用於鑑定具有獨特核糖體翻譯譜的哺乳動物細胞亞群的方法

2023-04-27 13:07:56 1

專利名稱：用於鑑定具有獨特核糖體翻譯譜的哺乳動物細胞亞群的方法
技術領域：
本發明一般涉及具有獨特核糖體譜，即翻譯活性的哺乳動物細胞亞群。本發明進一步涉及用於鑑定和分離這些細胞的方法、包含這些細胞的試劑盒，或利用這些哺乳動物細胞亞群的方法。
背景技術：
生物體中的正常生物活性結合了構成個體基因組的基因響應於外界的內源性表達。在高級真核生物中，基因表達開始於細胞核中，其中基因組DNA轉錄為pre-mRNA或「初級」RNA轉錄物。而仍在細胞核中，pre-mRNA被修飾為包括5'帽結構，形成異核核糖核蛋白 (hnRNP)複合體，獲得3'多聚腺苷酸尾，並經歷剪接以去除間插RNA序列(例如內含子)。 成熟mRNA接著輸出到細胞質，在那裡蛋白質複合體指導(1)經由5'帽結構與核糖體的締合，稱為帽依賴性翻譯，或⑵與促進mRNA儲存、加工或降解的胞漿RNA結合蛋白的相互作用。在核糖體驅使的翻譯之後，3'-多聚腺苷酸尾的連續縮短導致mRNA體轉運至核糖核酸酶(RNAse)的複合體(稱為外來體)，其降解老化的mRNA並有效地終止蛋白質合成。如所預期的，基因表達是必定在特定時間、以特定速率和數量產生所需基因產物 (通常是多肽)的高度調節過程。除轉錄調節之外，轉錄後過程諸如mRNA衰變和翻譯也是基因表達中的關鍵檢查點。不足為奇的是，由基因突變或對外部刺激的異常反應所產生的細胞表達譜的改變會引起嚴重異常，該嚴重異常常常導致急性細胞死亡或慢性疾病表型的表現。由環境因素(諸如營養水平改變、細胞因子、激素和溫度變動)以及環境應激(如低氧、低鈣血、病毒感染和組織損傷)所引起的廣泛或長時間的細胞刺激導致帽依賴性翻譯的快速衰減。此過程是自適應性的，因為它縮減了立即應激反應和恢復所不需要的全蛋白質合成。然而，此翻譯減弱並不完全消除核糖體活性，因為應激反應和恢復基因的許多產物繼續由稱為非帽依賴性翻譯的替代過程來合成(評述於Guhaniyogi & Brewer，2001， Gene 265(1-2) :11-23)。非帽依賴性翻譯通過將核糖體直接募集到稱為內部核糖體進入位點(IRES)的特異性RNA結構而發生。IRES元件已經在許多真核生物mRNA中得到鑑定(Bormal S等， (2003)Nucleic Acids Res. 31 :427-4 )，並確保在「帽依賴性」翻譯起始受到抑制時(即， 凋亡、飢餓、Y輻射、低氧、有絲分裂或終末分化)在細胞核失活或急性細胞應激期間蛋白質或其片段的高效表達。忽視對5' mRNA帽結構的需要最初被描述為不考慮感染細胞中細胞帽依賴性翻譯的幾乎完全抑制而翻譯病毒RNA的機制(Jang等，1988，J. Virol. ,62 =2636-43)。一般來說，IRES序列無法由序列同源性鑑定，並且使用功能性試驗驗證了充分表徵的IRES元件 (Mountford 禾口 Smith, 1995, TIG, 11(5) 179-184 ;Baird 等，2006，NAR, 12(10) :1755-85)。 當前證據顯示，IRES RNA的構象和輔助蛋白與特異性mRNA序列的結合使核糖體能夠結合。 在真核細胞中，IRES指導的翻譯常常與含有特別長的熱力學穩定的RNA二級結構的mRNA的5'非翻譯區(5' UTR)相關聯，所述二級結構具有多個短開放閱讀框(ORF)，其顯著抑制核糖體依賴性翻譯的起始。然而，對於許多這些5 『 UTR IRES元件的IRES活性的功能驗證因存在克隆自重疊5'基因啟動子的轉錄效應子序列而複雜化。在IRES報告載體中採用這些5' UTR元件的嘗試因這一剩餘本底轉錄活性而複雜化，所述剩餘本底轉錄活性掩蓋了由這些序列產生的任何翻譯調節。因此，非帽依賴性翻譯和它的調節仍然是未研究的領域， 大體上利用翻譯作為讀出工具的系統也如此。發明概述本發明的一個目的在於提供用於鑑定所需的哺乳動物細胞亞群的方法。所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細胞亞組以形成毒素處理細胞，哺乳動物細胞用包含以下任一項的核酸表達盒穩定轉化(1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA 分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；測定相比於參照標準所表達的報告蛋白水平的毒素處理細胞中由報告基因編碼的報告蛋白的水平，以鑑定哺乳動物細胞亞組是否表現所需哺乳動物細胞亞群的表型；如果哺乳動物細胞的毒素處理細胞表現所需哺乳動物細胞亞群的表型，那麼從哺乳動物細胞分離至少一個細胞以形成細胞培養物；使細胞培養物生長以形成哺乳動物細胞亞群；和任選地用至少一種毒素處理哺乳動物細胞亞群並重複所述測定、分離和生長步驟，直到鑑定出所需的哺乳動物細胞亞群。本發明的另一個目的在於提供用於鑑定哺乳動物細胞翻譯是否對一種物質有抗性或用於測定一種物質對哺乳動物細胞是否有毒性的方法。所述方法包括用包含以下任一項的核酸表達盒穩定轉化哺乳動物細胞以形成穩定轉化的細胞(1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列， 該序列編碼報告基因並從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；用至少一種毒素處理穩定轉化的哺乳動物細胞的亞組以形成毒素處理細胞；測定相比於參照標準所表達的報告蛋白水平的毒素處理細胞中由報告基因編碼的報告蛋白的水平，以鑑定穩定轉化的哺乳動物細胞亞組是否表現所需哺乳動物細胞亞群的表型；如果哺乳動物細胞的毒素處理細胞表現所需哺乳動物細胞亞群的表型，那麼從穩定轉化的哺乳動物細胞分離至少一個細胞以形成細胞培養物；使細胞培養物生長以形成哺乳動物細胞亞群；任選地用至少一種毒素處理哺乳動物細胞亞群並重複所述測定、分離和生長步驟，直到鑑定出所需的哺乳動物細胞亞群；使所需的哺乳動物細胞亞群與所述物質接觸；和所需的哺乳動物細胞亞群與所述物質接觸後，檢測所述報告蛋白的存在或測定報告蛋白的水平，其中與未暴露於所述物質的對照哺乳動物細胞相比，所述物質的毒性和哺乳動物細胞翻譯對物質的抗性和報告蛋白的存在或報告蛋白的水平增加相關， 並且與未暴露於所述物質的對照哺乳動物細胞相比，物質毒性的缺乏和哺乳動物細胞翻譯對物質抗性的缺乏和不存在報告蛋白或報告蛋白水平降低相關。本發明的又一目的在於提供利用本發明的方法獲得的具有獨特核糖體譜的哺乳動物細胞亞群。與此相關，本發明進一步提供如本文中所定義的I類、II類和III類哺乳動物細胞。本發明的再一目的是提供試劑盒，其包含用於與I類細胞或其裂解物、II類細胞或其裂解物或者替代地III類細胞或其裂解物一起使用試劑盒的說明書。本發明的另一目的在於提供用於重組表達目標多肽的方法。所述方法包括向III 類哺乳動物細胞中引入第二核酸表達盒，該表達盒包含以下任一項(1)編碼在受脅迫和/ 或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；使表達第二核酸表達盒的哺乳動物細胞在允許表達目標多肽的條件下生長；和純化目標多肽。本發明還涉及用來產生目標多肽的哺乳動物細胞，目標多肽是通過包括以下步驟的方法獲得向III類哺乳動物細胞中引入第二核酸表達盒，該表達盒包含以下任一項 (1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；和使表達第二核酸表達盒的哺乳動物細胞在允許表達目標多肽的條件下生長。本發明的又一目的是提供用於鑑定參與非帽依賴性翻譯的調節的蛋白質的方法。 所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細胞以形成毒素處理細胞，哺乳動物細胞用包含以下項的核酸表達盒穩定轉化編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從TR元件翻譯；由毒素處理細胞製備細胞裂解物；分離編碼TR元件的mRNA和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列；使mRNA和來自細胞裂解物的蛋白質接觸以形成與mRNA結合的蛋白質；和鑑定所述與mRNA結合的蛋白質。本發明還提供用於驗證I類、II類或III類哺乳動物細胞保留它們的翻譯表型的方法。所述方法包括用(多種)毒素處理I類、II類或III類哺乳動物細胞的亞組；測定相比於參照標準所表達的報告蛋白水平的哺乳動物細胞亞組中由報告基因編碼的報告蛋白的水平；驗證哺乳動物細胞保留它們的表型，其中I類細胞的特徵在於報告蛋白的表達大於未曾用毒素處理的哺乳動物細胞中報告蛋白的表達高達500%，II類細胞的特徵在於報告蛋白的表達大於未曾用毒素處理的哺乳動物細胞中報告蛋白表達的500%以上到 1400%，並且III類細胞的特徵在於報告蛋白的表達大於未曾用毒素處理的哺乳動物細胞中報告蛋白表達的1400%以上到約75000%。本發明的再一目的在於提供用於測定一種物質抑制哺乳動物細胞中蛋白質翻譯的能力的方法。所述方法包括使I類、II類或III類哺乳動物細胞與所述物質接觸；和測定相比於未曾用物質處理的細胞所產生的報告蛋白的表達的與所述物質接觸後由哺乳動物細胞所產生的報告蛋白的表達，其中由物質處理細胞所產生的報告蛋白的表達相比於未曾用物質處理的細胞所產生的報告蛋白表達的減少表明物質抑制蛋白質翻譯。本發明的另一目的在於提供用於恢復所需哺乳動物細胞亞群的表型的方法。所述方法包括培養至少一個哺乳動物細胞亞組以形成培養細胞，其中用核酸表達盒穩定轉化哺乳動物細胞，該表達盒包含用於選擇標記的核苷酸序列和以下任一項(1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；用選擇標記對其提供抗性的物質處理培養的細胞，使得不再含有核酸表達盒的培養細胞死亡；使處理細胞生長以形成哺乳動物細胞亞群；和任選地重複所述培養、處理和生長步驟，直到復原所需哺乳動物細胞亞群的表型。其它目的與特點將在下文部分顯而易見並部分指出。附圖簡述

