人類乳頭狀瘤病毒肽的表達以及在致免疫組合物中的應用的製作方法

2023-04-27 10:58:26 2

專利名稱：人類乳頭狀瘤病毒肽的表達以及在致免疫組合物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組細胞、肽、抗體、組合物以及能夠用來抑制和治療人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染和細胞轉化的方法。
包含並表達一種編碼了HPV一個蛋白區域的DNA插入物或一種由哺乳動物細胞中的HPV基因誘發的肽的重組細胞被製備出來，例如像表達HPV E6或E7核蛋白基因產物的一個抗原決定區域的重組牛痘病毒，或包含和表達HPV的E6或E7核蛋白基因產物的一個區域的轉染的或重組病毒感染的重新構建的成纖維細胞，上皮細胞，淋巴或腫瘤細胞。與HPV16E6和E7蛋白的抗原決定區域相應的特異肽已被製備出來，而且這些肽已被用於致免疫組合物和疫苗中。並描述了抑制和消退患者體內的HPV感染和腫瘤發展的治療和預防的方法。
對實驗動物，特別是齧齒動物的研究表明大多數由致瘤病毒引發的腫瘤表達了由病毒基因組編碼的抗原，而且採用這些抗原的免疫法可導致隨後的由相同病毒誘發的腫瘤細胞激發的排異反應。儘管這些研究的大部分是利用實驗室病毒株進行的，例如SV40，多瘤病毒，及Friend，Moloney，或Rauscher鼠白血病病毒，但實際上瘤誘發病毒的水平和垂直傳染已被證實現在確實可以得到對抗病毒誘發的貓白血病和肉瘤的商業疫苗。
相比之下，大多數人類癌症的病毒病原學說尚未被證實，可能的例外是肝炎病毒(肝細胞瘤)，Epstein Barr病毒(鼻咽癌)，以及人類乳頭狀瘤病毒(HPV16)(宮頸癌)。然而，在過去的二十年中，已經證實，某些人類腫瘤細胞表達腫瘤抗原，即能夠將腫瘤細胞與其正常細胞區別開的抗原，某些患者對於這些抗原產生細胞-傳導的或體液免疫應答(Hellstrom等，1968年，Nature，2201352;Morton等，1968年，Science，1621279-1281;Shiku等，1976，J.Exp.Med.144873-881)。這些免疫反應的某些靶是由人類基因組編碼的胎兒瘤抗原或分化抗原(Hellstrom等，1970，Int.J.Cancer 6346-351)。
直到目前為止，腫瘤抗原的分子特性仍是未知的，而且腫瘤的這種免疫學反應的特異性程度也不清楚。而試圖將這些信息用在發展癌症的診斷測定或癌症的治療方面的作法也很不成功。由於腫瘤的自發消退幾乎罕見，因此，人們可以得出結論，即在玻璃試管中被證實的免疫應答並非在體內有效。例如，來自癌症患者體內的抗體及淋巴細胞可有效地用於殺滅玻璃試管內的腫瘤細胞，而同一癌症患者的免疫應答在體內卻不足以阻止腫瘤的發展。
由Kohler和Milstein所發展的單克隆抗體技術(1975年，Nature，256495-497)引導了對於人類腫瘤抗原的深入的研究，因為該技術不僅在分子水平上而且在特異性方面為定義這樣一些抗原提供了手段(Hellstrom和Brown，1979，in The Antigens，M.Sala，ed.，Academic Press，Vol.V1-66)。
在過去幾年中，已描述了大量的與腫瘤有關的抗原，其中大多數已採用小鼠單克隆抗體進行了定義(Reisfeld和Sell eds.編緝，1985年，in Monoclonal Antibodies and Cancer Tllerapy，UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology，New Serres，Vol.27，Alan R.Liss，Inc.New York，pp.1-609)。雖然實際上所有已明確描述的抗原都已被證明是胎兒瘤或分化抗原，而且它們對於腫瘤的特異性已被發現是定量的而不是定性的，有幾種抗原對於腫瘤細胞和正常細胞具有足夠的特異性(通常對應一個10到1000倍的因子)，以致可以用作鑑別腫瘤細胞和治療的潛在目標。針對腫瘤抗原的人類單克隆抗體也已得到(Cote等，1983年，Proc.Natl.Acad.Sci.802026-2030)。這就支持了前面所引用的證據，即某些癌症患者增強了對其腫瘤的免疫應答。許多這些腫瘤抗原是由人類染色體編碼的，而在某些情況下，這些腫瘤抗原是內原性或外原性病毒感染的結果。
人類乳頭狀瘤病毒是眾所周知的在其宿主內產生上皮細胞瘤如疣和乳頭狀瘤的傳染劑。普通手疣和足蹠疣是人類最常見的皮膚損害;然而，在男性和女性中的鱗狀細胞癌和生殖器癌也普通與某些HPV感染株有關。
乳頭狀瘤病毒基因組包含一個具有約5，000千道爾頓(KDa)分子量的雙股環狀超螺旋DNA分子。該基因組在8和10個蛋白質之間編碼，這個數目還不確定，因為尚未將一種功能或蛋白質產物賦予基因組的每一個開放閱讀構架(ORF′s)。在複製早期疣形成的ORF′s最初被指定為E，而後來形成的那些ORF′s被指定為L。但是這種指定已不再有效，且已經發現某些E基因產物形成於感染的早期和晚期。
HPV感染與子宮頸癌和其它人類非生殖器癌有很大關係(ZurHausen等，1989，Cancer Res.494677-4681;Galloway等，1989，Adv.Virus Res.37125-171)。一種HPV類型，HPV16，通常與嚴重發育不全和宮頸癌有關(Galloway等，Supra;Ikenberg等，1983，Int.J.Cancer 32563-565)，在這種疾病中，某些病毒E基因及其蛋白質產物已顯示出突出的作用。採用一種通訊基因，如氯黴素乙醯轉移酶，所進行的試驗區表明，E6基因轉移激活了HPV DNA的非編碼段(Phelps等，1988.Cell 53539-547)。E7核蛋白質已顯示出在哺乳動物細胞中轉化和保持惡性表現型的作用(Tsunokawa等，1986年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA832200-2203;Kanada等，1988年，J.Virol.62610-613;Crook等，1989年，EMBOJ.8513-519)。
對於實驗動物，通常為小鼠的研究已表明，採用活的或死的癌症細胞的免疫接種可以導致隨後由能成活的癌症細胞激發的排異反應。在許多情況下，負責保護作用的靶抗原已被按病毒編碼，但在其許多情況下，激發一種保護性免疫應答的抗原的特性仍是未知。
建議在人體上應用癌症疫苗的一個主要的、理論上的反對意見是，「接種」例如被殺滅的癌細胞或沒有細胞的製劑的人可能是免疫學上無應答的。據信這是經常發生的，因為在某些正常細胞中存在可以作為免疫應答靶腫瘤抗原，雖然僅僅是微量的，而且被免疫系統視為「自身」。針對這種「自身」抗原的免疫接種，如果有效的話，可能導致一種自身免疫應答。大多數的(如果不是所有的)由單克隆抗體在人類腫瘤中檢測出來的與腫瘤有關的抗原還存在於某些正常組織內，而且幾乎沒有證據證明癌症患者在體內對這些抗原具有有效的響應。另一方面，對於人類免疫系統是外來的一種抗原，例如，一種被致瘤病毒，如HPV16編碼的抗原，應該很可能誘發一種強的免疫應答。為預防病毒感染和細胞轉化而利用重組DNA技術生產疫苗包括在一種適當的載體中分子克隆和表達編碼了病毒蛋白的遺傳信息，所說病毒蛋白能夠在宿主動物中針對該蛋白質激發免疫應答。一種新的對於這種疫苗的製備可能是有用的方法已被描述(Mackett等，1982年，Proc.Natl.Acad.Sci.797415-7419;Mackett等，1984年，J.Virol.49857-864;Panicali等，1982年Proc.Natl.Acad.Sci.794927-4931)。該方法包括將牛痘病毒用作載體來表達插入其基因組中的外來基因。由於引入到宿主動物中後，該重組的牛痘病毒表達該被插入的外來基因，並且因此激發對該基因產物的宿主免疫應答。由於這種活的重組牛痘病毒能夠被用作一種疫苗，所以，該項方法結合了亞單元和活疫苗二者的優點。
表達來自外來病毒的抗原的重組牛痘病毒已被發現在實驗動物中誘發，對外來病毒刺激的抗性。實例包括表達一種HSV糖蛋白(Cremer等，1985，Science 2281985)，一種狂犬病毒表面抗原(Blancou等，1986，Nature 322373)的重組疫苗病毒，非表達HPV16就是表達牛乳頭狀瘤病毒蛋白(Lathe等，1989，in Vaccines for Sexually Transmitted Disease，A.Meheus和R.E.Spiel，eds，Butterworth Co.pp.166-177)以及一種流感病毒核蛋白的重組疫苗病毒(Smith等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 807155;Yewdell等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 821785)。已有報導說，表達流感病毒核蛋白的重組牛痘病毒在免疫接種的小鼠體內誘發了對流感病毒特異的T細胞中介的免疫性(Bennink等，1984年，Nature 311578)。此外，利用被表達流感病毒核蛋白的重組牛痘病毒感染的靶細胞，已證實流感病毒核蛋白被流感陽性血清供血者的細胞毒素T細胞識別出來(McMichael等，1986年，J.Gen.Virol.67719)。類似地，最近已發現，被一種表達HSV糖蛋白的重組牛痘病毒感染的人的靶細胞被HSV特異的人CTL克隆所識別。(Zarling等，1986年J.Virol.59506)。
