株及其根部，從而殺滅雜草，不僅能殺死地上部分，並且能作用於根部，真正做到斬草除根，可有效防除那些靠根系繁殖的多年生雜草。然而作為一種非選擇型除草劑，其殺滅雜草的同時，對農作物同樣具有滅生性，一定程度上限制了其使用範圍和使用時間。因此，培育具有草甘膦抗性或能降解草甘膦的農作物具有重要意義，不僅可有效防控雜草，而且可減少農業生產費用。
[0003]培育抗草甘膦作物最有效的方法是將草甘膦抗性基因導入作物，從而提高轉基因作物對草甘膦的抗性，達到田間噴灑控制雜草的目的。1983年Monsanto公司從根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) CP4中分離得到首個草甘膦抗性基因epsps,之後將其轉入大豆，成功獲得了抗草甘膦大豆，並於1996年開始商業化生產。目前，抗草甘膦轉基因作物研究發展迅速，除了大豆，抗草甘膦棉花、玉米、甘藍型油菜、白菜型油菜、苜蓿、甜菜也已獲準商業化生產。另外，利用此基因已經獲得抗草甘膦轉基因小麥(Hu T et al.，2003)。耐草甘膦作物的種植面積也在迅速遞增，據ISAAA統計，2011年全球59%的轉基因種植面積為耐除草劑作物，種植面積達9390萬hm2，其中多數為抗草甘膦轉基因作物品種。
[0004]EPSPS是細菌、真菌、藻類和高等植物莽草酸途徑中芳香族胺基酸合成的一個關鍵酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)合成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸(EPSP)。草甘膦是PEP的類似物，可以競爭性地與EPSPS結合，抑制其活性，阻斷芳香族胺基酸的合成，從而導致下遊相關代謝受阻，擾亂植物正常代謝而使其死亡。EPSPS在植物細胞中定位於葉綠體，由細胞核合成後，在N段導肽作用下進入葉綠體，與莽草酸途徑中其它酶的共同作用下，完成芳香族胺基酸的合成。因此，草甘膦抗性基因在植物體內的表達需添加葉綠體導肽。
[0005]草 甘膦抗性基因的來源主要有2種，一是通過篩選抗草甘膦物種，從而克隆獲得草甘膦抗性基因。目前，已在微生物Salmonella typhimurium(Comai et al.，1985)、Agrobacterium sp.CP4(Comai et al., 1985)、Achromobacter sp.LBAA (Barry etal., 1994)、Pseudomonas sp.PG2982(Kishore and Jacob, 1987)、S.pneumoniae (Du etal., 2000)和 Staphylococcus aureus (Priestman et al., 2005)等中發現了具有抗性的epsps 基因，其中從 Salmonella typhimurium 和 Agrobacterium sp.CP4 中分離的 epsps 抗性基因，在部分作物中已批准商業化生產。二是對epsps基因突變，獲得草甘膦抗性突變體。如已商業化生產的抗草甘膦玉米GA21中抗性基因是利用位點突變後克隆獲得的?』另外，Padgette等(1987)利用位點突變使矮牽牛EPSPS第101位的甘氨酸變為丙氨酸，突變基因表現出對草甘膦的低親和力。
[0006]目前，國內外已克隆多個對草甘膦有一定抗性的突變體基因。新基因的分離和克隆對轉基因抗除草劑植物的培育及防止抗除草劑轉基因植物產生交叉抗性，具有重要意義。此外，微生物中獲得的草甘膦抗性基因，如果直接轉化植物，因受不同植物受體密碼子使用的偏好性影響，其抗性水平不一定達到生產要求，因此，通過宿主密碼子偏好性對外源基因密碼子優化和改造，提高其在植物中的表達水平具有重要應用價值。GR79是從極端汙染環境草甘膦抗性菌株中，分離獲得的一個新型草甘膦抗性基因，此基因表達可表現出很強的草甘膦抗性活性，已申請專利(申請號PCT/CN2007/071071)。

【發明內容】

[0007]本發明的一個目的是提供一種抗草甘膦基因。
[0008]本發明提供的DNA分子，為融合基因wCTP: GR79m或其表達盒Ub1-wctp: GR79m_nos表達盒，也為抗草甘膦基因，是如下(1)-(4)中任一種的DNA分子:
[0009](I)編碼區為序列表中的序列I所示的DNA分子,其為Ub1-wctp:GR79m_nos表達盒;
[0010](2)編碼區為序列表中的序列I自5』末端第2192-3675位所示的DNA分子，為融合基因 wctp:GR79m ；
[0011](3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且與抗草甘膦相關的蛋白的DNA分子；
[0012](4)與(I)或⑵限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且與抗草甘膦相關的DNA分子。