圖1示出人HCT116細胞系對5_試驗和15-試驗程序的TR特異性反應。圖IA顯示用五個單毒素試驗測試細胞的5-試驗柱狀圖。表3中示出這些研究中所用毒素的組成和濃度。在此柱狀圖中，將TR特異性反應顯示為對HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆#30細胞系重複三次(每柱三個樣本)進行的三個獨立試驗(三個柱)。使用標準微量酶標儀試驗測定熒火蟲螢光素酶(fLUC)蛋白活性並表達為處理培養物與未處理培養物的比率(即，誘導倍數)。每個柱代表超過1. 0的比率並指示表現TR依賴性翻譯的細胞。TPA單毒素試驗產生TR調節翻譯的最顯著增加。圖IB示出由HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆#38細胞系的三個重複樣本產生的TR特異性反應的5-試驗柱狀圖。這些結果強調了細胞反應的幅度差異。圖IC示出HCTl 16 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆#30細胞反應的15-試驗柱狀圖。如上所述，重複三次進行所有試驗。圖IC示出在組合TPA+泰素的二毒素試驗中TR調節翻譯的極顯著增加，這在單毒素5-試驗中未觀察到。圖ID顯示HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆#38細胞系的15-試驗柱狀圖。如前所述，在TPA+泰素處理的樣本中觀察到TR介導的翻譯的較大增加。這證實在所測試的毒素之中，使用單毒素試驗程序，TPA或泰素產生最佳的TR特異性反應。然而，在組合TPA+泰素處理中觀察到的TR反應的較大增加證實TPA+ 泰素試驗是所測試的二毒素組合中用於產生最大TR特異性翻譯增加的最佳毒素試驗。圖2示出應用毒素試驗程序鑑定翻譯反應HEK293細胞並把這些細胞指派到確定的類別。圖2A左圖示出由用mTRdm-fLUC表達載體穩定轉化的人胚腎HEK293細胞池所產生的TR反應的15-試驗柱狀圖。此圖中毒素的組成和濃度如表3中所描述。使用微量酶標儀分析測定fLUC蛋白活性，將其表達為處理樣本與未處理樣本的比率(即，誘導倍數)。 右圖示出表達人hTRdm-fLUC表達載體的HEK293細胞池的TR反應的15-試驗柱狀圖。圖2B示出由用小鼠mTRdm-fLUC (淺色柱)和人hTRdm-fLUC (深色柱)表達盒穩定轉化的HEK293細胞池產生的TR反應的5-試驗柱狀圖。這一直接比較顯示在對TR序列的幅度或毒素反應上沒有物種特異性差異。圖2C示出對於來自HEK293 hTRdm-fLUC池的9個亞克隆的酶標儀結果的例子。不用毒素(UNT)或用TPA單毒素試驗(TPA)處理重複三次的樣本。對酶標儀值求平均並表示為未處理樣本與處理樣本的比率(誘導倍數)。對於具有統計上超出剩餘兩個重複值的範圍的任何原始值的樣本，指派可疑反應並在隨後試驗中對這些樣本進行再篩選(用問號標註)。表現一致低值的樣本(處於或接近給定增益設定下的酶標儀背景值)被視為無反應性的並從任何繼續評估中去除(用XX標註)。本實施例中，9個隨機樣本返回為6個反應克隆(4. 1到17. 4的誘導倍數範圍)、2個可疑克隆和1個表現背景值的克隆。圖2D左表示出對於用TPA毒素試驗處理的43個HEK293mTRdm-fLUC細胞亞克隆所觀察到的誘導倍數和它們的類別指派。右上圖示出43個HEK293 mTRdm-fLUC細胞亞克隆的呈等級順序(χ軸上從最低到最高)與誘導倍數(y軸)的函數形式的曲線圖，稱之為等級圖。右中圖示出去除了最大的異常值物種來突出具有較小翻譯反應的反應亞克隆的同一等級圖。右表示出使用所有等級圖結果的彙編來定義類別命名的類別指派。對於HEK293 mTRdm-fLUC細胞池，43個反應者中有25個(58. 1% )顯示誘導倍數值在5. 0以下的低TR 特異性毒素反應(稱之為I類細胞)，43個亞克隆中有13個(30.2%)表現II類表型(超過5.0到14.0的範圍)，而43個亞克隆中有5個(11.6%)表現III類表型(超過14.0 的誘導倍數)。圖2E左表示出對於82個HEK293 hTRdm-fLUC細胞亞克隆所觀察到的誘導倍數和類別指派。右上圖示出82個HEK293 hTRdm-fLUC細胞亞克隆的等級圖。右表示出對於 HEK293 hTRdm-fLUC細胞池的類別指派。82個反應者中有50個(61. 0% )顯示I類反應， 82個亞克隆中有27個(32.9%)表現II類表型，並且82個亞克隆中有5個(6. 1%)表現 III類表型。圖2F上圖是示出65個HEK293 mTRplp-fLUC亞克隆的等級圖。下表示出對於 HEK293 mTRplp-fLUC細胞池的類別指派。65個亞克隆中有51個(78.5%)是I類細胞，65 個中有13個0% )表現II類表型，並且65個中有1個(1. 5% )顯示III類反應。圖2G上圖是示出39個HEK293 CMV-fLUC亞克隆反應的等級圖。下表示出對於 HEK293 CMV-fLUC池的類別指派；39個亞克隆中有34個(87. 2% )顯示I類反應，39個中有4個(10. 3% )表現II類表型，並且39個中有1個O. 6% )產生III類反應。圖3示出應用毒素試驗程序鑑定翻譯反應HEK293細胞並把這些細胞指派到確定的類別。圖3A上圖是由用小鼠mTRdm-gLUCfeaussia螢光素酶)表達載體穩定轉化的 HEK293細胞池在用TPA單毒素試驗處理之後所產生的81個TR反應的等級圖。下表示出對於HEK293 mTRdm-gLUC池的類別命名；81個亞克隆中有56個(69. 1% )顯示I類反應， 81個亞克隆中有23個4% )表現II類表型，並且81個反應者中有2個O. 5% )顯示 III類表型。圖;3B上圖是示出89個HEK293 hTRdm-gLUC亞克隆反應的等級圖。下表示出對於 HEK293 hTRdm-gLUC池的類別指派；89個中有56個(62. 9% )顯示I類表型，89個中有30 個(33. 7% )顯示II類反應，並且89個中有3個(3. 4% )表現III類反應。圖3C上圖是示出來自HEK293 mTRplp-gLUC亞克隆的69個反應的等級圖。下表示出對於HEK293 mTRplp-gLUC池的類別命名；69個中有58個(84. 1% )標記為I類細胞， 69個中有9個(13. 0% )表現II類反應，並且69個中有2個O. 9% )顯示III類表型。圖4示出應用毒素試驗程序鑑定翻譯反應U20S細胞並把這些細胞指派到確定的類別。圖4A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲螢光素酶)表達載體穩定轉化的人骨骼骨肉瘤U20S細胞池在用TPA單毒素試驗處理之後所產生的106個TR反應的等級圖。下表示出對於U20S mTRdm-fLUC池的類別命名；106個亞克隆中有95個(89.6%)顯示I類反應，106個亞克隆中有11個(10.4%)表現II類表型，並且106個反應者中有0個(0%) 顯示III類表型。圖4B上圖是示出82個U20S mTRplp-fLUC亞克隆反應的等級圖。下表示出對於 U20S mTRplp-fLUC池的類別標記；82個中有81個(98.8%)顯示I類表型，82個中有1個(1.2% )顯示II類反應，並且82個中有0個(0% )表現III類反應。圖4C上圖是示出來自U20S CMV-fLUC亞克隆的79個反應的等級圖。下表示出對於U20S CMV-fLUC池的類別命名；79個中有78個(98. 7% )標記為I類細胞，79個中有0 個(0%)展表現II類反應，並且79個中有1個(1.2%)顯示III類表型。圖5顯示應用毒素試驗程序鑑定翻譯反應MCF7細胞並把這些細胞指派到確定的類別。圖5A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲螢光素酶)表達載體穩定轉化的人乳腺癌MCF7細胞池在用TPA單毒素試驗處理之後所產生的11個TR反應的等級圖。下表示出對於MCF7 mTRdm-fLUC池的類別命名；11個亞克隆中有6個(54.5%)顯示I類反應，11 個亞克隆中有4個(36.4%)表現II類表型，並且11個反應者中有1個(9. 1%)顯示III