本發明涉及重組細胞，肽，抗體，組合物以及抑制和治療人類乳頭狀瘤病毒感染和腫瘤抑制或退化的方法。
本發明的重組細胞包含一個編碼了肽的基因，該肽基本上對應於一個由於人類乳頭狀瘤病毒感染而被表達的肽的胺基酸殘基序列，如一種基本上對應於E6和/或E7基因產物的一段區域或HPV蛋白質的一段或多段區域的嵌合肽化合物的肽。這種肽能夠基本上對應於一種由於HPV感染而被表達的HPV蛋白或對應於一種由於將HPV基因插入到哺乳動物細胞內而被表達的細胞肽。本發明的重組細胞包括通過含有編碼了人類乳頭狀瘤病毒的一個蛋白質段的附加的DNA被分別轉染或轉化的真核和原核細胞。作為例證的重組細胞包括細菌、病毒如牛痘病毒，哺乳動物細胞如轉染的上皮或成纖維細胞或淋巴細胞和編碼了這樣一個與HPV有關的蛋白質段的腫瘤細胞如子宮頸癌細胞。激發B細胞和/或T細胞應答的可溶性蛋白質和肽也被包括在本發明之中。
與這樣一些蛋白質和肽相仿的和/或與之競爭結合位點的抗體分子也被包括在本發明之中。特別優選的抗體是針對與HPV16 E6和/或E7蛋白的特異區域相對應的肽的抗體和針對這些抗肽抗體的抗特異基因型抗體。
本發明的組合物包含如上所述的重組細胞，抗體和/或肽，且最好是表達人類乳頭狀瘤病毒的E6或E7核蛋白的抗原決定區域的重組細胞和/或肽。本發明的組合物最好是能夠在受體中激發一種免疫保護應答的致免疫組合物。
所述的重組細胞、肽，和組合物被用在抑制和治療HPV感染和腫瘤產生和/或消退的方法中。在本發明的一個治療由人類乳頭狀瘤病毒感染而產生的疾病的方法中，將治療有效量的含有本發明重組細胞和/或肽的組合物施予患者一段足以抑制這種疾病進一步發展的時間。
還構思了一種在發現人類乳頭狀瘤病毒感染後抑制腫瘤發生的預防方法。在該方法中，將治療有效量的本發明組合物施予患者以便在該患者體內激發一種保護性應答，從而抑制在病毒感染細胞中腫瘤的發生。本發明還涉及一種抑制患者體內的人類乳頭狀瘤病毒感染的方法。在該方法中，足夠量的致免疫組合物被施予患者以便有效地在患者體內激發一種免疫學保護應答以抑制人類乳頭狀瘤病毒的感染。
致免疫組合物還可以被配製成包含表達HPV蛋白的抗原決定區域的重組細胞。例如，這樣一些組合物可包含一種主要組織相容性複合物(MHC)Ⅰ級陽性的非致瘤細胞，在該細胞內，已插入一種編碼了HPV蛋白的致免疫區域的基因。該組合物的重組細胞則可以被施予患者以便通過激發起針對該被表達的肽區域的致免疫應答，促進對腫瘤的排異作用。該肽區域也在腫瘤細胞中被表達。
該致免疫組合物還可被配製成一種疫苗，在這種情況下，免疫原包括表達人類乳頭狀瘤病毒蛋白質的抗原決定區域的一種重組細胞。取決於被用作免疫原的重組病毒的特性，既可配製出滅活的病毒疫苗，也可配製出活的病毒疫苗。用本發明的這種疫苗成分或致免疫組合物進行適當的免疫接種能夠導致誘發一種免疫應答，該免疫應答在被免疫物體中導致了表達HPV抗原決定區域的腫瘤細胞的破壞，同時也抑制了HPV感染。本發明優選的重組細胞包括編碼和表達E6或E7HPV16核蛋白的抗原決定區域的牛痘病毒，及上皮細胞，成纖維細胞，淋巴細胞，血細胞和被E6或E7HPV16基因轉染的腫瘤細胞。
本發明進一步的優越性和有益性通過下面的具體描述，實施例以及隨後的權利要求，對於本領域的普通技術人員來說將是顯而易見的。
在附圖中

圖1表示將HPV16 E6開放閱讀構架克隆成兩個表達載體。
A.E6開放閱讀構架(ORF)取自HPV16全長DNA並作為鈍端了的DdeⅠ片段被克隆到已用SmaⅠ切割了的牛痘表達載體pGS62中。
B.E6ORF在pIC20H中被克隆以便在5′端引入HindⅢ位點，用於在如下所描述的pCDM8表達質粒中的CMV啟動子下段的定向克隆點。在未轉譯的E6ORF的5′端有58個鹼基對，在3′端有98個鹼基對。
圖2表示將HPV16 E7開放閱讀構架克隆成為兩個表達載體。
A.E7開放閱讀構架被作為TaqⅠ，PstⅠ片段，從全長度HPV16DNA中克隆到已被ClaⅠ和PstⅠ切割的pIC20R中。E7ORF在EcoRⅠ點處被克隆到牛痘表達載體pGS62中。
B.E7ORF被克隆到pIC20H載體中，以在該基因的5′端引入一個HindⅢ位點並置於pCD M8載體中的CMV啟動子的控制下。對於E7有56個ORF來說是未轉化序列5′的鹼基對，且有24個對於E7ORF來說是3′的鹼基對。
圖3表示由表達HPV16 E6蛋白的兩個不同的斑點純化的重組牛痘病毒所感染的細胞所得到的溶胞產物的放射免疫沉澱法的放射自顯影像。
牛痘溶胞產物按照例5所述製備，實行放射免疫沉澱法並且對沉澱電泳。通道1，3，5表示採用兔子對E6的抗血清(由D.Lowy提供)所得的結果;通道2，4和7採用正常的兔子血清，而通道6採用兔子的抗E7血清(α16E7NP)。抗原被註解在通道編號上方。溶胞產物從被標記了感染的細胞中製備，而且電泳膠是17.5%的聚丙烯醯胺。
圖4表示採用抗HPV16 E6或E7核蛋白的兔子抗血清沉澱的重組牛痘溶胞產物的放射自顯影圖像。
牛痘重組被感染細胞用35cys和35Met標記一小時。感染病毒被註解在通道號上方。施加放射免疫沉澱法，從而使通道1和5表示用抗HPV16E6兔子血清(D.Lowy)所得的結果，通道2，4和7表示採用正常兔子血清所得的結果;而通道3和6表示用α16E7NP得到的結果，標準的被染色的分子重量標記的位置註解在右側，而E6和E7的位置註解在左側。
圖5表示E7蛋白穩定性的脈衝跟蹤研究。
牛痘病毒感染的細胞如此後所述的，用35S-Cys和35S-Met脈衝標記一小時，然後，用非標記介質保溫一段時間，這段時間表示在通道號上方。感染病毒(vNY或vHPV16/E7)被列在時間標記上面。在所指示的時間段之後，為在17.5%的丙烯醯胺凝膠上作放射免疫自顯影分析，將細胞溶解並保持在0～4℃。奇數通道表示α16E7NP沉澱產物，而偶數標號的通道表示正常兔子血清免疫沉澱產物。分子量標記表示在右方。
圖6表示E7基因產物的放射免疫沉澱法，該產物是在用pCDM8-E7哺乳動物表達質粒短暫轉染的COS細胞中被表達的。
通道1和3表示了對於用兔子抗Trp E/E7沉澱的蛋白質所得到的結合方式。
通道2和4表示對於用正常兔子血清沉澱的蛋白質所得到的結合方式。
N＝核組分C＝細胞漿組分A.牛痘E7重組溶胞產物被用來作為對E7蛋白質的陽性對照。
B.pCDM8E7轉染的COS細胞。
C.未轉染的COS細胞。
圖7表示HPV16E6和E7核蛋白質的胺基酸殘基序列。
圖8表示針對HPV16E7蛋白的肽359的兩個單克隆抗體的滴定法。空白方塊表示雜種瘤克隆＃14，實的方塊表示雜種瘤克隆＃10。
圖9表示抗E6肽的抗血清滴定法的Western印跡。用來自E6ORF的肽對兔子免疫接種三天後取得的抗E6肽血清僅僅針對同系的特異的Trp溶合蛋白質(16E6DS)在Western印跡道上作滴定。編號(1)和(2)表示用相同的肽進行免疫接種的兩個不同的兔子。
圖10表示抗E7肽的抗血清滴定的Western印跡。加強接種後三天從用E7ORF的肽免疫接種的動物上取得抗E7血清針對特異的Trp融合蛋白(16E7NP)在Western印跡上滴定。編號(1)和(2)表示用相同的肽進行免疫接種的兩個不同的兔子。
圖11表示抗E6和E7肽的抗血清的兩種稀釋度的Western印跡。來自用E6或E7肽免疫接種的兔子的血清針對特異的Trp溶合蛋白和TrpE載體基因產物用Western印跡來證實血清中的反應性是專門針對HPV16E6或E7蛋白的。按照前述滴定法，最高血清稀釋比被選擇為靠近反應活性的終點。
用作原免疫原的特異性肽(以編號表示)被列在每組硝化纖維素通道的上面;每個通道中的抗原被表示在凝膠的頂部且所採用的兩種血清稀釋度被表示在底部，括號的下面。M表示預先染色的分子量標記。血清樣品在第一次或第二次加強接種後一周後被抽出供這些研究所用。抗血清α358，α360和α361在第二次加強接種後一周得到。抗血清α359在第一次增加強接種後的一周得到。
圖12表示抗E7肽的抗血清對E7天然蛋白的識別。來自第一次加強接種後一周從兔子抽取的抗肽359的抗血清被用於對35S-蛋氨酸及35S-半胱氨酸標記的牛痘E7重組感染細胞溶胞產物的放射免疫沉澱測量。對照α16E7NP(通道1)使17-18KDa帶段發生沉澱，α359兔子血清(通道3和4)同樣使相同分子量的帶段發生沉澱，而α360血清(通道2)未能使E7段沉澱。在右側可看到分子量標記。
圖13表示對來自HPV16E7轉染物的細胞質RNA和RT-PCR分析。通道包含(從左到右)pCDM8/E7質粒，作為陽性的PCR控制;分別來自N7.4和N7.2細胞的細胞質RNA，這些細胞是NCTC2555衍生的HPV16E7轉染物;NCTC2555細胞作為陰性對照;E7C3是M2黑素瘤衍生的HPV16E7轉染物;而且M2黑素瘤細胞作為一個陰性對照(par)。標準的鹼對標記在左側可見。
圖14表示在C3H/HeN小鼠體內的E7C3腫瘤的生長情況。在方框A中，在腫瘤細胞接種前用NCTC2555成纖維細胞使小鼠免疫，上述成纖維細胞已被HPV16E7(N7.2和N7.4，分別為空白三角和塗實的圓圈7或HPV16E6(N6.8，空白三角)基因轉染。方框B表示在E7C3腫瘤細胞接種之前，與用N7.2對小鼠的免疫接種相對照通過給小鼠接種磷酸鹽緩衝液(PBS，空白方塊)或被人類黑素瘤抗原P97(CL19，塗實的三角)轉染的NCTC2555成纖維細胞所進行的研究，方框C表示在接受E7轉染的NCTC2555成纖維細胞(N7.2)免疫接種的小鼠體內的親代M2黑素瘤細胞(par)的腫瘤生長情況。
