組織特異性和靶rna特異性核酶的製作方法

2023-04-27 10:37:36 2

專利名稱：組織特異性和靶rna特異性核酶的製作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及組織特異性和靶RNA特異性核酶用於治療癌症和細菌、寄生蟲和病毒感染的應用。更具體的，本發明涉及在前列腺上皮特異性啟動子(probasinpromoter)控制下尋靶RNA聚合酶1(A)的核酶。
背景技術：
核酶是斷裂RNA特異序列的催化性RNA分子。已經指出核酶可作為哺乳動物細胞中的有潛力的基因調節器和抗病毒試劑，但其仍面臨著技術可行性的嚴重問題。例如，還不知道核酶是怎樣被引到靶細胞上的，或它們是怎樣被指向作為它們的靶RNA的同一亞細胞區室的。其它問題是關於靶RNA二級結構對核酶活性的影響。該領域中還沒有成功地解決這些問題。
而且，由於核酶是反義技術的一種，反義技術用於疾病治療時遇到的問題也在核酶技術應用中遇到。例如，發現反義RNA在轉基因小鼠中的表達始終使靶RNA分子減少，而且當靶RNA分子減少時，它並不與蛋白質的減少平行，是不可預測的。有時甚至當蛋白質水平降低時，沒有檢測到有生物效應(Whitton,J.Lindsay＂(反義治療病毒感染)Antisense Treatment of Viral Infection＂Adv.in VirusRes.Vol.44,1994)。
該領域中的經驗表明，核酶在游離時或包埋在不相關的大RNA分子中時是是否最有效的，這點是不清楚的(Whitton,1994)。如今，也沒有獲得足夠的體外或細胞培養中的數據來系統地比較游離的核酶和其包埋型的反式活性(transeactivities)。
有些研究側重於核酶技術在治療癌症方面的潛力。在這些研究中，核酶被直接作用於細胞培養物中的c-fos和c-ras致癌基因，並在移植入小鼠時表現出抑制惡性的活性。因此，這些核酶可特異性尋靶致癌基因。
沒有任何文獻指出，通過將有組織特異性啟動子的核酶輸遞至組織上並且尋靶至細胞存活所必需的RNA上，可治療組織特異性癌症或其它組織特異性疾病。本發明提供了這樣一種可治療組織特異性癌症和其它組織特異性疾病的核酶。
大多數前列腺癌症問題不需要作很多介紹。每年有大約44000個男子死於前列腺癌症，約10000000個男子有前列腺癌症前期的疾病症狀。很明顯，新的治療方法是急需的。用動物模型來測試醫療方法剛剛變成可能，並且還需要數年才能有效化。然而，本發明提供了解決這一問題的重要的試劑。
用基因治療法來治療前列腺癌症的一個難點是靶特異性輸遞的長時間持久問題。然而，最近研究出的前列腺上皮特異性啟動子提供了靶特異性，其可全身輸遞本發明的編碼核酶的載體(Greenburg等人，Mol.Endocrinol.8:230-239，1994)。本發明的載體包括串聯排列的3個錘頭狀核酶，其5＇和3＇端設計成可將其從初級轉錄物上自催化斷裂下來。這一新穎的結構消除了延伸殘基側翼序列帶來的問題，否則側翼序列的存在將妨礙催化活性和特異性。本發明的結構將前列腺特異性的前列腺上皮特異性啟動子與可尋靶前列腺細胞生長關鍵必需的mRNA的三連體核酶(triple-ribozyme)連接起來。
在組織特異性或其它啟動子控制下的核酶的內源性輸遞由於「滲漏(leakiness)」(體外組織中發生低水平的轉錄)而複雜。這將根據所選的細胞靶的不同而產生相當嚴重的治療問題。本發明的核酶通過尋靶有高水平產物的細胞靶(即RNA聚合酶Ⅰ產生大量的細胞核糖體RNA)來彌補了該問題。因此，當啟動子滲漏發生在不希望的組織中時細胞就不會死亡。因此，這種選擇提供了所需程度的安全性，且polⅠ的尋靶適用於許多採用其它啟動子的選擇性組織。
基因治療中的一個常見問題是將核酶輸遞至正確的組織很困難。本發明通過使核酶尋靶到細胞(核酶構建物可有效輸遞至其上)中非細胞類RNA來避免了這一困難。Ⅳ脂質體輸遞對治療HBV肝炎是有效的。Ⅳ和/或體外治療有效地將構建物輸遞至紅細胞上來治療瘧疾傳染。表面給藥(有或沒有ⅳ)有效地將核酶構建物輸遞至發育不良/癌症前期/癌症的HPV 16頸損傷的頸上皮上。後一個例子對治療發育不良/癌原位損傷(經異常的巴氏汙點(Pap smear)診斷得出)特別重要。非細胞類靶核酶的第二個優點是，即使不希望的細胞中發生啟動子滲漏和/或體外輸遞和/或表達，核酶也不會斷裂任何細胞RNA。
發明概述本發明提供組織特異性和靶RNA特異性的核酶。這些核酶可用來破壞靶特異性腫瘤和治療病毒感染及其它用途。本發明的核酶包括5＇端自催化斷裂的核酶序列、含靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂的核酶。