類表型。圖5B上圖是示出36個MCF7 mTRplp-fLUC亞克隆反應的等級圖。下表示出對於 MCF7 mTRplp-fLUC池的類別命名；36個中有31個(86. 1 % )顯示I類表型，36個中有3個 (8.3% )顯示II類反應，並且36個中有2個(5. 6% )表現III類反應。圖5C上圖是示出來自MCF7 CMV-fLUC亞克隆的50個反應的等級圖。下表示出對於MCF7 CMV-fLUC池的類別命名；50個中有45個(90.0% )標記為I類細胞，50個中有5 個(10. 0% )表現II類反應，並且79個中有0個(0% )顯示III類表型。圖5D上圖是示出由MCF7 hTRdm-fLUC亞克隆產生的89個反應的等級圖。下表示出對於MCF7 hTRdm-fLUC池的類別命名；89個中有68個(76. 4% )標記為I類細胞，89個中有17個(19.1%)表現II類表型，並且89個中有4個顯示III類反應。圖5E上圖是示出由在MCF7轉染池的二次篩選中分離的MCF7mTRdm_fLUC亞克隆所產生的92個反應的等級圖。下表示出對於二次MCF7 mTRdm-fLUC池的類別命名；92個中有27個09.3%)標記為I類細胞，92個中有19個7%)表現II類表型，並且92 個中有46個(50. 0% )顯示III類反應。圖6顯示應用毒素試驗程序鑑定翻譯反應DU145細胞並把這些細胞指派到確定的類別。圖6A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲螢光素酶)表達載體穩定轉化的人前列腺癌DU145細胞池的初級篩選在用TPA毒素試驗處理之後所產生的22個TR反應的等級圖。下表示出對於DU145 mTRdm-fLUC池的類別命名；22個亞克隆中有5個7% )顯示I類反應，22個亞克隆中有13個(59. 1 % )表現II類反應，並且22個反應者中有4個 (18. 2% )顯示III類表型。圖6B上圖是示出由在DU145轉染池的二次篩選中分離的DU145mTRdm_fLUC亞克隆所產生的65個反應的等級圖。下表示出對於二次DU145mTRdm-fLUC池的類別命名；65個中有10個(15.4%)標記為I類細胞，65個中有33個(50.8%)表現II類表型，並且65 個中有22個(33. 8% )顯示III類反應。圖6C上圖是示出來自DU145 CMV-fLUC亞克隆的初級篩選的16個反應的等級圖。 下表示出對於DU145 CMV-fLUC池的類別命名；16個中有14個(87. 5% )標記為I類細胞， 16個中有2個(12. 5% )表現II類反應，並且16個中有0個(0% )顯示III類表型。圖6D上圖是示出由在DU145轉染池的二次篩選中分離的DU145CMV_fLUC亞克隆所產生的55個反應的等級圖。下表示出對於二次DU145CMV-fLUC池的類別命名；55個中有30個(54.5%)標記為I類細胞，55個中有22個00.0%)表現II類表型，並且55個中有3個(5. 5% )顯示III類反應。圖7顯示應用毒素試驗程序鑑定翻譯反應HCTl 16細胞並把這些細胞指派到確定的類別。圖7A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲螢光素酶)表達載體穩定轉化的人結腸直腸癌HCTl 16細胞池的初級篩選在用dbcAMP(圖7A-C)和TPA (圖7D-E)單毒素試驗處理之後所產生的21個TR反應的等級圖。下表示出對於HCT116 mTRdm-fLUC池的類別命名； 21個亞克隆中有20個(95.2%)顯示I類反應，21個亞克隆中有1個表現II類表型，並且21個反應者中有0個(0%)顯示III類表型。圖7B上圖是示出12個HCT116 mTRplp-fLUC亞克隆反應的等級圖。下表示出對於HCT116 mTRplp-fLUC池的類別命名；12個中有11個(91.7%)顯示I類表型，12個中有0個(0% )顯示II類反應，並且12個中有1個(8. 3% )表現III類反應。圖7C上圖是示出來自HCT116 CMV-fLUC亞克隆的6個反應的等級圖。下表示出對於HCTl 16 CMV-fLUC池的類別命名；6個中有6個(100.0%)標記為I類細胞，6個中有 0個(0% )表現II類反應，並且6個中有0個(0% )顯示III類表型。圖7D上圖是示出由在HCT116轉染池的二次篩選中分離的HCT116mTRdm_fLUC亞克隆所產生的39個反應的等級圖。下表示出對於二次HCT116 mTRdm-fLUC池的類別命名； 39個中有四個(74.4%)標記為I類細胞，39個中有8個5% )表現II類表型，並且 39個中有2個(5. )顯示III類反應。圖7E上圖是示出來自HCT116 hTRdm-fLUC亞克隆的21個反應的等級圖。下表示出對於HCTl 16 hTRdm-fLUC池的類別命名；21個中有10個07.6%)歸為I類，21個中有 7個(33. 4% )表現II類反應，並且21個中有4個(19. 0% )顯示III類表型。圖8顯示應用毒素試驗程序鑑定翻譯反應MDA231細胞並把這些細胞指派到確定的類別。圖8A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲螢光素酶)表達載體穩定轉化的人乳腺癌MDA231細胞池在用dbcAMP單毒素試驗處理之後所產生的9個TR反應的等級圖。下表示出對於MDA231 mTRdm-fLUC池的類別命名；9個亞克隆中有9個(100.0% )顯示I類反應，9個亞克隆中有0個(0% )表現II類反應，並且9個反應者中有0個(0% )顯示III
類表型。圖8B上圖是示出33個MDA231 mTRplp-fLUC亞克隆反應的等級圖。下表示出對於MDA231 mTRplp-fLUC池的類別命名；33個中有33個(100.0%)顯示I類表型，33個中有0個(0% )顯示II類反應，並且33個中有0個(0% )表現III類反應。圖8C上圖是示出來自MDA231 CMV-fLUC亞克隆的17個反應的等級圖。下表示出對於MDA231 CMV-fLUC池的類別命名；17個中有17個(100. 0% )標記為I類細胞，17個中有0個(0%)表現II類反應，並且17個中有0個(0%)顯示III類表型。圖9顯示應用毒素試驗程序鑑定翻譯反應H印G2細胞並把這些細胞指派到確定的類別。圖9A示出由用CMV-fLUC、mTRplp-fLUC和mTRdm-fLUC表達載體(從左到右)穩定轉化的人肝臟肝細胞癌HepG2細胞池在用TPA單毒素試驗處理之後所產生的fLUC活性的柱狀圖。圖9B上圖是由用mTRdm-fLUC (熒火蟲螢光素酶)表達載體穩定轉化的人肝臟肝細胞癌ifepG2細胞池在用TPA單毒素試驗處理之後所產生的5個TR反應的等級圖。下表示出對於H印G2 mTRdm-fLUC池的類別命名；5個亞克隆中有0個(0%)顯示I類反應，5個亞克隆中有3個(60. 0% )表現II類表型，並且5個反應者中有2個0% )顯示III
類表型。圖9C示出由H印G2 mTRdm-fLUC#16亞克隆所產生的TR反應的15-試驗柱狀圖。 此圖中毒素的組成和濃度如表3中所描述。使用微量酶標儀分析測定fLUC蛋白活性，將其表達為處理樣本與未處理樣本的比率(即，誘導倍數)。在TPA+泰素的二毒素試驗中觀察到fLUC活性的較大增加，這證實TPA+泰素處理是用於產生最大幅度TR特異性翻譯反應的