圖15表示抗-CD8抗體對在接受N7.2細胞免疫接種的小鼠體內的腫瘤生長的治療效果。隨著免疫接種後，在施予E7C3腫瘤細胞之前，給小鼠注射抗CD8抗體(塗實的圓圈)或注射抗-CD5抗體(空白三角)。
圖16表示來自接受抗-CD8單克隆抗體(右組)或抗-CD5單克隆抗體(左組)治療的小鼠的CD4陽性和CD8陽性的脾細胞的動態血細胞計數分析。
本發明涉及重組細胞，肽，抗體，組合物，及用於抑制和治療人類乳頭狀瘤病毒感染和腫瘤發生的方法。重組細胞包括一種編碼了HPV蛋白，最好是E6和/或E7HPV核蛋白的DNA結構這些重組細胞表達一個多肽的抗原決定區域，該肽基本上與哺乳動物細胞中由於諸如通過HPD感染或重組方式插入一個HPV基因後在該哺乳動物細胞中被表達的肽相對應。在一個優選的實施例中，本發明的肽基本上對應於HPV蛋白的約8到30個胺基酸殘基段。在一個特別優選的實施例中，本發明的肽基本上對應於HPV16E6或E7蛋白的一個區域，並具體是對應於一個當將其施加給宿主時能夠用抗體和/或T細胞表面分子激發免疫反應的抗原決定區域。本發明還包括這些重組細胞的組合物，及能夠被用作致免疫組合物的肽，免疫治療法或用於治療患者的疫苗。在此還考慮了能夠與這些肽競爭結合位點的抗體分子。具體地說，產生出抗HPV16E6和/或E7蛋白的結合區域的抗體分子，及對抗這些抗體的抗特異基因型抗體，它們競爭在正常細胞蛋白和腫瘤細胞蛋白上的HPV結合位點，如與HPV16E7蛋白結合的視網膜胚細胞瘤基因產物(RB105)。本發明還涉及抑制和治療人類乳頭狀瘤病毒感染和瘤形成的方法。本發明一些具體的方法涉及治療由HPV感染引起的疾病，和在發現HPV感染後抑制和消退細胞中腫瘤的預防方法。本發明的另一方面涉及抑制患者體內HPV感染的方法。
為了更清楚地描述本發明及其實施例，下列定義被包括其中。
在此使用的「轉染」是指通過將附加DNA摻入到真核細胞中，獲得新的遺傳標記。
在此使用的「轉化」是指通過將附加DNA摻入到原核細胞中，獲得新的遺傳標記。
在此使用的「瘤形成」是指細胞獲得導致非受控細胞增殖的腫瘤特異表現型。
在此使用的「克隆載體是指任何可插入外來DNA以進行克隆的質粒或病毒。
在此使用的「質粒」是一種自主的自身複製染色體外的環狀DNA。
在此使用的「開放閱讀構架(ORF)」是指(潛在地)可被轉譯成蛋白質的DNA序列。
在此使用的「輔助病毒」是提供缺陷性病毒所缺少的功能的一種病毒，使後者能夠在混合感染過程中完成感染循環。
在此使用的「基因(作用子)」是編碼了一個肽鏈序列DNA片段;它可包括編碼區域之前和之後的區域(前端和尾部)，還有個別的編碼段(exons)之間的介入序列(introns)。
在此使用的「表達」是通過一結構基因來產生一種肽或蛋白質所經歷的過程。它是轉錄和轉譯的結合。
在此使用的「克隆」一詞描述具有單一祖先細胞或分子的任何數目的等同細胞或分子。
在此使用的「鹼基對」(bp)一詞是在DNA雙螺旋結構中腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)，或胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的組合。
在此使用的「表達載體」一詞是可以插入和/或表達外來DNA的任何質粒或病毒。
在此所使用的「下段」一詞是指在表達方向前面的那些序列;例如，基因的肽編碼區域相對於起始密碼子是下段或者沿著遠離基因的3′方向;上段是朝向所討論的序列的5′。
在此使用的「聚合酶鏈反應」(PCR)一詞是指通過成功的使用一種溫度穩定的DNA聚合酶複製DNA鏈來放大DNA分子，通過加熱、加入引子分離其互補鏈，並重複該過程約30次以產生約109個DNA複製品。通過使用PCR技術，微小量的DNA可以被放大並產生足以用在各種不同過程中的DNA。
以其各種不同語法形式出現的「接種物」一詞在此用於描述包含有本發明的重組細胞或肽的組合物，作為用於抗體製劑，或抗人類乳頭狀瘤病毒感染/轉形變異細胞的T細胞激發製劑的活性成分。當肽被用來誘發抗體時，應該理解，該肽偶而可被單獨使用，而更經常地是與載體相連或結合其它成分，但是為便於表達，這些變化此後將不經常表示出來。
接種物還可包括佐劑。佐劑如完全的Freund′s佐劑(CFA)，非完全Freund′s佐劑(IFA)以及明礬是本領域內熟知的物質，且可以在商業上從幾個貨源得到。
單個的接種物很容易用CFA或IFA製備。例如，將一定量的重組細胞或肽結合物溶解於pH7.2的PBS(約0.5毫升)中，其量應足以對每次接種提供所需量的重組細胞或肽組合物。然後，將等容量的CFA或IFA與溶液混合以提供一種接種物，其中包含該重組細胞和/或結合物，水，和佐劑，其中水與油的比例是1∶1，此後，均化該混合物給出了一種接種物。這樣製備出的接種物的容積一般大於1毫升，且一些重組細胞和/或肽組合物，PBS和佐劑可能在乳化過程中被損失。基本上所有能夠被吸回的乳化劑被置於注射器內，然後，如下面所討論的那樣被注入到動物體內。注入到諸如兔子或小鼠這類動物體內的接種物的數量應該是至少約為在乳化步驟進行之前存在量的90%。
在本發明的接種物中，重組細胞和肽既可以單獨被包括，也可以結合到一載體蛋白，如鑰孔
血藍素(KLH)加上生理上可接受的稀釋劑，如帶有佐劑的水或PBS。KLH是可接受的用於動物體內的載體，但對於商業規模上的使用是很昂貴的，還考慮使用替換的載體，其中包括大豆凝集素，氫氧化鋁(alum)，牛血清白蛋白(USA)，卵白蛋白，花生凝集素，破傷風類毒素，及聚-L-賴氨酸。皂角苷、一種植物產生的葡萄糖苷，也是一種熟知的佐劑，可在商業上從俄亥俄州，辛辛那提的Berghausen化學公司以5%的固溶體形成得到，並在此能與氫氧化鋁一起使用。
上述的接種物原溶液是用來說明本發明的接種物的，如在此所證實的，它們可被用來產生抗體分子或激發與本發明的重組細胞和/或肽進行免疫反應的T細胞。
以其各種不同的語法形式出現的「致免疫組合物」一詞在此被用來描述一種接種物類型，它包含本發明的重組細胞或肽，即，被用來在宿主動物中誘發免疫活性的一個活性成分。在一個優選實施例中，本發明的致免疫組合物可以是一種疫苗。由於免疫活性既包括抗體的產生，也包括激發起一個細胞的免疫應答，因此疫苗和接種物可包含這些同等的成分，但其用途不同。在多數情況下，用於疫苗的成分和用於接種物的成分是不同的，因為許多用於動物的佐劑不可以被用於人類。
在本發明的研究中所採用的相對較小的肽是在403A型應用生物系統肽合成器上利用Merrifield的固相方法合成的(1963，J.Am.Chem.Soc.852149-2154)，該文獻被結合在本申請中。在該序列的C端或N端插入了一個增加的半胱氨酸殘基。當從樹脂中分裂出來並保護之後，該肽被反相高效液態色譜法提純。在將其用作免疫原之前，通過其半胱氨酸殘基，採用雙功能試劑琥珀醯亞磺胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己糖-羧酶將肽與KLH耦合。
在此使用的「合成的」一詞是指已由化學手段，即化學合成，構成的肽分子，而不是採用生物學手段，如遺傳工程技術，製備的。
在此使用的疫苗和致免疫組合物包含所說量的單獨的肽，重組細胞，結合物或其組合。這些致免疫組合物還包含生理學上可容許的稀釋劑，如水或鹽水，一般還包括佐劑，如完全Freund′s佐劑和非完全Freund′s佐劑。
致免疫的原溶液用IFA或CFA按如下方法製備足以產生所需每次接種量的一定量的合成肽結合物和/或重組細胞被溶解於磷酸鹽緩衝液(PBS)中。然後，將等容積的CFA或IFA與該溶液混合以提供包含該細胞和/或肽，水及佐劑的合成物，其中水與油的比率為1∶1。此後混合物被攪勻以得到原溶液。
在此使用的「抗原決定區域」一詞是一個結構範圍，如能夠在宿主中與抗體分子或T細胞表面分子激發一種特異性免疫反應的分子的一個特異的胺基酸殘基序列或肽段。一個抗原決定區域可包含一個或多個抗原決定子和/或致免疫決定簇。
在此使用的「抗原決定基」一詞指負責與相應的由相同的或相關的抗原或免疫原激發的抗體(免疫球蛋白)分子或T細胞表面分子進行特異性反應的分子結構成分。
在此使用的「致免疫決定子」一詞指負責在宿主中誘導產生包含一個在用作抗原時與免疫原結合的抗原結合位點(基因型)的抗體或T細胞表面分子的分子結構成分。
在此可相互變換使用的「抗特異基因型」和「抗特異基因型抗體」二詞是指一種抗體，其抗原結合位點特異性地與為抗特定抗原(如乳頭狀瘤病毒抗原)而製備的原始抗原的特異基因型相結合，使抗特異基因型抗體與抗原始抗體競爭與抗原的結合。
在此使用的「抗原」一詞是指被一種由於對所提出的結構成分的應答而產生的抗體或T細胞表面分子所結合的實體。
在此使用的「免疫原」一詞，描述在宿主動物中誘發產生抗體或特異性T細胞應答的實體。
「單位劑量」一詞指對動物適合作為單元劑量的物理上離散的一些單位，每個單位包含預定量的活性物質，該預定量的活性物質與所需稀釋劑(即一種載體或賦形劑)結合在一起能產生所期望的治療效果。本發明的新穎的單位劑量的規範受下列因素所支配，並直接依賴於它們，即(a)活性物質的獨特的特性以及要取得的特定的治療效果，和(b)在合成這種治療用的活性物質的技術領域內固有的限制。