本發明也提供了編碼本發明的核酶的核酸。這些核酸可用來在選擇的位點處表達本發明的核酶。本發明的核酸包括一個組織特異性啟動子結合位點，該位點位於編碼5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂的核酶序列的序列上遊。
本發明提供了一種通過抑制組織中細胞增生來治療患有特異性組織增生疾病的患者的方法，方法包括為患者給藥權利要求5的核酸，其中靶特異性啟動子結合序列對疾病組織有特異性，從而使核酸編碼的核酶被表達，抑制組織中核糖體RNA的產生，抑制細胞增生，從而來治療增生疾病。
本發明提供了一種治療患有前列腺癌症的患者的方法，方法包括對患者用權利要求7的核酸給藥，從而使核酸編碼的核酶在前列腺中被表達並治療前列腺癌症。
本發明還提供了一種治療患者中的感染的方法，方法包括對患者用權利要求l的核酸給藥，其中編碼的靶RNA特異性結合位點對感染因素才有的RNA有特異性，從而使核酸編碼的核酶被表達並除去感染因素。
附圖簡述


圖1顯示了編碼親代雙連體核酶(double ribozyme)的從NotⅠ位點起始的DNA。有下劃線的序列是NotⅠ位點(GCGGCCGC)和BglⅡ位點(AGATCT)。親代雙連體核酶的序列從NotⅠ位點起始。有下劃線的序列是NotⅠ位點(GCGGCCGC)和BglⅡ位點(AGATCT)圖2顯示了編碼整個序列的DNA，尋靶的三連體核酶的內部polⅠ用粗體表示。有下劃線的序列是NotⅠ位點(GCGGCCGC)和BglⅡ位點(AGATCT)。這是有尋靶三連體核酶的內部polⅠ(粗體表示)的整個序列。有下劃線的序列是NotⅠ位點(GCGGCCGC)和BglⅡ位點(AGATCT)圖3顯示了親代雙連體核酶的二維結構，其中克隆入核心核酶作為其反向互補DNA。
發明詳述核酶本發明提供了組織特異性和靶RNA特異性的核酶。這些核酶可用來破壞靶特異性腫瘤和治療病毒、細菌或寄生蟲感染及其它用途。本發明的核酶包括5＇端自催化斷裂的核酶序列、含靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶。本發明的核酶的一個例子以其DNA編碼序列顯示在圖2和SEQ IDNO:1中。1-164位的核苷酸編碼了包括5＇端和3＇端自催化核酶序列的核酶。這種典型核酶的5＇端自催化斷裂核酶、催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶分別顯示在SEQ ID NO:1中。
或者，5＇端自催化斷裂核酶可用轉錄的RNA的另一段序列來代替。在該RNA中，最初的20-30個(或更長)核苷酸後的序列是最初20-30個核苷酸反向補體。這樣，構建物估計可能仍在5＇端與polⅡ轉錄物一樣形成帽結構，但是最初核苷酸不會改變尋靶中間核酶的5＇側上核苷酸的特異性。由於轉錄物將形成帽結構，它可有效地輸送至細胞質。對於本發明有5＇和3＇自催化核酶的三連體核酶來說，希望有一些擴散將內部尋靶的核酶介導輸送至細胞質，儘管這一替換的5＇端應當提高細胞質比例。
本發明提供了有獨特特徵的核酶，其特徵是在其催化反應中有靶RNA特異性，並被組織特異性表達。在
圖1和SEQ IN NO:1所示的例子中，可與RNA聚合酶Ⅰ(A)(核糖體RNA聚合酶)單一序列特異性結合的RNA結合位點提供了靶RNA特異性。應當理解任何RNA的單一RNA序列可以作為本發明的靶RNA特異性核酶的靶。單一序列的測定方法是常規的，只要有大量的計算機資料庫(GenBank)和電腦程式(Genetics Computer Group,PCGENE and BLAST)來檢索查找任何與核酸序列配合的序列即可。位於一個資料庫上的單一DNA序列會有相應的單一RNA序列。
本發明核酶的催化性序列的一個例子也以其DNA編碼序列顯示在
圖1和SEQ ID NO:1中。其它催化性序列包括那些該領域已知的序列。許多序列變化確定了「主幹」區域中可允許的核苷酸變化(Fedor and Unlenbeck Proc.Nat.Acad.Sci.87:1668-1672,1990)。該領域技術人員會理解任何催化性序列(甚至那些還未公開的)可用來構建本發明的核酶，當其如這裡所述的以常規方式與自催化斷裂核酶和RNA結合位點結合時。
圖1和SEQ ID NO:1，以及圖2和3中顯示了和本發明的催化性核酶一起表達的5＇端和3＇端自催化斷裂核酶的例子。如下進一步所描述的，這些核酶對於催化性核酶的表達是重要的，因為它們一旦被轉錄形成一個有最小外端5＇或3＇序列的催化性核酶，它們就立即從核酶轉錄物上斷裂下來。因此，靶特異性結合位點和包括催化性核酶的催化性序列是以正確的構型與靶RNA結合併使其斷裂。例舉構建物中的外端序列是克隆技術的結果。應當理解通過選擇變化的克隆方案，可除去一些或全部這些外端核苷酸。
編碼核酶的核酸本發明也提供了編碼本發明的核酶的核酸。這些核酸可用來在選擇的位點上表達本發明的核酶。在治療組織特異性癌症時，這些位點可以是組織特異性的，或者在核酶防止感染性試劑來治療感染(如肝炎、皰疹、瘧疾、結核病等)時可以是靶特異性的。