最佳毒素試驗。圖10示出對確定類別的細胞系應用15-試驗程序。圖IOA示出經歷15-試驗程序的U20S mTRdm-fLUC #40 (淺色柱)和#109 (深色柱)亞克隆的柱狀圖。使用單毒素試驗在圖4中對兩個亞克隆指派II類命名，但使用如實施例中所描述的細胞計數接種程序進行再分析。此圖中毒素的組成和濃度如表3中所描述。兩個亞克隆繼續表現II類反應。應注意，圖10中的Y軸顯示為未處理對照的誘導百分比，而非先前圖中的誘導倍數。可通過用百分比除以100來把誘導百分比變換為誘導倍數(例如，對照的1000%是10倍誘導)。圖IOB示出使用細胞計數接種程序對四個HCT116 mTRdm-fLUC亞克隆進行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗，先前已在圖7中對這些亞克隆指派I類命名。此柱狀圖說明由用TPA+泰素的二毒素試驗處理的HCT116 mTRdm-fLUC 12-15、12_3、7_5和12-16 亞克隆(從左到右)在15-試驗程序中所產生的增強TR反應。HCT116 mTRdm-fLUC 12-15 和12-3亞克隆繼續表達I類表型，而HCT116 mTRdm-fLUC 7_5和12-16亞克隆顯示III類表型。圖IOC示出使用細胞計數接種程序對三個HCT116 mTRplp-fLUC亞克隆進行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗，在圖7B中對這些細胞指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗程序中由HCTl 16 mTRplp-fLUCll-20、3-ll和3-9亞克隆(從左到右)所產生的增強TR反應。HCT116mTRplp-fLUC 11-20亞克隆在TPA+泰素的二毒素試驗中表達II類表型，而HCT116 mTRplp-fLUC 3_11和3_9亞克隆在TPA+泰素的二毒素試驗中表現III類反應。圖IOD示出使用細胞計數接種程序對兩個HCT116 CMV-fLUC亞克隆進行再分析的柱狀圖，使用亞最佳單毒素試驗已在圖7C中對所述兩個亞克隆指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗程序中由HCT116CMV-fLUC 4-1和4_20亞克隆所產生的fLUC活性(從左到右)。在TPA+泰素的二毒素試驗中HCTl 16 CMV-fLUC 4_1亞克隆繼續表達I類表型，而 HCTl 16 CMV-fLUC 4_20亞克隆表現II類反應。圖IOE示出使用細胞計數接種程序對四個MDA231 mTRdm-fLUC亞克隆進行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗，先前在圖8A中對這些細胞指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗方案中由MDA231mTRdm-fLUC 4-23、4_8、4_7和3_1亞克隆(從左到右)所產生的TR反應。在TPA+泰素的二毒素試驗中，MDA231 mTRdm-fLUC 4-23,4-8和4_7亞克隆繼續顯示I類表型，而MDA231 mTRdm-fLUC 3-1亞克隆表現II類反應。圖IOF示出使用細胞計數接種程序對四個MDA231 mTRplp-fLUC亞克隆進行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗，先前在圖8B中對這些細胞指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗程序中由MDA23ImTRplp-fLUC 3_12、5_2、5_13和2_17亞克隆(從左到右) 所產生的TR反應。在TPA+泰素的二毒素試驗中，MDA231 mTRplp-fLUC 3_12、5_2和5-13 亞克隆僅表達I類表型，而MDA231 mTRplp-fLUC 2-17亞克隆表現II類反應。圖IOG示出使用細胞計數接種程序對三個MDA231 CMV-fLUC亞克隆進行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗，先前在圖8C中對這些細胞指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗方案中由MDA231 CMV-fLUC 1-2U2-5和1_20亞克隆(從左到右)所產生的 fLUC活性。雖然MDA231CMV-fLUC 1-21,2-5和1-20亞克隆表現增加的fLUC水平，但每個亞克隆仍表達I類表型。圖11示出用於通過集落形成和亞克隆來恢復確定類別的表型的方案。圖IlA左圖是由從II類MDA231 mTRplp-fLUC 2-17細胞系(用TPA單毒素試驗處理)分離的113個二次亞克隆所產生的等級圖。如實施例中所描述分離亞克隆。等級圖示出TR反應為等級順序(χ軸上從最低到最高)與誘導倍數(y軸)的函數。虛線是如圖 IOF中所示的TPA特異性TR反應。顯著比例的亞克隆顯示相對於親代細胞系的TR反應的增加。雖然大多數亞克隆表現II類TR活性，但仍有一小比例表現III類反應。右圖是使用泰素單毒素試驗對113個MDA231 mTRplp-fLUC 2_17亞克隆的分析。虛線示出來自圖IOF 的泰素特異性TR活性。如上所述，顯著比例的亞克隆顯示II類表型，但一個亞組產生III 類反應。兩個箭頭指示在每個試驗中的最大反應亞克隆是相同細胞系。圖IlB左圖是由從III類HCT116 mTRdm-fLUC 12-16細胞系(用TPA單毒素試驗處理)分離的70個二次亞克隆所產生的等級圖。虛線是如圖IOB中所示的TPA特異性TR 反應。大部分亞克隆顯示III類TR活性，其中一小群表現與親代細胞相比顯著較大的TR 反應。右圖是使用泰素單毒素試驗對相同的70個HCTl 16 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆的分析。虛線示出來自圖IOB的泰素特異性TR活性。所有亞克隆都顯示III類反應，其中一個顯著比例表現與親代細胞系相比增強的TR活性。圖IlC示出從MCF7 mTRplp-fLUC#43細胞系(用泰素單毒素試驗處理)分離的95 個二次亞克隆的等級圖。在圖5B中對MCF7 11^1^1 -江肌#43細胞係指派111類命名。虛線是在15-試驗程序中(未顯示)由親代細胞系所產生的TPA特異性TR反應。一定比例的二次亞克隆清楚地表現大於親代細胞系的III類表型。圖IlD示出從MCF7 mTRdm-fLUC#64細胞系(用泰素單毒素試驗處理)分離的22 個二次亞克隆的等級圖。在圖5A中對MCF7 11^1 (1111-江肌#64細胞系給定111類命名。虛線是在15-試驗方案中(未顯示)由親代細胞系所產生的泰素特異性TR反應。大多數二次亞克隆保留III類表型，並且顯著比例顯示與親代細胞系相比增強的TR活性。圖12示出通過對表達盒中的抗生素抗性標記物進行再選擇來恢復確定類別的表型的結果。圖12A示出先前均被指派III類表型的4個HCT116亞克隆的柱狀圖。HCT116 mTRdm-fLUC 7-2 和 12-16 是初級 HCT116 分離株。HCT116mTRdm-fLUC 亞克隆 #30 和亞克隆#38是從12-16原代細胞系分離的高反應二次亞克隆(圖11B)。淺色柱示出用TPA+泰素的二毒素試驗處理的高傳代細胞系(P10-P20)。深色柱是用G418進行再選擇以去除分離TR 表達質粒的細胞的相同培養物，其也已經用TPA+泰素的二毒素試驗處理過。為進行比較， 利用最右側的柱來示出由70個二次12-16亞克隆(圖11B)產生的平均反應。下表示出在再選擇之後所觀察到的TR特異性活性的高度顯著性增加。圖12B示出由用TPA單毒素試驗處理過的所述細胞系所產生的TR活性的柱狀圖。 下表示出在再選擇過程之後的TR特異性反應的高度顯著性增加。圖13示出通過機械操縱對基礎的非帽依賴性翻譯的調節。圖13A示出由使用匯合(淺色柱)和細胞計數(深色柱)程序接種的未處理 MDA231細胞系所產生的基礎翻譯活性的柱狀圖。把三個MDA231CMV-fLUC細胞系(1_21、
2-5、1-20)與四個mTRplp-fLUC(2-17、3-12、5-2、5-13)和四個 mTRdm-fLUC 細胞系(4-23,
3-1、4-8、4-7)進行比較。將細胞裂解，不用毒素處理進行分析，並把酶標儀值作為相對光單位繪圖。大體上，每種細胞系都顯示，相比於細胞計數方案(其產生分匯合的有絲分裂細胞培養物)，匯合接種程序(其使每平方釐米培養面積的細胞數最大化並導致產生匯合的有絲分裂後細胞培養物)導致顯著更高的基礎fLUC水平。圖1 示出相同未處理細胞的柱狀圖，其中去除了 CMV結果來通過圖解強化TR表達細胞系中的較低值。如前所述，大體趨勢是匯合接種方法把更多細胞引入試驗中並增加了基礎水平的fLUC活性；然而，兩個細胞系(mTRplp-fLUC 5_2和mTRdm-fLUC 4-8)在通過細胞計數程序接種的未處理細胞中表現增強的fLUC活性。圖14示出在標準毒素試驗中所產生的TR特異性報告蛋白活性與TR來源的翻譯蛋白的相關性。圖14A上圖示出由從III類HCT116 mTRdm-fLUC 7-5亞克隆製備的細胞提取物所產生的fLUC活性的15-試驗柱狀圖。下圖示出用來指派III類命名的HCT116 mTRdm-fLUC 7-5細胞系的15-試驗柱狀圖。在每個試驗中檢驗相等數量的細胞。圖14B示出使用抗熒火蟲螢光素酶抗體顯現的上述15-試驗細胞提取物的 Western免疫印跡。在每個凝膠泳道中分析等量的總蛋白質。圖14C示出對Western免疫印跡上的譜帶強度的光密度測定分析的柱狀圖。高譜帶強度處在X光片反應的線性範圍之外並產生與直接細胞測定值相比的較低值。圖15示出TR特異性報告蛋白活性與TR來源的翻譯產物的相關性。圖15A示出重組fLUC蛋白濃度(Sigma)作為相對光單位的函數的劑量反應曲線圖。對於此曲線圖，製備fLUC蛋白的連續稀釋液並使用標準酶標儀程序進行測定。圖15B示出使用15-試驗程序，從III類HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆製備的細胞提取物的表。從每個提取物中取固定細胞數(總細胞數的1/10)並在酶標儀試驗中測定。由每個樣本提取物產生的相對光單位可通過圖解與圖15A中的已知蛋白質濃度進行比較。對於用確定的毒素試驗處理6小時的III類HCT116 mTRdm-fLUC 12-16細胞，使用總細胞數的1/10來確定fLUC蛋白濃度，並變換成定義為光單位/ μ g fLUC蛋白的比活性。圖15C是由用15-試驗程序處理的HCTl 16 mTRdm-fLUC 12-16細胞所產生的蛋白質提取物的Western免疫印跡。譜帶強度(fLUC蛋白水平)與上面計算的蛋白質濃度良好相關。在每個凝膠泳道中分析等量的總蛋白質。