[0013]上述嚴格條件為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1% SDS中漂洗。含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的範圍。
[0014]上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體中，得到的重組載體。在本發明中，採用pCS167作為表達載體，重組載體為將序列表中序列I所示的Ub1-wctp:GR79m-noS表達盒插入PCS167載體PacI酶切位點間得到的重組質粒。
[0015]表達載體多種，pCS167表達效果最佳，且其具有獨立的可插入外源基因的T-DNA，與pCG185-GUS目的基因配合，可以通過後代分離獲得無標記轉基因植株。
[0016]擴增上述DNA分子全長或其任意片段的引物對也是本發明保護的範圍。
[0017]上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控植物對草甘膦抗性中的應用也是本發明保護的範圍。
[0018]上述應用中，所述植物為單子葉植物。
[0019]本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
[0020]本發明提供的方法，為將上述DNA分子導入目的植物，獲得轉基因植物，所述轉基因植物抗草甘膦性高於所述目的植物。
[0021]上述方法中，所述DNA分子通過上述的重組載體導入目的植物。
[0022]上述方法中，所述目的植物為單子葉穀物作物，在實施例中，具體採用單子葉植物小麥。
[0023]本發明的實驗證明，本發明利用小麥密碼子偏好性對其進行人工設計，並在N段添加來自小麥RubisCO小亞基的葉綠體導肽，通過人工合成法獲得了改造的基因，並構建了在小麥轉化時將改造後的GR79基因用作為篩選標記基因和目的基因的農桿菌轉化載體，通過農桿菌介導的轉化，獲得了抗草甘膦的轉基因小麥。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為pCG185-wCTP:GR79m載體結構示意圖及酶切電泳圖
[0025]圖2為pCS167-wCTP:GR79m載體結構示意圖及酶切電泳圖
[0026]圖3 為轉 pCG185-wCTP: GR79m/pCS167_wCTP: GR79m 的部分 Ttl 代植株 PCR 檢測結果
[0027]圖4為Ttl代部份轉基因植株的Southern雜交結果
[0028]圖5為轉基因小麥的wCTP:GR79m表達
[0029]圖6為轉基因小 麥的草甘膦抗性測定
[0030]圖7為優化前後密碼子使用度
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]pClean_G185 (pCG185)記載在如下文獻中:Thole V., Worland B., Snape Jff., VainP.2007.The pCLEAN dual binary vector system for Agrobacterium-mediated planttransformation.Plant Physiologyl45:1211-1219 ;公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。
[0034]pClean_S167 (pCS167)記載在如下文獻中:Thole V.Worland B.Snape JW.VainP.2007.The pCLEAN dual binary vector system for Agrobacterium-mediated planttransformation.Plant Physiologyl45:1211-1219.公眾可從中國農業科學院作物科學研
究所獲得。
[0035]pCG185_GUS為將gus表達盒(ub1: gus:nos表達盒，核苷酸序列為序列4)通過gateway重組的LR反應同源重組到pCG185的T-DNA內插入，得到載體pCG185_GUS。
[0036]四倍體小麥Sterward，記載在如下文獻中:He Y，Jones HDj Chen S，Chen XMj WangDWj Li KXj Wang DS，Xia LQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation of durumwheat (Triticum turgidum L var.durum cv Stewart) with improved efficiency.Journal ofExperimental Botany61:1567-1581.;公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。