本發明的核酸包括一個組織特異性啟動子的結合位點，位點在編碼5＇端自催化斷裂核酶序列、包括靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列的序列上遊。
產生核酶的構建物中的組織特異性啟動子結合位點使得核酶在組織中組織特異性表達，從選擇的啟動子開始活性轉錄RNA。因此，組織中只有利用啟動子的靶RNA會被核酶斷裂。
圖1和SEQ ID NO:1中顯示的典型的核酶採用了Probasin啟動子(一種前列腺上皮特異性啟動子)(Greenburg等人，1994)的結合位點。該組織特異性啟動子結合位點的序列顯示在(Greenburg等人，1994)中。
如所預料的，本發明的核酸構建物中可採用其它組織特異性啟動子。這些啟動子的例子包括前列腺特異性抗原(前列腺)、白蛋白(肝)、脂肪酸結合蛋白(骼骨)、乳清酸性蛋白(乳房)、平滑肌運動(平滑肌)等的結合位點。還未被鑑定出的靶特異性啟動子可用來使本發明的核酶表達定向到選擇的組織上。一旦鑑定出靶特異性啟動子，其結合序列可用常規方法如序列分析方法來測得。啟動子通過缺失分析、誘變、足跡法、凝膠移位和轉染分析來確定(Sambrook等人，分子克隆實驗手冊「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」,2nd Ed.Cold Spring HarborLabortory,Cold Spring Harbor,New York,1989)。
在本發明的編碼核酶的核酸中，編碼5＇端自催化斷裂核酶的核酸有SEQ IDNO:1中顯示的核苷酸1-54的序列。在本發明的編碼核酶的核酸中，編碼3＇端自催化斷裂核酶的核酸有SEQ ID NO:1中顯示的核苷酸111-164的序列。
應當理解，可以獲得本發明核酸編碼的其它5＇端和3＇端自催化斷裂核酶。這些核酶可根據Taira等人的方法來獲得(Nuc.Acids Res.19(19):5125-5130,1991)。
本發明的核酸編碼的催化性核酶含有兩個功能區一個高度保守的斷裂靶RNA的催化性序列(也稱為「催化核心」)，以及包括靶RNA特異性結合位點的側翼區域。通過核酸互補性，結合位點使核酶定向斷裂靶RNA分子上的特異性位點。側翼序列的長度不僅意味著特異性，也意味著單個核酶分子的斷裂效率。在本發明的催化性核酶中，側翼序列對靶RNA有高的特異性，但一旦發生斷裂很容易從靶RNA上解離下來。這就使得核酶可以循環(估計的Kcat約為1斷裂/分鐘)並減少了達到效果所需的核酶量。結合/解離值的範圍在16-21Kcal內應當是有效的。
人RNA的複雜度比人DNA要低約100倍，且特異性只通過12-15鹼基對就可實現。RNA-DNA雙鏈體受幾個因素的影響，如GC含量、溫度、pH、離子濃度和結構。最近鄰規則可提供對雙鏈體穩定性的有用評價(Castanotto等人，作為醫療試劑的反義催化RNA「Antisense Catalatic RNAs as Therapeutic Agents」Advances in Pharmacol.25:289-317,1994)。
如上所述，編碼的RNA結合位點是單一的，因此核酸編碼序列將是相應的單一DNA序列。RNA結合位點可包含與核糖體RNA聚合酶Ⅰ(A)亞單位的單一RNA序列結合的序列。編碼核糖體RNA聚合酶結合位點的DNA的序列如圖3所示。該序列來自RNA聚合酶Ⅰ(A)亞單位。
本發明的催化性核酶也包括催化性序列，它在靶RNA特異性結合位點結合的位點中間的附近處將靶RNA斷裂。在錘頭狀核酶中，催化性序列通常是高度保守的。保守的催化核心殘基是5＇CUGANGA3＇和5＇GAAA3＇，兩者通過進化上保守的莖-環結構來連接。
靶RNA上最保守的、且可能最有效的斷裂序列是5＇GUC3＇。然而，XUN(N=A、U或C)也可有效斷裂。該斷裂位點普遍存在於大多數RNA中，使得基本上所有的RNA能被尋靶(Whitton,J.Lindsay，病毒感染的反義治療「AntisenseTreatment of Viral Infection」Adv.in Virus Res.Vol.44,1994)。
關於靶RNA上合適位點的選擇，已知靶位點的二級結構對體外斷裂有影響(Whitton,1994)。因此，可用程序RNAFOLD(來自PCGENE組程序或國際網Internet上獲得)對選擇的靶分子序列來常規篩選潛在的二級結構。因此，可對靶可及性進行合理地預測。計算機輔助RNA摺疊(Castanotto等人，1994)和RNA三維模型計算機分析(Major等人，Science 253:1255-1260,1991和Castanotto等人，1994)在指導斷裂位點的選擇上是相當有效的。