圖 16-25 分別是質粒 pCMV-gLuc、pCMV-fLuc、phTRdm-fLuc、phTRdm-gLuc、 phTRplp-fLuc、phTRplp-gLuc、pmTdm-fLuc、pmTRdm-gLuc、pmTRplp-fLuc 禾口 pmTRplp-gLuc 的示意圖。功能性質粒元件(限制性酶位點、複製起點、開放閱讀框等)按需要用豎線、框和箭頭表示。mDM =鼠 DM20 cDNA ；mP =鼠 PLP cDNA ；mTRd =鼠 TRdm ；mTRp =鼠 TRplp ；hDM =人 DM20 ；hP =APLP ；hTRd =人 TRdm，hTRp =人 TRpIp，fLuc =熒火蟲螢光素酶；gLuc = Gaussia焚光素酶。圖沈是鼠與人PLP/DM20編碼序列和其TR元件的序列比對圖。關鍵詞mDM =鼠 DM20 cDNA;mP =鼠 PLP cDNA ;mTRd =鼠 TRdm[SEQ ID NO 1] ；mTRp =鼠 TRplp [SEQ ID NO: 2] ；hDM=人 DM20 ；hP=人 PLP ；hTRd =人 TRdm [SEQ ID NO 3]和 hTRp =人 TRplp [SEQ ID NO 4]。因為DM20序列省略了全長PLP編碼序列中存在的一部分序列，所以圖沈中DM20 序列的編號是不連續的，並且在省略的區段之後，DM20編號在比對序列的下面顯示為連續的。在參照圖26描述本文的序列時，在一些情況下利用對PLP/DM20核苷酸位置的雙重編碼，例如殘基560/455 ；此用法指在替代者中的PLP和DM20編碼，其中PLP編碼如比對序列上面所示，並且DM20編碼如比對序列下面所示。圖27示出應用毒素試驗程序來在MCF7乳腺癌細胞中區分蛋白激酶C(H(C)激活劑組(屬特異性分子靶)內的毒素特異性影響(種特異性毒素作用)。圖27A示出劑量反應試驗，其中用不同劑量的TPA(劑量範圍InM到500nM)處理 MCF7 CMV-fLuc亞克隆#44和#48的三個重複樣本。在暴露於單毒素TPA試驗6小時之後， 將細胞裂解並使用標準微量酶標儀試驗測定fLuc蛋白活性。對原始值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。兩個細胞系都顯示fLuc蛋白合成隨著TPA濃度增加的線性增加，在IOOnM TPA劑量下達到最大報告蛋白水平。隨後使用此TPA濃度作為圖27B中所示的苔蘚抑制素1和苔蘚抑制素2試驗的對照。圖27B示出劑量反應曲線，其中在單毒素試驗中用IOOnM TPA，或用不同劑量的苔蘚抑制素1 (500pM到500nM的劑量範圍)(上圖)或苔蘚抑制素2 (InM到2. 5uM的劑量範圍)(下圖)處理MCF7 CMV-fLuc亞克隆#44和#48的三個重複樣本。虛線代表由IOOnM TPA單毒素試驗所產生的翻譯反應水平。苔蘚抑制素1的濃度(上圖)涵蓋圖27A中所用的TPA濃度。雖然在IOOnM苔蘚抑制素1試驗中觀察到最大翻譯反應，但報告蛋白活性的幅度從未達到由IOOnM TPA試驗所產生的fLuc活性水平。苔蘚抑制素2劑量反應曲線(下圖)採用更高的藥物濃度(最大測試劑量是TPA和苔蘚抑制素1最大量的5倍)。在最高測試劑量下(2. 5uM)，苔蘚抑制素2產生與用IOOnM TPA所觀察到的水平相一致的fLuc活性。圖27C示出劑量反應曲線，其中用不同劑量的TPA (InM到500nM)處理MCF7 mTRdm-fLuc亞克隆#8、#27和#45的三個重複樣本以定義TR翻譯反應。在用TPA單毒素試驗培養6小時之後，將細胞裂解並使用標準微量酶標儀試驗測定fLuc蛋白活性。對酶標儀值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。所有細胞系都顯示fLuc 蛋白活性隨著TPA濃度增加的線性增加，在IOOnM TPA劑量下達到峰值。使用此TPA濃度作為圖27D中所示的苔蘚抑制素1和苔蘚抑制素2試驗的標準。圖27D示出劑量反應曲線，其中在單毒素試驗中用IOOnM TPA或用不同劑量的苔蘚抑制素1 (500pM到500nM的劑量範圍)(上圖)或苔蘚抑制素2 (InM到2. 5uM的劑量範
20圍)(下圖)處理MCF7 mTRdm-fLuc亞克隆#8、#27和#45的三個重複樣本。和圖27B — 樣，虛線代表在每個細胞系中由IOOnM TPA試驗所達到的翻譯反應水平。苔蘚抑制素1的濃度(上圖)涵蓋圖27C中所示的TPA劑量反應曲線，並且在IOOnM苔蘚抑制素1試驗中表現最大活性。雖然苔蘚抑制素2試驗(下圖)覆蓋甚至更大的濃度範圍，但在相似劑量下，TR特異性表達水平與苔蘚抑制素1沒有顯著差異。苔蘚抑制素1和苔蘚抑制素2試驗中的翻譯反應的幅度從未達到在IOOnMTPA測試中所產生的fLuc活性。在此研究和其它類似工作中，IOOnM TPA、苔蘚抑制素1和苔蘚抑制素2單毒素試驗之間的翻譯差異在非帽依賴性試驗中比圖27B中的帽依賴性試驗中大得多。帽依賴性試驗與非帽依賴性試驗之間的進一步差異是觀察到增加的苔蘚抑制素2濃度(最大TPA劑量的5倍)從未產生與IOOnM TPA試驗相當的fLUC活性。因此，毒素試驗程序可檢測到激活PKC活性的化合物在帽依賴性翻譯與非帽依賴性翻譯之間的統計學顯著差異。圖觀示出使用單毒素與組合毒素試驗來在MCF7乳腺癌細胞中區分拓撲異構酶I 抑制劑屬(喜樹鹼藥物種類)內的毒素特異性翻譯反應。這些結果還提供不具有對蛋白質翻譯有先前已知作用的物質的例子，其選擇性地降低翻譯。圖28A示出用不同劑量(IOnM到IOuM的範圍)的下列拓撲異構酶1抑制劑處理的MCF7 CMV-fLuc亞克隆#65的劑量反應試驗。喜樹鹼、拓撲替康、伊立替康和魯比替康。 在單毒素試驗中孵育6小時之後，將細胞裂解並使用標準微量酶標儀試驗測定fLuc蛋白活性。對酶標儀值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。虛線代表未處理細胞樣本中翻譯反應的水平。喜樹鹼和魯比替康顯示類似的劑量反應，其中fLuc蛋白質表達在 IuM時達到峰值，而在更高劑量下下降到基礎水平。相比之下，拓撲替康和伊立替康在單毒素試驗中都沒有顯著改變帽依賴性翻譯。圖28B示出使用組合試驗來檢驗拓撲異構酶1抑制劑對帽依賴性翻譯的影響。在利用恆定的IOOnM TPA劑量的二毒素試驗中使用不同劑量的拓撲異構酶1抑制劑(IOnM到 IOuM的範圍)對MCF7 CMV-fLuc亞克隆#65進行一系列劑量反應試驗。對酶標儀值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。虛線代表未處理樣本中翻譯反應的水平。按照類似方式，喜樹鹼和魯比替康與TPA協同作用來增加fLUC蛋白活性直到IuM劑量，但在更高濃度下僅表現fLUC活性的最低增加，而伊立替康未產生TPA特異性翻譯反應的任何顯著變化，拓撲替康僅在高劑量(即，5uM和IOuM)顯示TPA抑制作用。圖28C示出使用單毒素試驗來在MCF7細胞中測定拓撲異構酶1抑制劑對非帽依賴性翻譯的影響。用不同濃度(IOnM到IOuM的範圍)的拓撲異構酶1抑制劑(喜樹鹼、魯比替康、伊立替康和拓撲替康)處理MCF7mTRdm-fLuc亞克隆#27的三個重複樣本。對酶標儀值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。虛線代表未處理對照中翻譯反應的水平。四種化合物均在低劑量下(IOnM和IOOnM)刺激非帽依賴性翻譯，但只有喜樹鹼、魯比替康和拓撲替康在較高劑量下(5uM和IOuM)表現降低的fLUC活性。具體來說，在高濃度喜樹鹼和魯比替康試驗中的fLUC活性導致蛋白質水平低於未處理的對照細胞(< 100% )。這些結果與伊立替康在所有測試濃度下都表現恆定量的fLUC活性形成對比。圖28D示出對用IOOnM TPA加不同劑量(IOnM到IOuM的範圍)的拓撲異構酶1 抑制劑處理的MCF7 mTRdm-fLuc亞克隆#27使用二毒素組合試驗。對酶標儀值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。虛線代表未處理樣本中翻譯反應的水平。 