在此使用的「有效量」一詞意指足以有效地抑制由於HPV感染而引起的細胞的感染和/或腫瘤的發生。
對於特定患者來說的有效量可以根據諸如感染狀況患者的整體健康情況，施用方法，副作用的嚴重性等這樣一些因素而變化。
在此以及在權利要求書中有關肽序列所使用的以其各種不同語法形式出現的「相應」一詞意指所述肽序列在氨基和羧基末端的任一端或同時在該兩端加上或減去最多3個胺基酸殘基，而且在沿該肽和/或多肽序列的特定的胺基酸殘基中僅包含保守替換。
上面所使用的「保守替換」一詞指一個胺基酸殘基已被另一個，生物學相似的殘基所替代。保守替換的例子包括用一個疏水殘基，如Ile，Val，Leu，或Met替代另一個或用一種極性殘基替代另一種，如Arg和Lys之間，Glu和Asp之間或Gln和Asn之間或類似情形的替換。
在一些例子中，由一種帶相反電性的離子殘基進行的離子殘基替換，如Lys替代Asp，已在本技術領域內被確定為是保守替換，因為那些離子基團被認為很少對可溶性提供援助。然而總體說來，由於在此所討論的替代相對於一個完整的蛋白質來說是在相對較短的合成肽區域上進行的，一個離子殘基被另一個帶相反電性的離子殘基的替代在此被認為是「基團替代」，如由非離子的和離子殘基、和大殘基如Phe，Tyr和Trp以及稍大的殘基如Gly，Ile和Val的替代就是基團替代。
在此按其通常的含義使用的「非離子的」和「離子的」殘基分別指那些在生理pH值下，不帶電或通常帶一種電荷的胺基酸殘基。示例的非離子殘基包括Thr和Gln，而示例的離子殘基包括Arg和Asp。
抑制和治療患者體內的人類乳頭狀瘤病毒感染，瘤形成和腫瘤的發生是本發明的目的。證實在被感染細胞中的乳頭狀瘤蛋白和肽的表達鼓舞本發明者去研究在此所描述的重組細胞、肽和方法。
本發明的重組細胞包含一個基本上與人類乳頭狀瘤病毒的一個DNA區域相似的基因插入物。在一個實施例中，基因插入物編碼了HPV16E6和/或E7核蛋白的區域。在一個特別優選的實施例中，E6和/或E7蛋白的抗原決定區域被表達。在另一個實施例中，基因插入物在含有該基因插入物的重組哺乳動物細胞內誘發了細胞蛋白質的表達。
本發明考慮了誘發HPV蛋白區域的表達系統，並包括病毒，如牛痘病毒和腺病毒，成纖維細胞，如COS猴細胞和人類角化細胞，腫瘤細胞如CaSki宮頸癌細胞和黑素瘤細胞，以及其它哺乳動物細胞如上皮細胞和淋巴細胞。在另一個實施例中，MHC1級陽性的、且最好是非致瘤的細胞用一個編碼了HPV蛋白一個區域的基因轉染。在一個特別優選實施例中，一個編碼了HPV16E6和/或E7蛋白的一個區域的基因被插入到這些MHC1級陽性細胞中或在用含有這些基因的重組細胞感染後被表達，且作為一種促使腫瘤退化的方法，將包含這些細胞的致免疫組合物施用於有HPV16誘發腫瘤的患者體內。這種腫瘤退化是隨著由致免疫細胞在患者體內誘發的免疫應答而產生的，該應答因而是直接針對腫瘤的。
本發明的重組細胞是表達系統，或細胞，它們包含有編碼HPV蛋白區域的插入基因結構。本發明的一些說明性的表達系統或細胞包括諸如在一種致免疫組合物或一種疫苗中的病毒如牛痘病毒，還原病毒，腺病毒，脊髓灰質炎病毒以及能夠以非致病方式施予患者的其它病毒，能夠用HPV基因感染、轉染或轉化的細胞如外周血液淋巴細胞和上皮細胞。本發明的構思包括了能夠整合和表達人類乳頭狀瘤病毒和基因的一個區域的所有細胞。被表達基因產物的胺基酸殘基中的一些不會很大削弱致免疫性的變化以及對於E6和E7區域來說具有相似的胺基酸殘基的特異肽段也在本發明的構思之中。
在一個實施例中，本發明的基因構建物是通過克隆一個ORF製備的，該ORF與人類乳頭狀瘤病毒核蛋白的一個區域如HPV16的E6或E7蛋白相對應，它是通過限制性內切酶從一個含有更大部分HPV16基因組的質粒上取得的。該限制片段然後通過如Auswbel，F.M等人(1990，「Current Protocols in Molecular Biology」，Greens Publishing Assoc.and Wiley Interscience)和Maniatis，T.等人(1982，「Molecular CloningA Laboratoy Manual」Cold Spring Harbor Laboratory，NY)描述的標準分子生物學方法被克隆到表達載體中。
包含所需ORF的表達載體然後進一步處理，並被插入宿主細胞的基因組中以通過如同系重組或用選擇性壓力整合;或通過細胞的病毒感染被引入來產生本發明的重組細胞。
被選取用於將選定的ORF片段插入到該克隆載體中以形成重組DNA分子的特定位點是由本技術領域的普通技術人員所熟知的多種因素所決定的，這些因素如被表達的肽或蛋白的大小和結構，由宿主細胞產生的基因產物的降解敏感性以及標準終止密碼子的位置等。
在一個特別優選的實施例中，本發明的宿主細胞是牛痘病毒。牛痘病毒包括約1874鹼基對的一個線性雙螺旋DNA基因組，並在被感染細胞的細胞質中複製。這些病毒在病毒核中包含一個對病毒的感染性是不可缺少的完全的轉錄酶系統(包括髓蓋酶，甲基化酶和多腺甘酶)。牛痘病毒轉錄調節序列(啟動子)允許通過牛痘RNA聚合酶，而不是宿主細胞RNA聚合酶開始轉錄。
在重組牛痘病毒中的外來DNA的表達需要將牛痘啟動子連結到外來基因的蛋白質編碼DNA序列上。已構建了質粒載體，也稱插入載體，用於將外來基因插入牛痘病毒中。一類插入載體由下構成(a)包括轉錄起始位點在內的牛痘病毒啟動子;(b)幾個用於插入外來DNA片段插入物、位於轉錄開始位點下遊段的獨特的限制性內切酶克隆位點;(c)在啟動子側面的非必需牛痘病毒DNA(如TK基因等)以及將該外來基因插入物引導進入該病毒基因組的該同系非必需區域中的克隆位點;和(d)複製的一個細菌源以及在大腸桿菌(E.Coli)中複製和選擇用的抗菌素抗性標記物。這樣一些載體的實例已由Mackett(Mackett等人，1984，J.Virol.49857-864)描述過。
重組牛痘病毒產生於含有外來基因的重組病毒插入質粒被轉染到以前被牛痘病毒感染的細胞中之後。同系重組在被感染的細胞內發生並導致外來基因插入到病毒基因組中。被感染的細胞可利用免疫學技術，DNA斑快雜交，或對最終可被分離的重組病毒的遺傳學選擇被篩選出來。這些牛痘重組體保留了其基本的功能和感染性，並可被構建成包含約35千鹼基對的外來DNA。外來基因表達的檢測可通過利用Northem印跡法或點印跡法及核酸雜交檢測RNA含量或通過利用免疫檢測法(例如，放射免疫沉澱法，放射免疫檢測法，或免疫印跡法)檢測蛋白水平來進行。
本發明的肽和肽結合物包含了基本上與被表達的HPV蛋白質的一些區域相應的胺基酸序列。肽最好對應於在本發明的重組細胞中被表達的HPV誘發蛋白質的那些區域。特別優選的肽對應於HPV16E6和/或E7蛋白的抗原決定區域。肽既可以採用上面所提到過的Merrifield的固相合成法製備，也可以採用標準的遺傳工程方法。
包含本發明重組細胞和/或肽的組合物被用作為致免疫組合物，疫苗和治療組合成。在一個實施例中，一種包含了表達HPV16E7蛋白抗原決定區域的重組牛痘病毒的組合物被用作致免疫組合物，它能夠在患者中針對HPV感染和/或腫瘤發生激發保護性應答的。
本發明的組合物，除了在此描述的重組細胞或肽以外，還包含生理上相容的稀釋劑如水或鹽水，並且一般還包括上面描述過的佐劑。
本發明還包含給患有由HPV感染而導致的疾病的患者施用有效量的最好是表達HPV抗原決定區域的重組細胞和/或肽。
一般，本發明的重組細胞和/或肽是以藥物組合物形式被施用，組合物包含有效量的重組細胞和/或肽以及一種藥物載體。當非經腸胃道施用時，本發明組合物被配製成與一種藥物載體結合的可注射的單位劑量形式(通常為溶液，懸浮液或乳化液)。這樣一些載體本身是無毒的和無治療作用的。這種載體的例子是普通的鹽水，Ringer氏溶液，葡萄糖液和Hank氏溶液。非水性載體如不易揮發的油和乙基油酸鹽也可被使用。一個優選的載體是5%的葡萄糖/鹽水。載體可包含微量的添加劑如增加致免疫力，等滲性和化學穩定性的物質，例如緩衝劑和防腐劑。總的說來，對於注射有用的載體在本領域內是熟知的。
由本發明重組細胞和肽產生的(誘發的)抗體和基本上的全抗體，以及由這樣一些抗體製備的抗原結合位點和對這些抗體和/或抗體片段製備的抗特異基因型抗體構成了本發明的另一個實施例。這種抗體在哺乳動物宿主中，如小鼠、大鼠、幾內亞豬、兔子、馬及類似動物中，通過採用以上面描述過的接種物或用於形成抗特異基因型抗體的結合到載體上的單克隆抗體所產生的免疫作用而形成的。
在一個優選實施例中，本發明的抗體分子包括通過用包含以上所述的重組細胞和/或肽或抗肽抗體的接種物進行免疫接種在哺乳動物中形成的全抗體。
針對E6和E7的特異肽製備的抗體將允許E6和E7細胞同系物的檢測。例如，肽，如肽359，包含稱為RB105的視網膜胚細胞瘤基因產物的部分結合區域。針對這些肽的抗體可模仿RB105並結合到與E7同有序列同系物的細胞蛋白上。這種E7細胞同系物的識別有可能可以識別出負責細胞增殖的細胞蛋白以及可能是RB105普通配位體的細胞蛋白。這樣一些抗體的抗特異基因型會模仿E7並識別出除E7本身的RB105的配位體或其同系物，即細胞增殖蛋白質。這樣可導致識別其它一些與細胞增殖蛋白反應的與起上調或下調增殖作用的細胞蛋白質，如腫瘤抑制基因蛋白或轉化蛋白。類似的研究可應用於E6和它的配位體p53以及E6或p53其它未知的配位體。