內部核酶可尋靶至寄生蟲、病毒生命周期等所必需的非細胞類RNA上，且表達可由組織特異性或病毒特異性啟動子來驅動。申請中特別指出的三個重要的例子是A)肝炎B型病毒靶(選擇用相同核酶靶部位來斷裂病毒RNA前基因組、S蛋白和聚合酶/反向轉錄酶轉錄物)的白蛋白啟動子的應用；B)在紅細胞中有活性的普通啟動子的應用，用尋靶EMP-1蛋白家族(來自P.falciparum，其是瘧疾中細胞粘連和抗原變化所必需的)高度保守區的核酶；和C)HPV啟動子的應用，核酶尋靶E6蛋白翻譯起始位點附近的特異性位點，翻譯起始位點是E6和E7蛋白質(它們密切參與頸致癌)表達的關鍵位點。
本發明的一個核酸例子有序列表SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。該典型的核酸包括前列腺上皮特異性啟動子，其在編碼5＇端自催化斷裂核酶(有SEQ IDNO:1中所示序列)，編碼核糖體RNA結合位點的DNA(有序列表SEQ ID NO:1所示序列)，和3＇端自催化斷裂核酶(有SEQ ID NO:1所示序列)的序列上遊。
或者，啟動子結合位點和核酶編碼序列中可進行沉默鹼基取代，以在相同的組織內表達相同的核酶。因此，本發明提供了基本上有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸，其可編碼SEQ ID NO:1所示的核酶。核酸可根據所選的啟動子的特徵/定義而不同，且與SEQ ID NO:1有80％-99％的序列相同性，更佳的，其與SEQ ID NO:1有90％-99％的序列相同性，其它改進包括例如，為克隆目的而插入的核苷酸(圖2，其包括-1至-8，+69至+76)的變化(或缺失)，在圖3中，框包括作為克隆選擇的外部核苷酸，因此，它可作改進。未配對的鹼基可以是任何鹼基，其只由所選的克隆方案來確定。如果一對鹼基中的一個改變，則另一個必需以互補方式改變。而且，編碼核酶的序列可以以改變核酶序列但不影響核酶的靶RNA特異性或使斷裂活性失去的方式來變化。例如，在5＇、3＇端和內部核酶(圖2)的莖環區內的變化可以結合入其它構建物而維持催化活性(Fedor and Uhlenbeck，1990)。
核酶生成構建物的合成典型地，RNA結合序列和核心序列合成反向互補寡核苷酸，並複製人載體，從而生成含有核酶的有關RNA。本發明的核酶通過寡核苷酸(5＇GGA AGA TCTTTC AAA GAC TGA TGA CTC CGT GAG GAC GAA ACG AGG ATC AGA TCTTCC 3＇)和其反向互補體的合成來製得。克隆中所用的BglⅡ位點用下劃線表示。在合適的限制酶消化後，在這一具體的BglⅡ例子中，雙鏈DNA寡核苷酸被克隆入親代載體的多克隆位點(
圖1)。
功能測試一旦測序後，測定這些核酶的功能。測試可包括用兩種可能的細菌啟動子中的一種來轉錄核酶，在這一例中是SP-6或T-7(在痕量放射性存在下)，然後通過電泳來評價核酶的自催化斷裂。實施例中提供了來自這些測試的數據。
其它測試步驟包括體外轉錄的核酶與體外合成的靶RNA轉錄物或細胞質RNA製備物的培育。在培育後，RNA用標準的Northern印跡分析來檢驗靶RNA轉錄物的特異性分解。
構建的三連體核酶還可通過將其亞克隆到一個組織特異性啟動子啟動子之後來進行進一步測試，其中組織特異性啟動子可以組織特異性方式驅動靶上的載體表達。實施例中提供了來自這些測試的數據。
最後，三連體核酶實驗方法通過在小鼠體內實驗來進一步有效化。兩組這樣的研究如實施例描述的那樣進行。第一個例子用了比polⅠ核酶更容易監測的對照載體，其中對照載體包括驅動藻類綠色螢光蛋白質(pBGFT)表達的前列腺上皮特異性啟動子。該測試質粒用來確認我們的體內輸遞系統的有效性。第二個實驗也在有polⅠ核酶加入的小鼠中進行。在兩個例子中，無論是加入三連體核酶還是綠色螢光蛋白，動物均在操作後不同時間處殺死、解剖，並用免疫組織化學法測定各個組織的載體活性。
輸遞本發明的核酸可以是用來將核酸輸遞至表達核酶的部位處的載體。載體可以是一種商業上可獲得的製品，如pGM質粒(Promega)，載體輸遞可以通過脂質體，用商業上可獲得的脂質體製品或新研究出的有本發明脂質體特點的脂質體。也可採用其它常規輸遞方法在這裡的方法中測試。用脂質體輸遞的方法例子在實施例中有進一步描述。
脂質體的給藥方式可根據治療疾病以及尋靶組織的不同而不同。對於脂質體在其中會下沉的肺(如結核病和癌症)和肝(如肝炎和癌症)來說，靜脈給藥是合理的。對於許多其它局限性病理疾病，如癌症、感染(如肝炎、膀胱炎、直腸炎、子宮頸炎等)以及癌症前期疾病來說，在器官上遊動脈插入導管是較佳的輸遞方式，因為其避免了肺和肝大量地清除脂質體。對於其它許多部位的損傷(如皮膚癌、人乳頭瘤病毒感染、皰疹(嘴或生殖器)和癌症前期頸發育不良)，表面輸遞是有效的且較佳的，因為它很方便。