四種抑制劑在IOnM 二毒素試驗中均與TPA協同作用來增加蛋白質活性。然而在較高的抑制劑濃度下，喜樹鹼、魯比替康和拓撲替康拮抗TPA活性並表現降低的fLUC表達。對於喜樹鹼和魯比替康，在IOuM 二毒素試驗中的這一拮抗作用導致fLUC蛋白水平低於未處理對照細胞(<100% )。在最高劑量下，拓撲替康表現基礎水平的表達。相比之下，伊立替康二毒素試驗顯示與TPA的協同作用以及在所有測試劑量下增強的fLUC活性。這些結果顯示，除了它們對拓撲異構酶1的已知作用之外，高劑量的這些藥物會抑制蛋白質合成，其中最大幅度的變化發生於毒素刺激的TR表達細胞系中。圖四示出應用單毒素試驗來在HEK293胚腎細胞中區分微管破壞劑藥物種類內的藥物特異性表型。動態細胞骨架結構對於正常細胞功能具有重要性。在微管的情況下，幹擾微管蛋白亞單位蛋白的重塑會通過阻斷細胞周期進程而產生顯著的抗增殖活性。然而， 破壞微管的藥物在微管蛋白結合之後表現顯著的生物學差異。例如，諾考達唑和秋水仙鹼結合不全相同的重疊蛋白序列下的微管，但兩種化合物都阻斷防止聚合和促進解聚的微管組裝位點。長春花生物鹼(諸如長春新鹼與長春花鹼)結合微管蛋白並誘導微管蛋白聚集形成防止微管組裝的不溶性晶體。最後，泰素結合微管並使完整微管穩定，這幹擾了它們在細胞分裂期間的解組裝。圖29A示出使用單毒素試驗來測定微管破壞劑對用不同劑量(5nM到5uM的範圍) 的下列試劑處理的HEK293 CMV-fLuc亞克隆#3的影響諾考達唑、秋水仙鹼、長春新鹼和泰素。在暴露6小時後，將細胞裂解並使用標準微量酶標儀試驗測定fLuc蛋白活性。對酶標儀值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。諾考達唑、秋水仙鹼和長春新鹼在IOOnM與5uM的濃度之間表現報告蛋白活性增加。相比之下，僅在最高泰素劑量下(2. 5uM和5uM)觀察到fLUC表達的顯著變化。圖29B示出用不同濃度(5nM到5uM的範圍)的圖29A中所列微管破壞劑處理的 HEK293 hTRdm-fLuc #53 (上圖)和HEI^93 mTRdm_fLuc#12 (下圖)亞克隆的劑量反應曲線。對酶標儀值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。由人OiTRdm， 上圖)和小鼠(mTRdm，下圖)TR盒產生高度類似的TR表達譜。如同圖29A中的帽依賴性試驗，秋水仙鹼和長春新鹼在大於IOOnM的所有劑量表現增加的報告蛋白活性。相比之下，僅在高於250nM的諾考達唑濃度下才觀察到報告蛋白活性的顯著增加。如同帽依賴性試驗， 僅在2. 5uM和5uM劑量下觀察到泰素特異性報告蛋白增加。儘管秋水仙鹼和長春新鹼在帽依賴性試驗與非帽依賴性試驗中展示了類似的翻譯反應，但諾考達唑產生了獨特的非帽依賴性反應。即使在兩個試驗中都在高泰素劑量下觀察到了顯著的翻譯增加，但這種藥物仍產生所有測試的微管破壞劑藥物中最小的反應譜，這與它的獨特活性相一致。圖30示出人HEK293細胞系對更新的15-試驗方案的TR特異性反應。圖30A示出由HEK293 CMV-fLuc亞克隆#3產生的帽依賴性翻譯反應的15-試驗柱狀圖。這些研究中所用的毒素的組成和濃度如表3中所示。虛線代表未處理樣本中翻譯反應的水平。除了 TPA+拓撲替康(高劑量或HD) 二毒素試驗之外，在所有其它TPA組合試驗中觀察到顯著的帽依賴性fLuc產生。圖30B示出由HEK293 mTRdm-fLuc亞克隆#13產生的TR翻譯反應的15-試驗柱狀圖。使用標準微量酶標儀試驗測定fLUC蛋白活性並表示為處理培養物與未處理培養物的比率(即，誘導倍數)。虛線代表未處理樣本中翻譯反應的水平。除了 TPA+拓撲替康(HD) 的二毒素試驗，在其它所有組合TPA試驗中觀察到TR調節翻譯的高度顯著性增加。圖30C示出由HEK293 hTRdm-gLuc亞克隆#79產生的TR翻譯反應的15-試驗柱狀圖。如前所述，在藥物施用6小時後在條件培養基中測定分泌性Gaussia螢光素酶(gLUC) 活性並將蛋白質活性表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。虛線代表未處理細胞中的翻譯反應。雖然fLuc蛋白是一種經受胞內蛋白降解系統的胞漿蛋白並且gLuc是一種逃脫胞內降解並在細胞外累積的分泌性蛋白，但在圖30B與圖30C中的非帽依賴性表達譜強烈相關並表現與圖30A中帽依賴性試驗類似的差異。在TPA+卡西黴素二毒素試驗中的非帽依賴性反應顯示15-試驗組中的最大翻譯增加，這與在圖30A的帽依賴性試驗中觀察到的最小誘導形成對比。此外，拓撲替康(HD)的抑制作用在所有單毒素與二毒素試驗中是明顯的，其中在TPA+拓撲替康(HD)試驗中觀察到最大變化。圖31顯示使用21-毒素試驗程序來表徵未知或先前未確定的物質對人HEK293胚腎細胞的影響。和在標準15-毒素試驗中一樣，21-試驗配置採用5種毒素的單個和配對組合應用，並加入第六種物質。包括進第六種化合物需要把試驗組擴增到21個單毒素與二毒素試驗的總數。各種毒素的組成和濃度如表3中所描述。在本實施例中，先前未確定的物質是泰素。在此試驗之前，未曾在HEK293細胞中於更新的15-毒素試驗方案中測定組合泰素反應。圖31A示出由HEK293 CMV-fLuc亞克隆#3產生的帽依賴性翻譯反應的21-毒素柱狀圖。在暴露於化合物6小時之後，將細胞裂解並使用標準微量酶標儀試驗測定fLuc蛋白活性。對三個重複的酶標儀值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。虛線代表未處理樣本中翻譯反應的水平。雖然泰素在單毒素試驗中(未知的)對帽依賴性flue蛋白產生具有最小影響，但TPA+泰素的二毒素試驗(TPA+未知的)表現協同相互作用以及此組中最大的翻譯反應。在二毒素試驗中未觀察到其它顯著變化。圖31B示出由表達fLUC報告蛋白的HEK293 hTRdm-fLuc亞克隆#13所產生的TR 特異性翻譯反應的21-毒素柱狀圖。虛線代表由未處理細胞樣本所產生的翻譯反應。在此組中，泰素(未知)在單毒素以及秋水仙鹼+泰素、卡西黴素+泰素、硼替佐米+泰素的二毒素試驗中表現fLUC活性的較小協同增加，但在TPA+泰素或拓撲替康+泰素試驗中沒有。圖31C示出由表達gLUC報告蛋白的HEK293 hTRdm-gLuc亞克隆#79所產生的 21-試驗柱狀圖。在培養6小時之後，使用標準微量酶標儀試驗在條件培養基中測定分泌性 gLuc活性並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。虛線代表未處理樣本中翻譯反應的水平。已知gLuc蛋白被分泌到培養基中，它逃脫了作用於fLUC蛋白的胞漿蛋白周轉過程。因此，表觀TR反應的任何差異可能是報告蛋白合成、分泌或降低的蛋白質周轉方面的差異的結果。然而，儘管在fLuc與gLuc蛋白加工中存在差異，但由HEK293 hTRdm-fLuc 亞克隆#13和HEK293 hTRdm-gLuc亞克隆#79產生的反應譜顯示強相關性。在秋水仙鹼+ 泰素的二毒素試驗中觀察到最顯著的變化，這可能是因兩種微管蛋白結合藥物對微管的組合作用而引起的蛋白質分泌改變的結果。圖32示出使用21-試驗程序來檢測與!fepG2肝細胞癌和HEK293胚腎細胞的抗生素治療相關的任何慢性影響。支原體去除試劑(MRA)或4-氧喹啉-3-羧酸衍生物是普遍應用於培養的哺乳動物細胞以治療支原體汙染的抗生素。MRA表現最低的毒性並且可應用較長的培養時期。本實施例中，在21-試驗程序之前將MRA處理細胞(+MRA)與 150nM MRA 一起孵育7天。雖然把+MRA細胞維持在補充抗生素的培養基中，但將另一 MRA劑量用作未知化合物。未處理的-MRA培養物從未暴露於抗生素。標準毒素的名稱和濃度在表3中給出。圖32Α示出!fepG2細胞中持續MRA暴露的影響，而圖32Β示出HEK 293細胞中MRA的影響。圖32A上圖示出由H印G2 mTRdm-fLuc亞克隆#16產生的TR反應的21-試驗柱狀圖，所述亞克隆#16用 150nM MRA處理7天(淺色柱)或未用 150nM MRA處理(深色柱)。在用標準毒素處理6小時後，將細胞裂解並使用標準微量酶標儀試驗測定fLuc蛋白活性。對酶標儀值求平均並表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導倍數)。下圖示出相同數據組，其中去除了 TPA試驗以突出在其它試驗中觀察到的反應。與單毒素和二毒素 TPA試驗相比而言，抗生素處理的IfepG2細胞表現fLUC活性的最小差異。對於TPA試驗，在每個測試中觀察到顯著的拮抗作用，並在TPA+秋水仙鹼的二毒素試驗中觀察到fLUC表達的極大減少，其中與-MRA細胞相比，+MRA培養物表現fLUC活性約減少到1/2. 5。圖32B示出由HEK293 mTRdm-fLuc亞克隆#45產生的非帽依賴性翻譯反應的 21-試驗柱狀圖，所述亞克隆#45用 150nM MRA處理7天(淺色柱)或未用 150nM MRA 處理(深色柱)。