用在完全Freund氏佐劑中包含50微克至1.0毫克的重組細胞和/或肽結合物的接種物為兔子進行免疫接種，兩到三周後，用在非完全Freund氏佐劑中的10微克至1.0毫克的重組細胞或結合肽進行加強接種。每個兔子的免疫法包括在背部十次真皮下的注射，其中兩次在肩胛下的區域，並在五個位點進行加強接種，一個是在肩胛下的區域。在開始注射後兩周和加強注射後一周(5～8天)對兔子進行抽血。
包含有免疫活性抗體的血清然後可採用本領域內的已知方法從血液中產生出來。這些抗體對於本發明的一個或多個肽是具有免疫活性的。這樣一些抗體然後可被類似的方法用來產生本發明的一個或多個肽的抗特異基因型抗體。
適當的單克隆抗體，一般是全抗體，也可採用Niman等人，1983.Proc.Natl.Acad.of Sci.USA 802 4949所描述的雜交瘤技術進行製備，上述描述通過引用被結合到本申請中。簡單說來，為形成產生單克隆抗體的雜交瘤，將骨髓瘤或其它自身延續的細胞系與用本發明的重組細胞或肽或抗體超免疫接種的哺乳動物的脾中得到的淋巴細胞相融合。
優選的是骨髓瘤細胞系來自同種的，如淋巴細胞，但交叉種的雜交可以在裸鼠中產生。一般情況下，Balb/c株的小鼠是優選的哺乳動物。適合用在本發明中的鼠骨髓瘤包括AG-8細胞和NS-1細胞。
一般採用聚乙二醇，如PEG1500或PEG6000將脾細胞與骨髓瘤細胞融合。被融合的雜種按其對於HAT介質(次黃嘌呤，氨喋呤，胸苷)的敏感性進行選擇。產生本發明的抗體分子的雜種瘤利用此後描述的與免疫吸收測量法相關的酶被鑑別。
單克隆抗體不僅需要從雜種瘤上清液得到，通常還可以以更濃的形式從已引入所需雜交瘤的哺乳動物腹水液中得到。利用腹水液製備單克隆抗體是已有技術，且在此將不再討論。
本發明還構思了用於抑制和治療患者的HPV感染以及由HPV感染引起的疾病的方法。
在一個實施例中，治療由HPV感染引起的疾病的方法包括給患者施用治療有效量的本發明組合物一段足以抑制疾病發展的時間。示例說明的疾病包括宮頸疣和人類子宮頸癌，其中用本發明組合物的治療阻止或延緩了患者疾病的進一步發展。
還構思了另一個預防方法，根據對於向患者體內施加治療上有效量的本發明的合成物而激發的一種抑制腫瘤發生的保護性應答進行HPV感染的檢測以抑制患者體內腫瘤的發生。包含本發明重組細胞和/或肽的致免疫組合物的施用最好激發引起抑制患者體內腫瘤發生的CD8+淋巴細胞的補充。
在本發明還構思了抑制有接觸HPV危險患者的HPV感染的方法。在該方法中，足夠量的包含本發明重組細胞和/或肽的致免疫組全物被施予患者以有效地在患者體內激發一種保護性免疫應答以抑制隨後的HPV感染。
在一個優選實施例中，致免疫合成物是施用時使患者對HPV感染免疫的疫苗。
通過下列意在說明而不是限制的實施例進一步描述本發明。
實施例1E6和E7的ORF構建物的製備A.E6E6和E7ORFS是從包含全部HPV16基因組的pBR322質粒(pBR322/HPV16)中克隆出來的。630鹼基對的DdeI片段(bp#25-654)包含了E6ORF。該DdeI片段與DNA聚合酶的Klenow片段圓端接並在3%的NuSieve遺傳技術級(GTG)(FMC Bioproducts Rockland ME)瓊脂糖中接受凝膠電泳。630bp的DdeI段電泳轉移到NA45 DEAE(Schleicher Schuell，Keene，N.H)紙上，並被提洗在高鹽緩衝液(1.0M NaCl，0.1毫摩爾EDTA，20毫摩爾Tris pH 8.0)中在65℃下先用苯酚然後用氯仿提取，用2個體積的100%的乙醇沉澱，然後，DNA沉澱物被再次懸浮在Tris-EDTA CTE7緩衝液中(10毫摩爾Tris-Cl，pH 7.5，1毫摩爾EDTA，pH8.0)。
所利用的牛痘表達載體是pGS62，它除了將EcoRI位點從質粒中刪除、僅留下一個位於SmaI位點下段的EcoRI位點以外，與pGS20相同。該載體用SmaI線性化，並通過採用腓腸的鹼性磷酸酶(CIAP)處理去除磷酸並被凝膠提純。按如同對從pBR322得到E6ORF一樣的描述從凝膠中回收該片段。E6ORF加上未轉譯的由58bp5′和98bp3′組成的序列，被連結到pGS62牛痘表達載體的7.5K啟動子的下段。具有如圖1所示結構的重組質粒通過標準分子生物學方法被分離、特徵化和繁殖，這些方面如在下列文章中所描述的Mancatis T.等人，1982年，「MolecularCloningA Laboratory Manual」(Cold Spring海港實驗室，New York，1982)及Ausubel，F.M.等人，1990年，「Current protocols in Molecular Biology」(Green Publishing Assoc.及Wiley Interscience)B.E7在pBR322中被克隆的完整的HPV16基因組用TaqI和PstI切開並進行電泳。包含E7ORF的374bp片段如按對E6的描述那樣進行凝膠提純。pIC20R載體(Marsh，J.L.等，1984，Gene 32481-485)用PstI和ClaI分切開並凝膠純化。具有所示結構(圖2)的重組pIC20R E7質粒如上所述地被分離，特徵化並繁殖。pIC20R E7用EcoRI進行處理，並採用凝膠電泳法提純包含E7ORF的片段。
牛痘表達質粒pGS62用EcoRI進行切開，並用腓腸的鹼性磷酸酶處理和凝膠提純。得到圖2所示的包含E7ORF和E7ORF的56bp的非轉譯的5′，及24bp3′的重組質粒，對它特徵化並繁。
C.
兩種重組牛痘表達質粒被擴大並通過CsCl，溴化乙錠平衡離心分離法進行提純。
實施例2重組牛痘病毒的構建E6或E7ORFs的克隆步驟被設計用於在一個恰好是在感染的早期和晚期被表達的牛痘病毒的轉錄控制元件(7.5K啟動因子)的下段的獨特的克隆位點處，插入開放閱讀構架中(Earl，等1990年，J.Virol.642448-2451)。ORFs由牛痘胸苷激酶(7K)基因的左右臂側接以便於用牛痘病毒基因組的同系重組。
採用由Mackett，M.等人，1984年，J.Virol.49857-864，描述的一般方法，利用同系重組，pGS62/E6和pGS62/E7被分別插入到胸苷激酶基因內的牛痘病毒基因組中。由Wyetn天花疫苗中得到的親代病毒，V-NY在三次斑塊提純之後，在BSC40細胞中被繁殖。簡而言之，在被親代型牛痘病毒感染之前將嵌合質粒引入細胞中。該質粒的Tk區域與病毒的Tk區域是同系物。將外來基因插入到牛痘病毒染色體組中的重組的插入質粒提供了重組病毒Tk-。Tk-病毒是在存在包含5-溴脫氧尿苷酸的介質中生長的Tk-細胞中選出的。採用三輪斑塊提純方法將重組病毒提純，且通過將病毒DNAs與從一種細菌載體中提純出來的32P-標記的E6或E7DNA進行雜交來識別嵌合病毒。
實施例3哺乳動物細胞表達質粒pCDM8/E6和pCDM8/E7的構建E6和E7的HPV16開放閱讀構架(ORF)在速發早期(IE)巨細胞病毒(CMV)啟動子(圖1和圖2)的下段的HindⅢ點處被分別克隆到哺乳類表達載體pCDM8(Invitrogen.San Diego，CA)中。通過對從pGS621E6牛痘病毒表達質粒得到的BamHI，EcoRI片段凝膠提純、並將它連接到用BamH1，EcoRI切開的pIC20H質粒亞克隆E6ORF，以便在E6ORF5′端處獲得一個用於定向克隆到pCDM8中的HindⅢ位點。用HindⅢ和XhoI消化質粒pIC20H/E6，E6ORF5由ORF5′端的58bp和3′端的98bp組成的非轉譯序列一起被凝膠提純，並被連結到HindⅢ，xhoI消化的pCDM8載體中。如前所述地分離出圖1所示的重組pCDM8/E6，對它特徵化和繁殖。所形成的菌落用標準的微型製備DNA提純方法篩選，接著用限制性內切酶處理這些DNA，選擇這些酶組合物，以產生對轉錄方向以正確取向(即從5′至3′)克隆的DNA片段的診斷譜帶圖形。放大適當的克隆，並用CsCl，溴化乙錠平衡離心分離法純化它們的DNA。
E7ORF被從pIC20R/E7中凝膠提純出來作為EcoRI，PstI片段，並在EcoRI和PstI位點被亞克隆到pIC20H中(圖2)。為了在E7ORF的5′端引入HindⅢ位點，利用HindⅢ和PstI將E7ORF從pIC20H/E7取出來。含E7ORF的片段被凝膠純化並與ORF56bp的非轉譯的HPV序列5′和E7ORF24bp的非轉譯的HPV16序列3′一起，被連結到HindⅢ，PstI切開的pCDM8表達質粒中，以產生圖2所示的pCDM8/E7。篩選菌落，進行放大並如上所述地純化其DNA。
實施例4將編碼了HPV16核蛋白的抗原決定區域的DNA插入到上皮細胞或成纖維細胞中。
對應於人類乳頭狀留病毒的E6或E7的至少一個抗原決定區域的DNA核苷酸序列通過以上在例3中描述的方法，隨著甘油休克，利用標準磷酸鈣沉澱法，被插入到哺乳類表達載體中並轉染到上皮細胞或成纖維細胞中。則在轉染後，細胞被置於含G418的Iscove氏修正的Dulbecco′s介質(IMDM)(1毫克G418/毫升)中。當菌落生長到可見大小時，利用克隆環將它取出，並轉移到具有24眼滴定板各個眼內，並在組織培養基中生長到較大數目。部分在液氮環境下被存儲於10%DMSO，90%的牛胎血清中，並用作進一步研究。
實施例5從重組牛痘病毒感染得到的E6和E7基因產物的放射免疫沉澱法針對HPV16E7及HPV16E6TrpE融合蛋白的兔子抗血清被製備(分別為α16E7NP及α16E6Ds，並如Jenison等，1988年，J.Virol.622115-2113中所述的那樣由D.Galloway提供。