[0037]實施例1、GR79基因的優化及合成融合基因wCTP:GR79m
[0038]GR79基因從極端汙染環境草甘膦抗性菌株中分離，由中國農業科學院生物技術研究所提供。優化時主要考慮以下幾個方面:小麥密碼子偏好性、GC含量、導肽。本發明的導肽是來自小麥RubisCO小亞基的葉綠體導肽(wCTP)。優化前後基因序列及GC含量特徵見。按小麥密碼子偏好性優化後的序列與原核苷酸序列同源性為73.62%，優化前後密碼子使用度如圖7。
[0039]優化後的GR79m基因與葉綠體導肽(wCTP)的基因結合的融合基因命名wCTP:GR79m，其核苷酸序列為序列表中的序列I自5』末端第2192-3675位核苷酸，其中序列I自5』末端第2338-3675位核苷酸為GR79m基因，自5』末端第2192-2337位核苷酸為葉綠體導肽基因wCTP。
[0040]融合基因wCTP:GR79m編碼的蛋白命名為wCTP:GR79m，其胺基酸序列為序列表中的序列2，其中序列2自5』末端第50-494位胺基酸殘基為GR79m，自5』末端第1_49位胺基酸殘基為葉綠體導肽wCTP。
[0041]融合基因wCTP:GR79m可以人工合成。
[0042]實施例2、wCTP:GR79m基因在抗草甘膦中的應用
[0043]一、 pCS167-wCTP:GR79m 過表達載體的構建
[0044]pCG185-UMN載體具體構建方法為:從pAHC_PSK中擴增約2500bp的Ub1:MCS:Nos片段，引物兩端加PacI位點，擴增產物PacI酶切後插入pCG185T_DNA內的PacI位點，得到中間載體PCG185-UMN。
[0045]優化後的基因由上海生工合成，並克隆到pUC57載體中，得到載體質粒pUC57-wCTP:GR790 用 SpeI 酶切 pUC57_wCTP:GR79 回收 1503bp wCTP:GR79m 片段，回收片段與SpeI酶切去P的PCG185-UMN載體連接，獲得由Ubiqutin啟動子驅動的表達載體，命名為pCG185-wCTP:GR79m，構建過程如圖1A。
[0046]重組質粒pCG185-wCTP:GR79m用SpeI酶切鑑定，結果如圖1B所示，正確連接會產生約6.3kb大小的載體條帶和1.5kb大小的wCTP:GR79條帶，鑑定正確。經測序，序列比對
一致且方向正確。
[0047]將重組質粒pG185_wCTP:GR79m 中用 PacI 酶切，回收 Ub1-wctp:GR79m_nos 表達盒，回收片段與PacI酶切去P的pCS167連接，得到pCS167-WCTP:GR79m表達載體，構建過程如圖2A。
[0048]重組質粒pCS167-wCTP:GR79m用PacI酶切鑑定，結果如圖2B所示，可以看出，如正確會產生約10.4kb大小的載體條帶和4.0kb大小的Ubip-wCTP:GR79條帶，酶切結果正確。
[0049]經測序，質粒pCS167_wCTP:GR79m為將序列表中序列I所示的Ub1-wctp:GR79m-nos表達盒插入pCS167載體PacI酶切位點間得到的重組質粒。
[0050]序列I所示的Ub1-wctp:GR79m-nos表達盒,其中，自5』末端第123-2162位核苷酸為Ubi啟動子，2192-2337位核苷酸為wctp，2338-3675位核苷酸為GR79m，3685-3991位核苷酸為終止子nos。
[0051]二、質粒 pCS167-wCTP:GR79m 轉入小麥得到轉 wCTP:GR79 小麥
[0052]1、農桿菌的轉化
[0053]載體pCG185-GUS T-DNA內只含有gus基因，作為報告基因。載體pCS167-wCTP:GR79m有3個功能，一是作為pCG185_GUS的輔助質粒，使其在農桿菌中正常複製；另一方面作為標記基因用於植物的篩選；另外gus和wCTP:GR79m分別位於2質粒的獨立T-DNA內，可通過後代分離獲得無標記轉基因植株。[0054]用pCS167_bar (將序列6所示的ub1:bar:nos表達盒插入pCS167的PacI酶切位點間得到的載體)作為對照載體。
[0055]將pCG185-GUS 和上述二製備的 pCS167_wCTP:GR79m 質粒 1:1 混合，參照 B10-DAD電擊儀說明書，將此載體組合通過電擊法轉入根癌農桿菌AGLl中，命名為5G7E-AGL1 (提取質粒，測序後驗證正確)。
[0056]對照載體pCG185-GUS和pCS167_bar按1:1混合，按上述電擊轉化方法，轉入根癌農桿菌AGLl中，命名為5G7B-AGL1。
[0057]2、小麥轉化