白血病和其它疾病如瘧疾，也很容易通過核酶來自體內給藥來治療。
脂質體可以表面給藥、非腸道給藥(如靜脈給藥)、肌肉間注射、腹膜內注射、經皮膚給藥、外體(excorporeally)給藥等，但是Ⅳ或表皮給藥是特別佳的。所需脂質體的確切量根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況，待治療疾病的嚴重程度，所用的特殊的化合物，其給藥方式等而不同。因此，不可能確定確切的量。然而，合適的量可由該領域普通技術人通過這裡提及的常規實驗法來測得。通常，劑量與實施例中給出的典型例子相近。
非腸道給藥，如果用的話，通常是指注射。注射製品可製成常規形式，如液體溶液或懸浮液、適用於在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形態或乳劑。一種最近改進的非腸道給藥方法是用緩慢釋放或持續釋放的系統，使得維持恆定水平的劑量。見如美國專利No.3,710,795，其結合人本文作參考。
表面給藥可以通過乳膏、凝膠、栓劑等。來自體內(外體)輸遞可以典型地用於其它上下文中。
轉基因動物本發明提供了一種轉基因非人類動物，其胚芽或體細胞中含有核酸，核酸包括一個靶特異性啟動子結合位點，位點在編碼5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列的序列上遊，其中動物表達的核酸含有5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列。
核酸可以是
圖1和SEQ ID NO:1中所示的核酸。或者，可在啟動子結合位點和核酶編碼序列中進行沉默鹼基取代，以在相同組織中表達相同的核酶。例如這些取代可如上所述那樣。
本發明的轉基因非人類動物是有用的，因為動物不表達與靶RNA相關的表型(如與其編碼的蛋白質相關)。這裡所用的術語「表型」包括受失效影響的形態學、生物化學曲線(如RNA或表達的蛋白質的變化量等)和其它參數。例如，健康細胞的死亡可以是由於核酶表達而改變表型的衡量標準。
轉化的宿主細胞本發明的核酶可在轉化的細胞系中表達。轉化細胞可用來使核酶表達特異性和對靶RNA斷裂活性的特異性有效。有如此篩選功能的例子在實施例中有所描述。
篩選方法本發明的轉基因動物和轉化的宿主細胞可用於篩選可使動物或宿主細胞表達與靶RNA有關的表型的化合物的方法。方法需要對動物/細胞用化合物給藥，並評價化合物引起表型表達的能力。如果表型恢復，則認為化合物是有效的。例如可製備L-多巴功能失效(L-dopa functional knockout)轉基因動物並用來篩選使L-多巴相關表型恢復的藥物。
治療增生型疾病本發明提供了一種治療患有特異組織增生疾病的患者的方法。治療通過抑制特異組織中的細胞增生來進行治療，且這是通過對患者用核酸給藥來實現的，核酸可編碼尋靶細胞存活或複製所必需的RNA的核酶，並含有對病患組織有特異性的靶特異性啟動子結合序列。核酸編碼的核酶在病患組織中表達，組織中必需RNA的生成被抑制，組織中的細胞增生被抑制，隨即引起細胞死亡而治療了增生疾病。
用本發明的方法來治療的增生疾病包括靶特異性啟動子來治療的幾乎所有的癌症，如前列腺、乳房、結腸、胰、肺和肝中的癌症。
例如，本發明提供了一種治療患有前列腺癌症的患者的方法，方法包括對患者用SEQ ID NO:1中所示的核酸來給藥，從而使核酸編碼的核酶在前列腺中表達來治療前列腺癌症。
治療病毒感染本發明提供了一種治療患者病毒感染的方法，方法包括用本發明核酸對患者給藥，其中編碼的靶RNA特異性結合位點對感染因素(infectious agent)單一RNA有特異性，從而使核酸編碼的核酶表達並殺死感染因素。轉錄可用病毒特異性啟動子或組織特異性啟動子來驅動，啟動子可在感染病毒的組織中選擇性地定向表達核酶，即用肝特異性自蛋白啟動子來定向表達抗肝炎B型病毒的核酶。
在測定抗病毒效應中，表達核酶的細胞系可與可支持病毒感染/複製/生成的負對照核酶比較。以上述相同方法可獲得表達核酶的細胞系並對其測定；而且在所有情況下可測得核酶防止感染的能力。
本發明將在下列非限制性的實施例中進行進一步詳細地描述。
實施例核酶基因治療前列腺癌症的測定本實施例指出了用於採用錘頭狀核酶的前列腺定向表達來殺死普通的和腫瘤型前列腺上皮的載體和新的方案。核酶是非常新穎的三連體核酶，其可通過攻擊必需RNA來定向破壞細胞。核酶的5＇和3＇端被設計成在轉錄時可自催化斷裂，使內部核酶(高水平地)游離存在於細胞中。
錘頭狀核酶的細胞內表達並定向尋靶細胞的必需RNA(如RNA聚合酶Ⅰ(A))致使細胞死亡。如果核酶是以限制性方式尋靶特異性組織，則只有該組織中的細胞受核酶表達的作用。選擇性地尋靶前列腺可通過鼠前列腺上皮特異性啟動子(pb)(或前列腺特異性抗原啟動子)來實現。由於用前列腺上皮特異性啟動子可尋靶組織特異性前列腺，因此載體全身輸遞或直接將載體引到前列腺上可使前列腺癌靶死亡，而在剩餘的正常前列腺上皮上也觀察到有一些伴隨損傷。由於前列腺上皮特異性啟動子的單一特異性，預計在體內其它部位不會有伴隨性損傷。這預計也適於前列腺特異性抗原。