針對HPV16E6的兔子抗血清如Androphy等，1987，BMBO，6989中所述的那樣由D.Lowy(National Cancer Institute，Laboratory of Cellular，Bethesda，MA)提供。
被本發明牛痘重組病毒或Caski宮頸癌細胞(由ATCC得到)感染12小時的BSC40猴子細胞一個10cm的培養皿中、在補充有5%的透析過的牛胎血清(FCS)、0.25mCi(毫立方英吋)[35S]-蛋氨酸、及0.25mCi(毫立方英吋)[35S]-半胱氨酸的沒有蛋氨酸的培養基中被標記60分鐘。細胞被溶解於1毫升的溶胞緩衝液中(20mM Tris-HCl，pH7.4，50 mM NaCl，0.5%的Nonidet p-40，0.5%的去氧膽酸鹽，0.5%的十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.1抑肽酶Tripsin抑制因子單位/毫升及1mMEDTA)並被短時間地進行超聲處理。
通過在4℃時與10微升正常兔子血清或牛痘免疫兔子血清和蛋白質A-Sepharose珠一起保溫來對溶胞產物進行預純清處理。離心分離之後，棄去這些小珠。純清處理過的溶胞產物與兔子αE6(D.Lowy)或α16E7(α16E7NP)免疫血清一起保溫，這種血清已通過與未標記的牛痘病毒溶胞物一起保溫而被預先吸附。然後，將塗有蛋白A的Sepharose珠加入到免疫兔子抗體和細胞胞解物的混合物中，並被保溫。離心分離之後，小珠用RIPA緩衝液(10mM，Tris-HCl(pH7.4)，0.15M MaCl，1% NP-40，1%脫氧膽酸鹽，0.1%SDS，0.1胰蛋白酶抑制因子單位/毫升抑肽酶)清洗兩次，然後相繼用高鹽緩衝液(10mM Tris-HCl(pH7.4)，2M NaCl，1%NP-40，0.5%脫氧膽酸鹽)，低鹽緩衝液(0.5%NP-40 0.1% SDS溶於PBS中)、1MMgCl2，1M Tris-Hcl(pH 7.4)以及PIPA緩衝液清洗。
通過在樣品緩衝液中加熱沸騰5分鐘，將蛋白質從抗體和小珠中釋放出來，並用17.5%的SDS-PAGE與預先染色的標準分子量標記比較進行分析。
凝膠放射自顯影照片證實了當抗E6的兔子血清(由d.Lowy提供)被用來沉澱溶胞產物時，在E6-牛痘重組體溶胞產物中存在約17KDa分子量的譜帶。(圖3和4)。而用正常的兔子血清進行沉澱的通道上，或用抗-E6兔子血清沉澱vNY溶胞產物的通道上相應的位置上看不到這種區域譜帶。
兩種牛痘E6重組體斑塊7.1和7.8被擴大，分析得到相似的結果。
當採用以上所述的放射自顯影術對E7-牛痘重組體溶胞產物進行分析時，用抗E7兔子血清(α16E7NP)沉澱後發現了18-20KDa譜帶。而在用正常兔子血清進行沉澱或用抗-E7兔子血清對放射標記的vNY溶胞產物進行沉澱的通道中，相應位置上看不到該譜帶。脈衝-跟蹤研究(圖5)表明E7蛋白質在合成後2-6小時被降解在攜帶全部HPV16基因組的Caski細胞中(D.Smotkin和F.Wettstein，1987年，J.Virol.611686-1689)的E7蛋白質也已顯示出類似結果。E7蛋白質的遷移與在Caski細胞中觀察到的遷移是相同的，這就說明在重組牛痘細胞中製成了全長度的基因產物。
實施例6從重組COS細胞得到的E7基因產物的放射免疫沉澱法COS猴子細胞被本發明的pCDM8E7質粒轉染，並在培養基中培養48小時。然後按照在實施例5中對Caski細胞所描述的那樣，用35S-Met和35S-Cys對該細胞進行標記。如在Sato等，1989，Virology 170311-315中所述，將細胞分隔成核，細胞質及細胞膜組分。
如在例5中所述，通過在樣品緩衝液中加熱沸騰5分鐘，將蛋白質釋放出來，並用17.5%的SDS聚丙烯脒凝膠與預染色的標準分子量標記比較對蛋白質進行分析。凝膠放射自顯影響照片證實了在用抗E7兔子血清進行沉澱後存在約18KDa的譜帶。該結果表示在圖6中。
實施例7Western印跡分析E6和E7肽致免疫性的Western吸印跡研究是如Jenison等1988.J.Virol.622115-2123中所述的那樣，採用由連結到HPV16E6或E7ORF段的TrpE組成的融合蛋白進行的。
簡單地說，融合蛋白被利用其在非離子洗滌劑中的相對不溶性進行部分提純。50毫升誘生的細菌培養物被製成小丸，懸浮在10毫升Tris-EDTA緩衝液(50mM Tris(pH8.0)-5mM EDTA)中並用溶菌酶(2毫克/毫升)在0～4℃下消化90分鐘。
分別加入NaCl(5.0M)和10%ND-40到0.3M和0.7%的最後濃度，且將混合物在0-4℃下保持30分鐘。讓溶液三次通過一個18號標準單位的針以降低其粘度，並在0-4℃下保持另外的30分鐘。
不溶的組分在16，000xg，4℃下離心10分鐘被製成小丸片，懸浮在10毫升的10mM Tris(pH8.0)-1.0M NaCl中，並在0°至4℃下保持10分鐘。如上所述那樣，將不溶的組分製成小丸片，懸浮在1.0毫升的Laemmli蛋白質樣品緩衝液中(Leammli，1970年，Nature 227680)(10毫升0.625M的TRIS pH6.8，20毫升10%SDS，20毫升甘油，2毫升的2-巰基乙醇，1毫升1.5%的溴苯酚蘭(Bromophenol Blue)(在70%的乙醇試劑中製備)，1毫升1.0%的Pyronin Y(Biorad Catalog No.161-0425，或等價物，在H2O中製備)，和36毫升的去離子水)並加熱至100℃5分鐘。
融合蛋白製品通過用包含0.1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)的10%的聚丙烯醯胺凝膠電泳被分離。融合蛋白利用Coomassie蘭染色的凝膠的肉眼檢查進行定量。每6mm槽盛載的每一定量不溶性蛋白質組分的體積被調節到給出等同於5微克牛血清白蛋白的Coomassie蘭染色強度。將蛋白質100毫安培，16-18小時，傳遞給在25mM Tris-195mM苷氨酸(pH8.5)-20%乙醇(Western傳遞緩衝液)中的硝化纖維素中。印跡被浸泡在含有10mM N-乙基馬來醯亞胺的磷酸鹽緩衝液中10分鐘，在5%的脫脂乾燥乳劑，0.9%的NaCl，0.1%的Antifoam-A(Sigma化學公司，聖路易斯，Mo.)，0.1%的疊氮化鈉及1mM的碘化鉀(吸印劑)中保溫2小時，並在含有10%的胎牛血清的印跡劑(blotto)中保溫1小時。
由50ml誘生的細菌培養物製備抑制試劑，該培養物被製成小丸，懸浮在3.6毫升50mM的Tris(pH 8.5)，5mM EDTA中並以50瓦功率進行超聲處理20秒鐘;加入20%的SDS，將溶胞產物加熱至100℃5分鐘。這種被稱為「Blocko」的試劑在(-20℃)下以等分試樣形式被存儲。為了讓TrpE蛋白質樣品對Western印跡起陰性對照抗原的作用，將溶胞的、僅包含載體(通道10)的誘發細菌培養物如關所述地被製成小丸以形成「Blocko」。該細胞溶胞產物與2X Laemmli樣品緩衝液以1∶1混合，加熱至沸騰5分鐘，並加到凝膠上以檢查Trp對照蛋白質。
為制抑制試劑，將混合物(「Blocko」)在印跡劑中以1∶20的比例稀釋，加入Np40和脫氧膽酸鈉至各自為1%的最終濃度。將兔子血清在25毫升的抑制試劑中以1∶100的比例稀釋，並在4℃下預保溫8小時。然後加入硝化纖維素印跡，在4℃下連續保溫16-18小時。將印跡在0.5%的脫鹽膽酸鹽、0.1M NaCl，0.5%Triton X-100，及10mM磷酸鈉(pH7.5)中清洗三次，每次20分鐘。結合鹼性磷酸鹽(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)的山羊抗兔子血清以1∶1000的稀釋比例加入到吸印劑中。在約27℃下，保溫2小時之後，過濾物被再次清洗三次，並轉移到基質溶液(表1)中10分鐘或直到產生顏色為止。將過濾物在蒸餾水中清洗來結束反應。過濾物被乾燥並照相。
表1Western Blot Reagents10倍乘的轉移緩衝劑 2升緩血酸胺鹼(25mM Tris) 60.53克甘氨酸 288.27克稀釋到1倍乘後加MeOH至最終容積的20%印跡劑(BLOTTO) 4升 8升脫脂奶粉(5%) 200克 400克NaCl(0.9%) 36克 72克防沫劑A(0.1%) 12ml 24ml疊氮化鈉(0.1%) 4克 8克碘化鉀(1mM) 0.664克 1.33克Western清洗液 4升 8升去氧膽酸(0.5%) 20克 40克Triton X-100(0.5%) 20ml 40mlNaCl(0.1M) 23.4克 46.8克1M磷酸鈉，pH7.4(10mM) 40ml 80ml(1M磷酸鈉-268克Na2HPO47H2O[加熱溶解]，約4ml 85%H3pH4至pH7.4，足量至1升)鹼性磷酸酶基質夠2個印跡用.加入每種試劑後混合避光;1小時內使用鹼性磷酸酶緩衝液 10ml.
NBT基質(50毫克/ml.在70%N，N-二甲基甲醯胺中) 66μl
BCIP基質(50毫克/ml，在100%N，N-甲基甲醯胺中) 33μl鹼性磷酸酶緩衝液1M Tris，pH 9.5 10ml(100mM Tris-HCl，pH 9.5)5M NaCl 2ml (100mM NaCl)1M MgCl20.5ml(5mM MgCl2)足量至100ml.