[0058]取散粉後12-15天的小麥(小麥為四倍體小麥Sterward)穗子，剝取中部大而飽滿的種子，用70%酒精漂洗5min,然後在10%的次氯酸鈉中消毒IOmin,無菌水漂洗3_5次，除去殘留的次氯酸鈉。在超淨臺中分離未成熟胚，接種於共培養基上。
[0059]將Iml保存的5G7E-AGL1菌液，接種到IOml MGI71培養液中(含200mg L4Carb、IOOmg I71 的 Kan、Img I71 的 Biotin)中，28°C , 250rpm mirT1 暗處過夜培養,至菌液濃度 OD6tltl達到0.5-1.0之間。
[0060]將上述菌液離心沉澱後，菌體重懸於8ml CM4C中(200 μ M As), 28 °C , 250rpm mirT1振蕩培養l_3h，使用時每管加入120 μ 11 % silwet (15 μ I L-11)，倒入已切好的胚中，避光侵染15-30min，期間輕輕晃動幾次，然後吸乾菌液，將胚轉移至另一培養基中，23°C _25°C暗處共培養2-3天。共培養後將胚轉移至誘導培養基中誘導一周，然後轉入含0.5mM草甘膦的誘導培養基上2周，之後移至再生培養基上光照培養(含0.1mM草甘膦和0.lmM3AA (其中3AA為:酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)21天；之後移至含0.02mM草甘膦和0.lmM3AA的再生培養基上繼續培養21天；繼續在含0.02mM和0.lmM3AA中培養21天；抗性再生苗轉移至再生培養基上恢復培養2周。存活苗移入溫室土盆中，正常條件管理，得到再生小麥(優化後)。
[0061]對照載體5G7B-AGL1轉化過程同5G7E-AGL1，對照載體侵染後在含草甘膦的培養基上，不能正常生在，表現為誘導後期，愈傷變黃，再生階段無再生芽，最終未形成再生苗。
[0062]說明用5G7E-AGL1侵染轉化後可在含草甘膦的培養基上獲得再生苗，而對照載體侵染轉化後誘導再生受到抑制，無再生苗形成。
[0063]3、轉基因小麥的獲得
[0064]因為gus基因和wCTP:GR79基因分別位於兩雙元載體的T-DNA內，會出現單獨整合和共整合的情況。對存活苗分別進行，gus和wCTP: GR79m PCR檢測。
[0065]根據其基因序列設計特異引物，以29棵再生小麥(優化後)葉片總DNA為模板，初步檢測陽性植株。其中gus PCR檢測引物為:上遊引物:
[0066]5，-AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC-3，，下遊引物:
[0067]5』 -ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA-3 』 ；wCTP: GR79m PCR 檢測弓丨物為，上遊引物:
[0068] 5』 -GGCGGAACTATCCAAGTG-3』，下遊引物:5』 -CGAAATAAGCGGGACAGG-3』。
[0069]PCR 反應體系為 25μ1，包括 2.5 μ 110XPCR buffer、2 μ 1250 μ M dNTP、
0.5 μ 110 μ M 引物 F0.5 μ 110 μ M 引物 R、rTaq DNA 聚合酶 0.2 μ 1、模板 DNAl μ I 和ddH2018.3μ I。反應條件為:94°C預變性4min，94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸 lmin，35個循環，最後72°C延伸IOmin0 wCTP:GR79m PCR檢測引物為:上遊引物:下遊引物:PCR反應體系同gus檢測，反應條件為:94°C預變性4min，94°C變性40s，60°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環，最後72°C延伸IOmin。以野生型小麥對照。
[0070]結果如圖3所示，M =Marker DL2000 ；P:質粒pCS167_wCTP:GR79m ；CK:野生型小麥；1-22:再生小麥(優化後)；可以看出，PCR在22棵植株中可擴增出wCTP:GR79m特異條帶，條帶大小與預期一致，平均轉化效率為2.03%。其中14棵中可同時擴增出與預期大小一致的gus特異條帶，為共整合植株。具體為株系2、4、5、6、9、10、14、17、21、22為只整合有wCTP:GR79m 的植株，1、3、7、8、11、12、13、15、16、18、19、20 為 gus 和 wCTP:GR79m 共整合植株。
[0071]對初步獲得的14棵gus和wCTP:GR79m共整合植株，⑶S染色進一步確定，共整合植株葉片可出現藍色；而只含wCTP:GR79m的植株染色無變化。