靶的例子包括RNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ的Ⅰ(A)亞單位。其它內部尋靶的核酶可用所述方法來進行體外和體內活性測試。
合成構建
圖1所示的初級雙連體核酶載體。兩個側翼核酶(鹼基1至54和66至120)可以自身斷裂。將第三個尋靶polⅠmRNA的核酶(圖2)(鹼基64-105)克隆入側翼核酶之間。內部核酶有兩個區域內的19個鹼基(TTCAAAGA-催化核心-ACGAGGATCAG)，它們與polⅠ信息反義並通過最小二級結構區域內鹼基配對相互作用來實現斷裂。
內部polⅠ核酶通過寡核苷酸的合成來製得，寡核苷酸為5＇GGA AGA TCTTTC AAA GAC TGA TGA CTC CGT GAG GAC GAA ACG AGG ATC AGA TCTTCC3＇(只有核酶的有義鏈顯示在其反向補體中)。下劃線是克隆所用的BglⅡ位點。在用BglⅡ進行合適地限制性消化後，將雙鏈寡核苷酸複製人本發明載體的BglⅡ位點中(
圖1)。
輸遞當前列腺特異性啟動子與三連體核酶構建物偶聯時，它將通過脂質體全身輸遞至前列腺。各種引入血管系統的途徑(一些通過肺和肝)如所述的進行評價。也可用常位途徑(orthotopic route)。預計脂質體賦形劑是有效的，由於高度血管化，其足以將分子輸遞至前列腺癌細胞上。因此，通過這種基因治療方法來治癒或至少減少腫瘤負擔的結果是合理的。
在這些研究中用了下列脂質體製劑(a)脂質轉染胺試劑(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)是由正電荷液體DOSPA和中性液體DOPE以3∶1摩爾比組成的聚陽離子液體；(b)陽離子液體DDAB與DOPE以2∶1或0.6∶1.0的比例組合(Brunette等人，Mol.Cell.Biol.14∶2411-2418,1994)；和(c)DMRIE與DOPE以1∶1摩爾比組合(Felgner等人，Methods(Orlando)5∶67-75,1995)(從VICAL Corp.(SanDiego,CA)獲得)。脂質體試劑在轉染前保藏在4℃下。
測試一旦測序後就測試這些核酶的功能。測試機理包括用兩種可能的細菌啟動子中的一種來轉錄核酶，在這一例中是pCRⅡ載體中的SP-6或T-7(Invitrogen,SanDiego,Ca)(在痕量放射性存在下)，然後通過電泳來評價核酶的自催化斷裂。這是用polⅠ核酶來進行的，並發現有斷裂，即首先產生包括內部尋靶核酶和3＇端核酶的113bp片段，然後出現含有內部polⅠ核酶的74bp的片段。
隨後核酶通過將其瞬時轉染人C3H10T 1/2小鼠成纖維細胞來測試。其證實了當誘導三連體核酶表達時polⅠRNA被分解。因此測得並證實了分子的兩階段活性的產生。順式核酶的自催化斷裂和反式polⅠmRNA的功能性降解如預計地那樣發生。
隨後是將三連體核酶在組織特異性啟動子(如前列腺上皮特異性或前列腺特異性抗原的啟動子，其以組織特異性的方式使表達定向)控制下引入載體。這是通過用含有整個3＇、5＇端和內部核酶的Not1片段(圖2)並將其插入含有前列腺上皮特異性啟動子區的載體(-426至+28(Greenburg等人，1994))來實現的。該啟動子被證明可使基因表達定向到前列腺上。
在表達三連體核酶抗polⅠ構建物的轉基因小鼠體內測試載體。轉基因小鼠用Hogan描述的標準前核注射方法(鼠胚胎操作實驗手冊「Manipulating themouse embryo:a laboratory manual」,Cold Spring Harbor,NY 1986)來獲得。在注射前，用限制性酶(HindⅢ和SacⅡ)消化質粒，然後用蔗糖梯度分級來將構建物從載體DNA上分離下來。在注射前，分離獲得的構建物用10mm Tris pH 8.0,0.1mm EDTA來透析。在這些小鼠中，一旦前列腺上皮特異性啟動子表達變得明顯，則在產生後的3-5周階段就會發生前列腺上皮的破壞。在26隻輸遞的小鼠中，發生轉基因的小鼠的比例為10-15％，即有2-3隻轉基因小鼠。另一種確定本發明的核酶功能的方法是將載體引入組織培養物如人PC3前列腺癌細胞中，並觀察響應核酶激活後的細胞死亡情況。已經確認C3H10T 1/2小鼠成核細胞對polⅠ三連體核酶敏感。