NBT基質 氮藍四唑(Sigma)BCIP基質 3-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(Sigma)實施例8HPV肽合成了對應於HPV16E6或E7核蛋白的特異性抗原決定區域的合成肽被。該特異性肽被列在表2中，並與在如圖7所說明的E6或E7蛋白質序列中的從氨基終端到羧基終端讀出的被標明了的胺基酸殘基相對應。
表2肽 E6或E7胺基酸位置359 E729-50360 E770-81361 E71-10358 E6148-158358 E6119-134375 E68-20376 E61-20
實施例9利用HPV16肽作為免疫原產生單克隆克體20微克的與鑰孔
血藍素(KLH)結合的肽359在完全Freund氏佐劑中被乳化，並在皮下或腹膜內注射給小鼠施用。大約3和51/2周後，用在非完全Freund氏佐劑中的加強注射劑通過腹膜內注射。三天後取出脾細胞，用標準雜種瘤技術(參見Milstein，supra)將其與AG8骨髓瘤系融合。利用以每眼塗復500納克在0.1M碳酸鹽緩衝液中的未結合肽的微滴定板，在ELISA檢測中用健康克隆的上清液來鑑別特異抗體的存在。與馬的蘿蔔過氧化酶(HRP)結合的山羊抗小鼠IgG在經過三次清洗後被加入，並採用標準ELISA方法進行底物反應。兩個高活性克隆(克隆＃10和＃14)被選擇用作進一步克隆並在肽359的ELISA中對其上清液進行滴定，其結果在圖8上。類似地，針對E6肽358和375(數據未示出)的單克隆抗體已被製備出來。
實施例10肽-KLH的致免疫性研究通過採用與完全Freund′s佐劑混合的結合了KLH的100微克肽進行其皮內注射對兔子進行免疫接種。三周後，通過採用與非完全Freund′s佐劑混合的結合了KLH的50微克的肽進行真皮內注射來對動物進行免疫加強注射。加強注射後三天，兔子被取血。
血清在(-20℃)下貯存。抗Trp E-HPV融合蛋白質的兔子抗血清如Jenison等人1988年，J.of Virol.622115-2123)所描述的那樣被製備，並由Dr.Denise Galloway(Fred Hutchinson癌症研究中心，seattle，WA)提供。為了消除針對E.Coli-編碼蛋白質(包括該融合蛋白的TrpE部分)的抗體，利用以上實施例7中所述的抑制試劑，將血清對表載體(pATH)序列的E.coli的變性溶胞產物進行預吸收。
兔子血清作一系列的稀釋，並在針對T E-E6和E7融合蛋白的Western印跡測量中進行反應。所有抗肽血清與同系的融合蛋白質是起反應的，證這了肽結合物的致免疫性。抗血清的滴定度在此被表示成在Western印跡分析中與該特異性蛋白質仍顯示反應性的最高稀釋度的倒數，各種不同不同抗血清的滴定度表示在表3中，且滴定的Western印跡可見於圖9和圖10。
表3兔血清滴定度＊α357(E6) ≥3，200 100＊＊α358(E6) 102，400 ≥6，400α359(E6) ≥109，600 ≥409，000α360(E7) 1，600α361(E7) 800α16E7NP 720，000α16E6DS 40，000-80，000＊顯示E6或E7譜帶陽性染色的最高稀釋度的倒數，＊＊兩個滴定度表示兩個不同的兔子被試驗。
在這些Western印跡中，抗肽359抗血清具有一個≥490，600的滴定度，是在所測量抗血清中最具反應活性的。通過將兩種血清的稀釋液與Westen印跡中的同系Trp融合蛋白質和Trp對照抗原進行反應以證實這些反應的特異性。該血清被發現對於同系融合蛋白質(圖11)是具有特異性的。在這種測量中，抗肽359的抗血清的滴定度≥1000，000。
針對TrpE-E6融合蛋白質，p16E6DS-2(DraⅢ(111)-Sau3a(525))和E7融合蛋白(p16，E7NPI(NsiI(562)-PstI(875))的陽性對照兔血清(α16E7NP和α16E6DS)被分別製備。並由D.Galloway(Fred Hutchinson Cancer Research Center，Seattle，WA)提供。
實施例11利用ELISA識別B細胞的抗原決定基如在實施例10中所述的，結合E6和E7肽的KLH被用於KLISA測量中，以確定它們是否代表由被細菌表達的HPV16E6或HPV16E7融合蛋白質接種免疫的動物所識別的抗原決定簇。
在實施例8中所述的三個E7肽被抗Trp-E-E7(α16E7NP)(由D.Galloway，Fred Hutchinson癌症研究中心，seattle，WA提供)的兔子抗血清所識別，如見表4。識別從Triton Biosciences購買的HPV16E7的單克隆抗體與氨基末端的肽361一一對映。
表4在ELISA中試驗抗血清對E7開放構架的KLH-結合肽的滴定度＊
肽 α16E7NP McAb Triton(Biascience)359(aa29-50) 1，600 ＜100360(aa70-81) 6，400 ＜100361(aa1-10) 12，800 ≥12，800＊滴定度被確定為顯示出比本底高4倍ELISA值的最高血清稀釋度的倒數，本底是在塗同樣肽的滴定板上用1∶100的正常血清確定的。
E6序列(357和358)的兩種肽也利用類似方法進行研究。用兩種不同的抗-E6抗血清的結果表示在表5中。肽編號358與αHPV-E6(Lowy)在1∶400的血清稀釋度下還是有反應性的，而α16E6Ds具有較低的反應性(1∶100)。肽357在1∶100的血清稀釋度下，被α16E6DS勉強識別出來。
表5在ELISA中試驗抗血清對E6開放構架的KLH-結合肽的滴定度＊肽 α16E6DS αHPV16-E6(Lowy)357(aa148-158) 100 ＜100358(aa119-134) 100 400＊滴定度被確定為顯示比本底大3倍的ELISA值的最高稀釋度的倒數，本底如表4那樣被確定。
實施例12利用抗肽抗血清識別天然的E7蛋白質如實施例8所述，按照實施例10的方法及如用RIP進行測量的那樣用E7肽對兔子進行免疫。圖12表示的結果說明了利用抗-E7肽抗血清對E7肽的識別。來自用肽389免疫接種的兔子的抗血清，對應於E7的29至50-胺基酸殘基，如放射免疫沉澱法所確定的那樣對牛痘重組溶胞產物中的天然E7蛋白質進行識別。
實施例13RNA的逆轉錄酶聚合酶鏈反應分析用如在以上實施例3中所描述的pCDM8/E7轉染的M2鼠黑素瘤細胞和NCTC2555成纖維細胞各自的24個克隆被利用RNA點吸印測量法進行檢測。其中給出陽性信號的這些克隆中的三個然後利用逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析進行進一步檢測。
這些轉染細胞的細胞質RNA按照如在Ausubel等，1989，in Current Protocol in Molecular Biology，Greene Publishing Associates所描述的方法被分離。
細胞質RNA的合成第一股cDNA的典型引物延伸-RT與PCR一起被用來放大cDNA。1微克的細胞質DNA被用作放大反應的模板。利用鼠白血病病毒的逆轉錄酶(Life Science)合成第一股cDNA。
包含變性RNA樣品的RT緩衝液，1微克變性的無規則六聚體，1mM每種脫氧核苷酸三磷酸鹽(dNTP)，10mM焦磷酸鈉，5mM二硫蘇糖醇，10個單位的核糖核酸酶(RNasin)(Promega，Madison，WI)以及18個單位的鼠白血病逆轉錄酶在42℃下被保持1小時，並然後在100℃下變性10分鐘。上清液被用於PCR。
用於PCR的寡核苷酸的引物是HPVA22∶5′-GCATGGAGATACACCTACATTG-3′和HPVA20∶5′-TGGTTTCTGAACAGATGG-3′(DNA Factory，San Diego，CA)。292bp的cDNA片段被放大。PCR反應混合物(GeneAmp DNA amplification Reagent Kit，Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)包含200μM的dNTP1μM的引物HPVA22和HPVA20以及由RT合成的各種cDNA和25個單位的Taq聚合酶。1納克的pCDM8/E7質粒被用在PCR臺作為反陽性對照。利用DNA熱循環裝置(perkin Elmer Cetus)以33次循環進行PCR(在94℃下變性1分鐘，在50℃下退火2分鐘以及在70℃下延伸3分鐘)，並將20微升的PCR產物通過在用溴化乙錠染色的4%的NuSieve瓊脂糖凝膠(FMC，生物製品，Rockland，ME)上電泳進行分餾。
在圖13所示的結果說明來自三種轉染物(E7C3，N7.2和N7.4)的PCR產物顯示了預測的292bp的DNA片段。然而，親代細胞系(黑素瘤和NCTC2555成纖維細胞)不顯示這些片段。
當從這些轉染物分離出的mRNA在RT-PCR之前用DNase-游離的RNase預處理時，PCR產物按凝膠電泳法測定並不顯示出這些片段。
實施例14腫瘤誘發和消退在6-10周齡的雌性C3H/HeN小鼠(Charles River Breeding Laboratory)中研究了用HPV轉染細胞進行免疫的阻止腫瘤發展的能力。
將取自表達HPV-E6或E7抗原決定簇和表達高水平的主要組織相容性複合物(MHC)Ⅰ級抗原的非致腫瘤的轉染株通過腹膜內注射到5個小鼠一組的每一組小鼠體內。然後，小鼠被在其削去絨毛的右側背部皮下注射的致瘤劑量的用HPV16E7(E7C3)轉染過的M2黑素瘤細胞去激發。通過對腫瘤直徑的測量確定腫瘤塊。圖14所示的結果表明，用表達E7抗原決定簇的成纖維細胞進行的免疫通過E7C3而引起腫瘤的短暫發展，而接著卻總是腫瘤的消退。另一方面，用表達HPV16E6抗原決定簇的成纖維細胞的接種不抑制由E7C3細胞引起的腫瘤形成，而且未免疫小鼠在用被E7C3激發時，總是生成原發腫瘤。
類似研究，即用E6或E7轉染株成纖維細胞給小鼠腹內注射，然後用E6轉染的M2細胞激發，產生了相似的結果;施用E6轉染株成纖維細胞阻止由於用E6轉染的M2細胞而形成的、而不是用E7轉染的M2細胞形成的腫瘤。結果表示在表6中。
表6給小鼠的接種物成纖維細胞 黑素瘤細胞 進行性腫瘤生長無 M2是無 E7C3 是無 M2/E6是非轉染的 無 否非轉染的 E7C3 是E6無否E6M2是E6M2/E6否E6E7C3 是E7無否