與圖32A中的H印G2細胞相比而言，HEK293細胞的慢性MRA暴露在21-試驗方案中導致fLUC表達的近似均勻降低。然而，如圖32A中一樣，在TPA單毒素與二毒素試驗中觀察到最大幅度降低。這些結果支持以下理論對抗生素氟喹諾酮的長時暴露會以可測定的程度影響TR試驗，具體地說，檢測到了強的拮抗毒素特異性表型，涉及TPA毒素。圖33示出應用毒素試驗程序來鑑定HEK293細胞中與翻譯抑制劑相關的毒素特異性和細胞特異性影響。圖33A示出劑量反應柱狀圖，其中用各種濃度(劑量範圍IOnM到25uM)的下列翻譯抑制劑處理HEK293 CMV-fLUC亞克隆#3 (上圖)、hTRdm-fLUC亞克隆#13 (中圖)和 mTRdm-fLUC亞克隆#45 (下圖)放線菌酮、茴香黴素、嘌呤黴素和吐根鹼。在足夠大的劑量下，這些抑制劑立即停止蛋白質翻譯，並且所得蛋白質周轉使報告蛋白水平降低到未處理細胞水平以下(< 100%對照)。翻譯抑制劑對帽依賴性翻譯(HEK293 CMV-fLUC亞克隆#3數據，上圖)和非帽依賴性翻譯(HEK293 hTRdm-fLUC #13和mTRdm-fLUC #45亞克隆，中圖和下圖)表現一些類似影響。例如，250nM濃度的每種抑制劑足以把蛋白質合成降低到對照細胞水平以下。此外，抑制劑劑量的額外增加(高至25uM，或100X)僅產生報告蛋白活性的最小額外降低。另外，嘌呤黴素需要2. 5uM的濃度來把報告蛋白水平降低到與其它三種抑制劑可比較的水平。與這些相似性形成對比，茴香黴素和吐根鹼在HEK293CMV-fLUC#3 (上圖)與mTRdm_fLUC#45 (下圖)亞克隆中表現明顯不同的活性。在這些細胞中，低劑量的茴香黴素( 25nM)和吐根鹼(IOOnM)足以把報告蛋白水平降低到未處理對照細胞的水平以下。最後，在單毒素25uM 試驗中fLUC蛋白活性下降30-40%表明，fLUC蛋白在HEK293細胞中表現超過6小時的半衰期。圖3!3B示出用IOOnM TPA與各種濃度(劑量範圍IOnM到25uM)的圖33A所列翻譯抑制劑相組合的二毒素試驗處理的HEK293 CMV-fLUC#3 (上圖)、hTRdm_fLUC#13 (中圖) 和mTRdm-fLUC#45 (下圖)亞克隆的劑量反應柱狀圖。對於HEK293 CMV-fLUC #3 (上圖)和mTRdm-fLUC#45(下圖)亞克隆，茴香黴素和吐根鹼在最低測試劑量下(IOnM)拮抗TPA 反應並且與TPA單毒素試驗相比降低報告蛋白水平50-300 %。這與嘌呤黴素形成對比，在三個細胞系中嘌呤黴素都需要250nM的濃度Q5X)來起初把蛋白質合成降低到TPA單毒素試驗水平以下。單毒素結果暗示，嘌呤黴素需要相當高的劑量來把報告蛋白水平降低到與其它三種抑制劑可比較的水平。例如，CMV-fLUC #3亞克隆需要2. 5uM的嘌呤黴素劑量來與其它抑制劑相關聯，這與hTRdm-fLUC #13和mTRdm-fLUC #45亞克隆需要25uM嘌呤黴素濃度(10X增加)形成對比。如圖33A中一樣，在二毒素試驗中於25uM抑制劑濃度下報告蛋白水平下降40%支持fLUC半衰期估計值為約6小時。圖 3!3B 中在HEI^93 hTRdm-fLUC #13 與HEI^93 mTRdm_fLUC#45 亞克隆之間觀察到明顯的細胞特異性差異，而在最高測試劑量下05uM)觀察到另一顯著差異。為突出這一差異，圖33C示出僅在25uM抑制劑劑量下對於HEI^93 hTRdm-fLUC #13和冊以93 mTRdm-fLUC #45亞克隆的單毒素與二毒素試驗的反應柱狀圖。與在兩個試驗中顯示相當的報告蛋白水平的HEK293 hTRdm-fLUC #13亞克隆形成對比，HEK293mTRdm_fLUC #45亞克隆對於在此劑量下的放線菌酮、嘌呤黴素和吐根鹼，所表現的降低很少或沒有低於未處理對照細胞水平。 統計分析(下表)確認在二毒素試驗中兩個亞克隆之間的這一差異的顯著性。因為對於 HEK293 mTRdm-fLUC #45亞克隆的單毒素試驗顯示此細胞系對此劑量下的這三種抑制劑敏感，所以這一結果與暴露於TPA之後在這些細胞中的蛋白質代謝改變相一致。整個附圖中對應的參考字符表示對應的部分。定義術語「基因」指包含對於產生多肽或前體或RNA(例如，tRNA、siRNA、rRNA等)所必需的編碼序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可由全長編碼序列或由編碼序列的任何部分編碼，只要保留全長或片段的所需活性或功能性質(例如，酶活性、配體結合、信號轉導等)即可。本術語還涵蓋結構基因的編碼區和在5'與3'端兩者上與編碼區相鄰的序列， 使得所述基因對應於全長mRNA的長度。位於編碼區的5'端並存在於mRNA上的序列稱為 5'非翻譯序列。位於編碼區的3'端或編碼區下遊並存在於mRNA上的序列稱為3'非翻譯序列。術語「基因」涵蓋基因的cDNA與基因組形式。基因的基因組形式或克隆含有編碼區，其可穿插有稱為「內含子」或「間插區」或「間插序列」的非編碼序列。內含子從細胞核或初級轉錄物去除或「剪接掉」，並因此在信使RNA(mRNA)轉錄物中不存在。mRNA在翻譯期間起作用來指定新生多肽中胺基酸的次序或順序。術語「表達載體」指包含核酸表達盒的病毒和非病毒載體。術語「表達盒」用來定義含有可操作地連接到編碼序列的調節元件的核苷酸序列， 所述調節元件導致編碼序列在細胞中的轉錄與翻譯。「哺乳動物啟動子」指在哺乳動物細胞中起作用或來源於哺乳動物細胞的轉錄啟動子，或二者兼而有之。「哺乳動物最小啟動子」指經由RNA聚合酶結合來正確起始轉錄所必需的『核心』DNA序列，但其在不存在任何可操作地連接的轉錄效應子序列時僅表現象徵性的轉錄活性。用語「開放閱讀框」或「編碼序列」指編碼多肽或蛋白質的核苷酸序列。在真核生物中編碼區在5'側鄰接編碼起始子甲硫氨酸的核苷酸三聯體「ATG」，而在3'側鄰接指定終止密碼子的三個三聯體(即，TAA、TAG和TGA)之一。「可操作地連接」定義為意指使核酸與另一核酸序列處於功能關係。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄則將其可操作地連接到該編碼序列；或者如果核糖體結合位點的定位以便於翻譯則將其可操作地連接到編碼序列。一般來說，「可操作地連接」意指所連接的DNA序列是鄰接的。不過，增強子並不必需是鄰接的。連接是通過在便利的限制性位點處的接合來完成。如果這類位點不存在，那麼根據常規實踐使用合成性的寡核苷酸銜接子或接頭。「重組的」指方法、試劑和實驗室操縱的結果，其中將核酸或其它生物分子用酶學方法、化學方法或生物學方法裂解、合成、組合或以其它方式離體操縱以在細胞或其它生物系統中產生所需產物。術語「重組DNA」指由藉助於分子生物學技術接連在一起的DNA片段構成的DNA分子。「轉染」是用來描述向真核細胞中引入外源物質(諸如外源DNA)的術語。它與「轉化」和「轉導」可交換地使用，但後一術語在它的更狹窄範圍內指通過病毒(充當載體)向細胞中引入DNA的過程。因此，經歷轉染的細胞稱為「轉染的」、「轉化的」或「轉導的」細胞。本文中使用的術語「質粒」指DNA的獨立複製小片。它通常是圓形的和雙鏈的。「報告基因」指可使用本領域技術人員已知的常規技術檢測或測定其表達的任何基因。術語「調節元件」或「效應子元件」指轉錄啟動子、增強子、沉默子或終止子，以及指任何翻譯調節元件、聚腺苷酸化位點等等。可排列調節元件和效應子元件使得它們允許、 增強或便於選擇性產生經它們調節的成熟編碼序列。術語「載體」指外源DNA片段可插入其中的DNA分子。一般來說，它們含有目標調節序列和編碼序列。術語載體包括但不限於質粒、粘粒、噬菌粒、病毒載體和穿梭載體。「穿梭」載體是能夠進行原核複製但不含有真核複製序列的質粒載體。在此複製缺陷型穿梭載體內含有的病毒DNA序列指導在真核宿主細胞內的重組以產生感染性病毒顆粒。本文中使用的術語「物質」指具有明確的化學組成的物質。它在本文中與術語「化合物」可交換地使用。 術語「病毒載體」指含有外源遺傳物質以供遞送到它感染的細胞中的病毒。「複製缺陷型」病毒載體不能夠在「野生型」或以其它方式未操縱的哺乳動物細胞中複製。大量此類病毒的產生要求生產細胞系用輔助病毒共轉染或以其它方式修飾來提供或補充缺失的功能。「複製競爭型」病毒載體是能夠感染細胞並經歷DNA複製、病毒包裝和從被感染細胞釋放的載體。本文中使用的「條件複製型，，病毒載體是設計成在特定細胞類型中選擇性表達使得避免非所需廣譜感染的複製競爭型載體。條件複製可通過在載體中包括可操作地連接到早期病毒基因的組織特異性、腫瘤特異性或細胞類型特異性或其它選擇性誘導的調節性控制序列來實現。術語「應激」和「毒性」用來指代對細胞天然的生物化學和生物物理穩態的幹擾。 然而應激一般導致細胞穩態的恢復，而毒性反應最終導致細胞死亡。