[0072]對14棵gus和wCTP:GR79m共整合植株進行wCTP:GR79m的Southern分析。用CTAB法提取葉片基因組DNA，約40 μ g DNA用KpnI酶切，純化後經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，用喊轉移法轉到 hybond-N+ 膜上(Amersham Biosciences), 80°C真空固定 2h。southern雜交採用Roch DNA地高辛標記和檢測試劑盒I，隨機引物法標記探針，42°C預雜交l_3h後，42°C過夜雜交。按說明書步驟洗膜，染色。雜交的原理如圖4的上圖所示。
[0073]雜交結果如圖4下圖所示，用500bp的wCTP:GR79m探針雜交。M = A-HindIIIladder ；P:質粒 pC S167_wCTP:GR79m ；CK:野生型小麥;1_7:gus 和 wCTP:GR79m 共整合植株，表明wCTP:GR79m已穩定整合到小麥基因組，不同株系間拷貝數不同。
[0074]上述結果證明，14棵gus和wCTP:GR79m共整合植株為Ttl代轉wCTP:GR79m小麥(GM) ο
[0075]三、轉基因植株中wCTP:GR79m的表達水平分析
[0076]1、RNA 的提取
[0077]準備工作:RNase_free離心管、RNase-free槍頭、研磨棒及研缽20CTC烘烤2h。RNase-free H2O配製的75%乙醇。具體過程:
[0078]取-80°C保存的Ttl代轉wCTP:GR79m小麥(GM)葉片約50_100mg，置於液氮預冷的研缽中，充分研磨至粉末狀；加入1ml TransZol Up (TransGen),用力吹吸,混勻,移至離心管中；加入20(^1氯仿，劇烈震蕩303，室溫孵育31^11 ;lOOOOrpm，4°C離心15min ;轉移上層水相至新離心管中，加入500 μ I異丙醇,混勻，室溫孵育IOmin ;10000rpm,4°C離心10min,管底及管壁出現膠狀沉澱；沉澱中加入lml75%的乙醇，劇烈漩渦使沉澱漂浮。7500rpm，4°C離心5min ;棄上清，超淨臺放置5min，沉澱中加入50 μ I RNA溶解液，55°C _60°C助溶。_80°C保存。瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計檢測RNA的質量和濃度。
[0079]2、cDNA第一鏈的合成
[0080]cDNA 第一鏈用試劑盒合成(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix Kit, TransGen, Beijing) 0 合成所用引物為 Oligo (dT) 18,模版用量I μ go反應體系:
【權利要求】
1.一種DNA分子，是如下(1)-(4)中任一種的DNA分子: (1)編碼區為序列表中的序列I所示的DNA分子； (2)編碼區為序列表中的序列I自5』末端第2338-3675位所示的DNA分子； (3)在嚴格條件下與(I)或⑵限定的DNA序列雜交且與抗草甘膦相關的蛋白的DNA分子; (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且與抗草甘膦相關的DNA分子。
2.含有權利要求1所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3.如權利要求2所述的重組載體，其特徵在於: 所述重組載體為將權利要求1所述DNA分子插入表達載體中，得到的重組載體。
4.擴增權利要求1所述DNA分子全長或其任意片段的引物對。
5.權利要求1所述DNA分子或權利要求2所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控植物對草甘 膦抗性中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於:所述植物為單子葉植物。
7.一種培育轉基因植物的方法，為將權利要求1所述DNA分子導入目的植物，獲得轉基因植物，所述轉基因植物抗草甘膦性高於所述目的植物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於:所述DNA分子通過權利要求2所述的重組載體導入目的植物。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於: 所述目的植物為單子葉植物，所述單子葉植物具體為小麥。
【文檔編號】C12N15/11GK104004777SQ201410250631
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】夏蘭琴, 王根平, 林敏 , 陸偉 申請人:中國農業科學院作物科學研究所