通過體內研究可進一步證實該基因治療方法的有效性。下面進行兩組研究。在第一個例子中，採用比polⅠ核酶更容易監測的對照載體，其中對照載體包括驅動藻類綠色螢光蛋白質表達的前列腺上皮特異性啟動子，以確認脂質體的體內輸遞系統的有效性。步驟包括使小鼠麻醉並用外科手術使降主動脈暴露。將30導管徑計置於降主動脈中，然後引入300μg載體/千克體重(載體∶脂質體之比為10μg/40μl)。結果表明，綠色螢光蛋白質在背外側前列腺上皮中有表達而在肺(脂質體正常的靶)中沒有。進一步的研究要確定在肺和其它組織如腎、腎上腺和腦中是否發現有表達，第二個實驗也在用上述方法在體內有polⅠ核酶加入的小鼠中進行。在兩個例子中，無論是加入三連體核酶還是綠色螢光蛋白，動物均在操作後不同時間處殺死、解剖，並用免疫組織化學法測定組織的載體活性。數據表明，在給藥7天後前列腺上皮中有程序性細胞死亡(apoptotic cell death)。
在產生前列腺腫瘤的轉基因小鼠中進行體內研究。腫瘤通過前列腺上皮特異性啟動子控制的基因如EcoRl(一種限制性酶)、cfos(一種原癌基因)或lamin(一種核基質分子)改進型的表達來誘導產生。核酶如上所述進行給藥。
靶選擇各種分子被選擇用來尋靶。第一種是RNA聚合酶Ⅰ(A)。它是很好的靶，因為其是一種高豐度RNA。如果在前列腺細胞除外的細胞內有前列腺上皮特異性啟動子滲漏(低水平轉錄)，預計它們可使限制水平的polⅠ核酶存活。測定其它潛在的靶，它們包括果糖磷酸激酶(根據包括的組織，核酶靶部位為核苷酸178、121或162)、RNA polⅡ亞單位14.4kd(核酶靶部位為核苷酸83或884)、mRNApolⅡ140kd亞單位(核酶靶部位為核苷酸204)和RNA polⅡ23kd亞單位(核酶靶部位為核苷酸143)。
其它潛在的感興趣靶是複製蛋白A的70kD亞單位。它是DNA複製中點/焦點(centers/foci)形成所需的，因此它應破壞DNA的複製而沒有引入錯誤的危險。序列參考Kim等人的分子細胞生物學Mol.Cell.Biol.12:3050-3059,1992。
寄生蟲感染的核酶基因治療法上述方法適用於本文，除非另有特指。例如，對於寄生蟲感染，其給藥方式與前列腺癌症不同，並與組織部位有關。
對於瘧疾(惡性瘧原蟲)，對EMP-1蛋白進行尋靶，它是細胞粘連所必需的並且帶來迅速改變抗原的問題。特別地，對外顯子Ⅱ中的高度保守的GTC進行定向。相關的EMBL登記號為L42246、L42244、L42245、L42247、L40600-L40609、L42636。見Smith等人，Cell 82:101-110,1995，和Su,X等人，細胞學Cell 82:89-100,1995。可用在紅細胞中有活性的啟動子，治療也可在體外進行。
細菌感染的核酶基因治療法上述方法適用於本文，除非另有特指。例如，對於細菌感染，其給藥方式與前列腺癌症不同，並與組織部位有關。
對於結核分支桿菌，對細胞進入所必需的轉錄片段進行尋靶。EMBL登記號為X70901。見Arruda,S.等人，科學Science 26l:1454-1457,1993。靶在1535bp片段的靠近編碼52kD蛋白質的開放讀框N端處。
病毒感染的核酶基因治療法上述方法適用於本文，除非另有特指。例如，對於病毒感染，其給藥方式與前列腺癌症不同。
人乳頭瘤病毒型16E6和E7蛋白質從雙順反子mRNA翻譯獲得。E6的翻譯起始位點的反義寡核苷酸抑制了E6和E7的合成。靶可以是GTT，其在核苷酸108處斷裂(Tan等人，基因病毒雜誌J.Gen.Virol.75:2663-2670,1994)。原始數目來自Seedort等人，病毒學Virology 145:181-185,1985。Ⅳ和表面給藥應有效組合。表面給藥應對發育不良/癌症前期損傷。
肝炎B型病毒是部分為單鏈DNA的病毒，現在認為病毒基因組的整合不是關鍵。而病毒基因組形成延伸的RNA中間體，然後中間體反向轉錄成DNA。選擇有多個有利點的靶。它將在第一位置處切開病毒RNA前基因組，其位於S(包膜)和聚合酶/逆轉錄酶區。切口在HBV亞型ayw的核苷酸438後GTC處。EMBL登記號是X02496，其原始序列參考Galibert等人，Nature 281,646-650,1979。表達通過白蛋白啟動子來驅動，Ⅳ給藥是非常有效的。
儘管前述的發明為了清楚和便於理解，在一些細節上進行了描述，但是該領域技術人員應當理解，根據本公開，在不脫離發明和權利要求的範圍內可作出各種形式和細節上的變動。
在本申請中，各種公開均參照括號的文獻。為了更詳細地描述本發明所述領域的技術狀況，這些完全公開的出版物結合入本申請中作為參考。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人南卡羅來納州醫學院171 Ashley AvenueCharleston,South Carolina 29464(ⅱ)發明名稱組織特異性和靶RNA特異性核酶(ⅲ)序列數目1(ⅳ)通信地址(A)收信人NEEDLE ROSENBERG,P.G.