E7M2是E7E7C3 否E7M2/E6是用E7C3細胞為C3H/HeN小鼠注射在小鼠體內產生了腫瘤。當同時給這些小鼠施用幹擾素時，發生了腫瘤迅速消退;然而，當與非轉染的M2細胞一起給小鼠注射，幹擾素並不抑制腫瘤發展。
在裸鼠中的研究表明，為了發生腫瘤消退，需要功能性T細胞。由於接種轉染的或非轉染的M2細胞，在裸鼠體內產生了腫瘤。該研究的結果表示於表7中，而且，幹擾素的存在與否不會對裸鼠體內腫瘤的發展產生影響。
表7接種物 小鼠 進行性腫瘤生長M2C3H/HeN 是M2+幹擾素 C3H/HeN 是E7C3C3H/HeN 是E7C3+幹擾素 C3H/HeN 否M2裸鼠是E7C3裸鼠是E7C3+幹擾素裸鼠是M2+幹擾素裸鼠是實施例15CD8+T淋巴細胞對腫瘤消退的中介作用用由HPV16E7(N7.2)轉染的NCTC2555衍生的非致瘤成纖維細胞對C3H/HeN小鼠進行免疫接種。然後，給這些小鼠各自注射含有1毫克抗-CD8單克隆抗體(來自ATCC的克隆116-13.1 IgG2A)的1.0毫克的PBS-稀釋的腹液以消除CD8+T淋巴細胞。對照組小鼠接受包含同型匹配的抗-CD5單克隆抗體(雜種瘤10.2IgG2a，致腫瘤基因)的1毫升的PBS-稀釋的腹液。
結果表示在圖15中。當用E7C3細胞激發時，N7.2免疫過的抗-CD8單克隆抗體處理的小鼠產生了進行性腫瘤。而用N7.2免疫過的抗CD5單克隆抗體處理的對照小鼠在用E7C3細胞激發時抵制了進行性腫瘤的形成。對小鼠淋巴細胞數量的FACS分析是通過用抗CD4或抗-CD8對這些小鼠的脾細胞進行染色、然後通過螢光激活細胞分析器分析進行監測進行的。結果表示在圖16中。CD8+細胞的消除在抗-CD8處理的小鼠中被表明是大於90%。結合螢光素的抗-CD4進行測量在那些小鼠體內的CD4+淋巴細胞，並證實這些小鼠中的CD4子集沒有變化。
這些結果表明，CD+，HPV16E7-特異的T淋巴細胞對調節用N7.4免疫的小鼠體內M2/E7腫瘤的消退，是重要的效應細胞。
前面的描述和實施例的意圖在於說明本發明，而不是限定。在不偏離本發明的實質精神和範圍的情況下，可以作出大量的改換和改進。
權利要求
1.一種組合物，包括基本上對應於在哺乳細胞中由於人類乳頭狀瘤病毒感染而被表達的肽的胺基酸殘基序列的一種致免疫肽。
2.根據權利要求1所述的組合物，包括含有一個編碼了所說的肽的基團的重組細胞。
3.根據權利要求2所述的組合物，其中所說的重組細胞是病毒。
4.根據權利要求3所述的組合物，其中所說的病毒是牛痘病毒。
5.根據權利要求2所述的組合物，其中所說的重組細胞選自上皮細胞，成纖維細胞和MHC Ⅰ級陽性淋巴細胞。
6.根據權利要求2所述的組合物，其中所說的重組細胞是腫瘤細胞。
7.根據權利要求2所述的組合物，其中所說的基因編碼了基本上對應於E6核蛋白質區域的肽。
8.根據權利要求2所述的組合物，其中所說的基因編碼了基本上對應於E7核蛋白質區域的肽。
9.根據權利要求1所述的組合物，其中所說的肽包括E6蛋白質的一個抗原決定區域。
10.根據權利要求1所述的組合物，其中所說的肽包括E7蛋白質的一個抗原決定區域。
11.根據權利要求4所述的組合物，包括一種重組牛痘病毒，其中含有一種編碼和表達人類乳頭狀瘤病毒的E6核蛋白質的抗原決定區域和基因。
12.根據權利要求4所述的組合物，包括一種重組牛痘病毒，其中含有一種編碼和表達人類乳頭狀瘤病毒的E7核蛋白質的抗原決定區域的基因。
13.根據權利要求4所述的組合物，包括一種重組牛痘病毒，其中含有在哺乳細胞中誘發致免疫肽的表達的人類乳頭狀瘤病毒的一個基因區域。
14.根據權利要求6所述的組合物，其中所說的腫瘤細胞包括一種重組哺乳動物細胞，其中含有編碼和表達了由所說的哺乳細胞產生的致免疫肽的一個抗原決定區的人類乳頭狀瘤病毒E6基因的一個區域。
15.根據權利要求14所說的組合物，其中所說的哺乳細胞是人類細胞。
16.根據權利要求6所述的組合物，其中所說的哺乳細胞包括一種重組人細胞，其中含有編碼和表達由所說的黑素瘤細胞所產生的致免疫肽的一個抗原決定區域的人類乳頭狀瘤病毒E7基因的一個區域。
17.根據權利要求16所述的組合物，其中所說的哺乳細胞是選自血細胞，成纖維細胞及上皮細胞中的一種細胞。
18.一種治療由人類乳頭狀瘤病毒感染引起的疾病的方法，包括給患者施用治療有效量的一種組合物，其中包括一種肽，它基本上對應於由於人類乳頭狀瘤病毒感染而在哺乳動物細胞中被表達的肽的一個區域的胺基酸殘基序列，治療持續一段足以抑制所述疾病進展的時間。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所說的組合物包括一種重組細胞，它含有在哺乳動物細胞中誘發致免疫肽的表達的人類乳頭狀瘤病毒的E6基因的一個區域。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所說的細胞是牛痘病毒。
21.根據權利要求18所述的方法，其中所說的組合物包括一種重組細胞，它含有在哺乳動物細胞中誘發致免疫肽的表達的人類乳頭狀瘤病毒的E7基因的一個區域。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所說的細胞是牛痘病毒。
23.根據權利要求18所述的方法，其中所說的疾病是宮頸疣。
24.根據權利要求18所述的方法，其中所說的疾病是宮頸癌。
25.根據權利要求18所述的方法，其中所說的方法抑制被人類乳頭狀瘤病毒感染的細胞的增殖。
26.一種在檢測到人類乳頭狀瘤病毒感染後抑制細胞中腫瘤發生的預防方法，包括給患者施用治療有效量的一種組合物，其中包括一種肽，它基本上對應於在哺乳細胞中由人類乳頭狀瘤病毒感染誘發的肽的胺基酸殘基序列以在患者體內激發一種抑制所說的病毒感染細胞的腫瘤發生的保護性應答。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所說的組合物包括一種含有編碼了所說的肽的基因的重組細胞。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所說的重組細胞是牛痘病毒。
29.根據權利要求27所述的方法，其中所說的重組細胞是選自上皮細胞，成纖維細胞及MHCI級陽性淋巴細胞中的一種細胞。
30.根據權利要求26所述的方法，其中所說的肽包括人類乳頭狀瘤病毒E6核蛋白質的一個抗原決定簇。
31.根據權利要求26所述的方法，其中所說的肽包括人類乳頭狀瘤病毒E7核蛋白質的一個抗原決定簇
32.根據權利要求26所述的方法，其中所說的肽包括一種由人類乳頭狀瘤病毒基因的一個區域誘發的哺乳動物的肽。
33.一種重組細胞，包含有一個編碼了一個肽的基因，該肽基本上對應於由於人類乳頭狀瘤病毒感染而在哺乳細胞中引起肽表達的一個胺基酸殘基序列。
34.根據權利要求33所述的重組細胞，其中所說的肽以一種抗原決定區域形式被所說的細胞表達。
35.根據權利要求33所述的重組細胞，其中所說的細胞是牛痘病毒。
36.根據權利要求33所述的重組細胞，其中所說的細胞是上皮細胞。
37.根據權利要求33所述的重組細胞，其中所說的細胞是腫瘤細胞。
38.一種肽，包括基本上對應於人類乳頭狀瘤病毒蛋白質的一個區域的約8-30個胺基酸殘基序列。
39.根據權利要求38所說的肽，其中所說的區域是所說的蛋白質的一個抗原決定區域。
40.根據權利要求38所述的肽，其中所說的蛋白質是HPV16的E7蛋白質。
41.根據權利要求40所述的肽，對應於在圖7的E7胺基酸序列中的從約殘基1到殘基10的胺基酸殘基序列。
42.根據權利要求40所述的肽，對應於在圖7的E7胺基酸序列中的從約殘基29到殘基50的胺基酸殘基序列。
43.根據權利要求40所述的肽，對應於在圖7的E7胺基酸序列中的從約殘基78到殘基81的胺基酸殘基序列。
44.根據權利要求40所述的肽，其中所說的蛋白質是HPV16的E6蛋白質。
45.根據權利要求44所述的肽，對應於在圖7的E6胺基酸序列中的從約殘基1到殘基20的胺基酸殘基序列。
46.根據權利要求44所述的肽，對應於在圖7的E6胺基酸序列中的從約殘基8到殘基20的胺基酸殘基序列。
47.根據權利要求44所述的肽，對應於在圖7的E6胺基酸序列中的從約殘基119到殘基134的胺基酸殘基序列。
48.根據權利要求44所述的肽，對應於在圖7的E6胺基酸序列中的從約殘基148到殘基158的胺基酸殘基序列。
49.一種抑制患者體內的人類乳頭狀瘤病毒感染的方法，其中包括給患者施用足夠量的致免疫組合物以便在所說的患者體內有效地激發針對由人類乳頭狀瘤病毒引起的感染的免疫保護性應答，該致免疫組合物包括含有編碼了一個肽的重組細胞，該肽基本上與由於人類乳頭狀瘤病毒感染而在哺乳細胞中被誘發的肽的一個區域的胺基酸殘基序列、所說的肽或兩者的結合相對應。
50.根據權利要求49所說的方法，其中所說的重組細胞是一種病毒。
51.根據權利要求50所說的方法，其中所說的病毒是一種牛痘病毒。
52.根據權利要求50所說的方法，其中所說的重組細胞選自上皮細胞，成纖維細胞及MHCI級陽性淋巴細胞中的一種細胞。
53.根據權利要求49所述的方法，其中所說的肽包括人類乳頭狀瘤病毒E6核蛋白質的一個抗原決定區域。
54.根據權利要求49所述的方法，其中所說的肽包括人類乳頭狀瘤病毒E7核蛋白質的一個抗原決定區域。
55.一種抗體分子，它能夠與由於HPV感染而被表達的一種爭奪所說肽的受體。
56.根據權利要求56所述的抗體，其中所說的肽包括HPV的E7蛋白質的一個區域。
57.根據權利要求56所述的抗體，其中所說的抗體分子是針對所說肽的一種抗-特異基因型抗體。
58.根據權利要求57所述的抗體，其中所說的肽對應於在圖7的E7胺基酸序列中從約殘基29到約殘基50的胺基酸殘基序列。
59.根據權利要求55所述的抗體，其中所說的肽包括HPV的E6蛋白質的一個區域。
60.根據權利要求59所述的抗體，其中所說的抗體分子是針對所說肽的一種抗-特異基因型抗體。
全文摘要
包含和表達編碼了誘發的乳頭狀瘤區域或乳頭狀瘤蛋白質，如E6或E7區域的HPVDNA插入物的肽，抗體及重組表達系統或細胞。含有這些肽，抗體和/或重組細胞的組合物被用做為致免疫成分並被用在抑制和治療HPV感染和腫瘤發生及進展的方法中。具體描述了表達HPV16E6或E7核蛋白質的抗原決定區域的特異性肽和重組細胞，如牛痘病毒和腫瘤細胞。
文檔編號C07K14/025GK1067382SQ9111065
公開日1992年12月30日 申請日期1991年9月26日 優先權日1990年9月26日
發明者E·K·託馬斯, L·P·陳, J·布萊克, K·E·海爾斯特倫, I·海爾斯特倫, S·L·胡 申請人:布里斯托-邁爾斯斯奎爾公司