(B)街道127 Peachtree Street,Suite 1200(C)城市Atlanta(D)州Georgia(E)國家USA(F)郵編30303(ⅴ)計算機可讀形式(A)記錄介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容型(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0,#1.30版(ⅵ)本申請資料(A)申請號美國申請號No.08/554,369(B)申請日1995年11月8日(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息
(A)姓名Spratt,Gwendolyn D.
(B)登記號36,016(C)參考/案卷號19070.0030/P(ⅸ)通訊信息(A)電話404/688-0770(B)傳真404/688-9880(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度184鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GCGGCCGCTCGAGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGTACCCGGTACCGTCAGCTC60GAGCTCAGATCTTTCAAAGACTGATGACTCGCTGAGGACGAAACGAGGATCAGATCTGGA120TCCGTCGACGGATCTAGATCCGTCCTGATGAGTCGTGAGGACGAAACGGATCTGCAGCGG180CCGC18權利要求
1．一種核酸，它包括一個靶特異性啟動子的結合位點，位點在編碼5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列的序列上遊。
2．根據權利要求1所述的核酸，其中靶特異性啟動子結合位點是前列腺上皮特異性啟動子的結合位點。
3．根據權利要求1所述的核酸，其中編碼5＇端自催化斷裂核酶的核酸有序列表中SEQ ID NO:1指出的核苷酸9-62的序列。
4．根據權利要求1所述的核酸，其中編碼3＇端自催化斷裂核酶的核酸有序列表中SEQ ID NO:1指出的核苷酸119-172的序列。
5．根據權利要求1所述的核酸，其中編碼催化性核酶的核酸包括靶RNA特異性結合位點，該結合位點與核糖體RNA，即聚合酶Ⅰ(A)的單一RNA序列結合。
6．根據權利要求5所述的核酸，其中核酸有序列表中SEQ ID NO:1指出的核苷酸72-113的序列。
7．根據權利要求1所述的核酸，其基本上由序列表中SEQ ID NO:1所指序列的核苷酸組成。
8．根據權利要求1所述的核酸，其有序列表中SEQ ID NO:1所指的序列。
9．載體中的權利要求1所述的核酸。
10．載體中的權利要求2所述的核酸。
11．載體中的權利要求3所述的核酸。
12．載體中的權利要求4所述的核酸。
13．載體中的權利要求5所述的核酸。
14．載體中的權利要求6所述的核酸。
15．載體中的權利要求7所述的核酸。
16．載體中的權利要求8所述的核酸。
17．一種轉基因非人類動物，其生殖細胞或體細胞中含有權利要求1所述的核酸，其中動物表達的核酶包括5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列。
18．一種轉基因非人類動物，其生殖細胞或體細胞中含有權利要求7所述的核酸，其中動物表達的核酶包括5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列。
19．一種轉基因非人類動物，其生殖細胞或體細胞中含有權利要求8所述的核酸，其中動物表達的核酶包括5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列。
20．根據權利要求17所述的轉基因非人類動物，其中動物不表達與靶RNA相關的表型。
21．一種篩選化合物活性的方法，化合物可終止權利要求20所述的動物表達與靶RNA相關的表型，方法包括對動物用化合物給藥並評價其使表型表達終止的能力。
22．一種通過抑制組織中細胞增生來治療患有特異性組織增生疾病的患者的方法，方法包括為患者用權利要求5所述的核酸給藥，其中靶特異性啟動子結合序列對疾病組織有特異性，從而使核酸編碼的核酶表達，組織中核糖體RNA的產生被抑制，細胞增生被抑制，從而來治療增生疾病。
23．一種治療患有前列腺癌症的患者的方法，方法包括對患者用權利要求7所述的核酸給藥，從而使核酸編碼的核酶在前列腺中表達來治療前列腺癌症。
24．一種治療患者的感染型疾病的方法，方法包括對患者用權利要求1所述的核酸給藥，其中編碼的靶RNA特異性結合位點對感染因素單一RNA有特異性，從而使核酸編碼的核酶被表達並除去感染因素。
全文摘要
本發明提供了組織特異性和靶RNA特異性核酶。這些核酶可用來破壞靶特異性腫瘤並治療病毒感染等。本發明的核酶包括5′端自催化斷裂的核酶序列、包括靶RNA特異性結合位點的催化性核酶和3′端自催化斷裂的核酶。本發明也提供了編碼本發明的核酶的核酸。這些核酸可用來在選擇部位表達本發明的核酶。本發明還提供了通過用核酶給藥來治療疾病的方法。
文檔編號A01K67/027GK1207769SQ96198727
公開日1999年2月10日 申請日期1996年11月8日 優先權日1995年11月8日
發明者J·S·諾裡斯, G·A·克勞森 申請人:南卡羅來納州醫學院, 賓夕法尼亞州研究基金會