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優選實施方案的描述本發明涉及表現獨特核糖體譜的哺乳動物細胞亞群，這通過不同的翻譯活性來證明。一旦哺乳動物細胞或細胞系用本文中描述的表達盒穩定轉化，就可鑑定出所需的細胞亞群。重要的是，可操縱這些細胞亞群來表現帽依賴性翻譯或非帽依賴性翻譯。因此，在一個實施方案中，本發明是針對用於鑑定所需的哺乳動物細胞亞群的方法。方法包括以下步驟。用至少一種毒素處理哺乳動物細胞亞組以形成毒素處理細胞，哺乳動物細胞用包含以下任一項的核酸表達盒穩定轉化(1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因。測定相比於參照標準所表達的報告蛋白水平的毒素處理細胞中由報告基因編碼的報告蛋白的水平，以鑑定哺乳動物細胞亞組是否表現所需哺乳動物細胞亞群的表型。如果哺乳動物細胞的毒素處理細胞表現所需哺乳動物細胞亞群的表型，那麼從哺乳動物細胞分離至少一個細胞以形成細胞培養物。使細胞培養物生長以形成哺乳動物細胞亞群。任選地，用至少一種毒素處理哺乳動物細胞亞群，並重複測定、分離和生長步驟直到鑑定出所需的哺乳動物細胞亞群。本發明中所採用的翻譯調節(TR)序列(又稱為「TR元件」)是IRES元件，其可通過(a)它的核酸序列文本和(b)調節翻譯的細胞活性(第2006/0173168號美國公布的專利申請，其以引用的方式併入本文)與5' UTR IRES相區別。這兩個特點相結合形成用於可操作地連接到此IRES序列的下遊編碼序列在受脅迫和/或垂死哺乳動物細胞中選擇性翻譯的基礎。因此，本發明涵蓋任何哺乳動物IRES作為TR元件的用途，所述TR元件在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性表達。在一些實施方案中，本發明的IRES元件具有非帽依賴性翻譯活性，其位於哺乳動物蛋白脂質蛋白(PlP)基因的ORF內。在其天然環境中，pip IRES活性存在於含有數個上遊0RF(〃 uORF")的多順反子RNA內，所述數個上遊ORF有效阻斷正常細胞中對內部AUG 密碼子的核糖體掃描。然而，將細胞暴露給毒劑導致核糖體結合和從特異性內部RNA序列的翻譯使得內部胺基酸序列從pip ORF的3'端翻譯(例如，PIRP-M和PIRP-L肽)。在另一實施方案中，TR元件來源於DM20變體。 在一些實施方案中，本發明的TR元件來源於pip基因的外顯子1-7。儘管不受具體理論的束縛，但仍認為外顯子1到4足以基於突變分析數據來編碼功能IRES活性。此外， 認為TR調節系統(其參與應激/死亡特異性翻譯)位於外顯子6和/或7內。在一些實施方案中，TR元件來源於小鼠。與US 2006/0173168中公開的在垂死細胞中表達的IRES元件相比，本發明的來源於PLP/DM20的小鼠來源TR元件在所有以下特點方面有所不同1)核苷酸1(在SEQ ID Nos. 1和2中)由A突變為T以去除髓鞘蛋白脂質蛋白 PLP和DM20 cDNA中指導全長PLP和DM20的合成的野生型AUG起始密碼子以阻止這種合成發生；2)核苷酸4由G突變為A以便在PLP和DM20 cDNA的第二可能閱讀框中產生終止密碼子來阻止其全長合成；3)核苷酸6、7和8分別由C突變為T、由T突變為G和由T突變為A以在PLP和
27DM20 cDNA的第三可能閱讀框中產生終止密碼子來阻止全長PLP和DM20的合成；4)核苷酸17和18分別由G突變為A和由T突變為G以在PLP和DM20 cDNA的主要(第一)開放閱讀框中產生第一終止密碼子來阻止它們的全長合成；5)核苷酸21由T突變為A以便在PLP和DM20 cDNA的主要(第一)開放閱讀框中產生第二終止密碼子來阻止其全長合成；6)核苷酸27由A突變為T以便從PLP和DM20 cDNA的第三可能閱讀框中去除AUG 密碼子從而在不存在野生型AUG密碼子時阻止框外(out-of frame)翻譯起始；和7)從PLP和DM20 cDNA中缺失終止密碼子以減少對下遊開放閱讀框的翻譯的幹擾。如下面所討論，本發明的來源於鼠PLP/DM20的TR元件不=指導PIRP-M或PIRP-L 肽的翻譯。除以上變化之外，也將下列突變引入來自cDNA的DM 20變體的TR元件中1)核苷酸511由A突變為T以便去除DM20變體中指導PIRP-M蛋白合成的第一框內(in-frame)內部AUG起始密碼子來阻止這種合成發生；和2)核苷酸598由A突變為T以去除DM20變體中指導PIRP-L蛋白質合成的第二框內內部AUG起始密碼子以便阻止這種合成發生。類似地，將下列突變弓I入來自cDNA的鼠PLP變體的TR元件中1)核苷酸616由A突變為T以便去除PLP變體中指導PIRP-M蛋白質合成的第一框內內部AUG起始密碼子來阻止這種合成發生；和2)核苷酸703由A突變為T以去除PLP變體中指導PIRP-L蛋白質合成的第二框內內部AUG起始密碼子以便阻止這種合成發生。在優選的實施方案中，TR元件選自人或小鼠TR元件。更優選地，TR元件選自鼠序列 TRdm(SEQ ID NO 1)和 TRplp(SEQ ID NO 2).TRdm核酸序列(SEQ ID NO 1)來源於小鼠蛋白脂質蛋白基因1的DM20剪接變體 cDNA，但在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、511和598處進行了修飾。此外，編碼終止密碼子的最後3個核苷酸被去除。TRplp核酸序列(SEQ ID NO 2)來源於小鼠蛋白脂質蛋白基因1的PLP剪接變體 cDNA，並且它在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、616和703處含有修飾。TRplp與TRdm 的不同之處在於存在核苷酸349-453。編碼終止密碼子的最後3個核苷酸被去除。在一些實施方案中，TR元件來源於人。舉例來說(但不限於)，IRES元件來源於人PLP/DM20序列。更優選地，來自人PLP序列的TR元件具有核酸序列SEQ ID N0:3，而來自人DM20序列的TR元件具有核酸序列SEQ ID NO :4。在一些實施方案中，TR元件包含與參照序列的突變變體相同的核苷酸序列，其中參照序列包含A)對應於圖沈PLP序列的至少核苷酸1-831並且與其具有至少62%序列同一性的PLP核苷酸序列，或B)對應於圖沈DM20序列的至少核苷酸1_726並且與其具有至少62%序列同一性的DM20核苷酸序列；並且參照序列包含C)在圖 26 PLP 核苷酸位置 41_48、50-56、75_81、150-156、200-205、227_244、 251-257和563-570，或在與其對應位置上的多聚嘧啶束(polypyrimidine tract),
D)在圖26 PLP核苷酸位置1-3、616-618、703_705和811-813，或在與其對應位置上的ATG序列，E)在圖 26 PLP 核苷酸位置 130-133、142-145、190-193、220-223 和 305-308，或在與其對應位置上的GNRA序列，和F)在圖沈PLP核苷酸位置503-512，或在與其對應位置上的18S rRNA結合位點； 其中(G)突變變體(1)包含參照序列的突變，所述突變(a)消除 ATG1、ATG616 和 ATG703，和(b)在圖洸PLP核苷酸位置2-4、6-8、16_18和19-21，或在與其對應位置上引入終止密碼子序列；和(2)保留多聚嘧啶束(C)、GNRA序列(E)和18S rRNA結合位點(F)。在一個優選的實施方案中，(A)或(B)的序列同一性為至少或約70%，並且更優選地為至少或約80%。 在另一實施方案中，突變(Gl)通過將每一 ATG轉變為TTG來消除ATG1、ATG616和ATG703。 在一個實施方案中，參照序列是脊椎動物PLP共有核苷酸序列(SEQ ID NO 5)或脊椎動物 DM20共有序列，後者包含從其中缺失核苷酸349-453的所述脊椎動物PLP共有序列。在另一實施方案中，參照序列是哺乳動物PLP共有核苷酸序列(SEQ ID N0:10)或哺乳動物DM20 共有序列，後者包含從其中缺失核苷酸349-453的所述哺乳動物PLP共有序列。在哺乳動物序列中，對核苷酸使用下列標準縮寫m是a或(、！~是3或8、《是3或18是(或g、y
η是a或c或g或t。在某些實例中，可操作地連接到TR序列的序列元件可能干擾由TR表達盒所展示的選擇性翻譯活性或表現次佳的翻譯活性。為減輕所連接ORF對TR活性的任何影響，本發明提供所公開核苷酸序列的密碼子使用變體(codon-usage variant)，其採用不改變所表達多肽的多肽序列(因而不影響其生物活性)的替代密碼子。這些變體是基於遺傳密碼的簡併性，藉此幾種胺基酸由不止一個密碼子三聯體來編碼。一個例子是密碼子CGT、CGG、CGC 和CGA，其均編碼胺基酸精氨酸(R)。因此，一種蛋白質可由精確序列不同但仍編碼具有相同胺基酸序列的多肽的變體核酸序列來編碼。基於密碼子利用/偏好，可對密碼子進行選擇來優化ORF的翻譯效率，而不影響由TR表達盒進行的調節翻譯。定點誘變是一種用於通過改變一個或多個所需位置上的核苷酸序列來產生序列變體的特別有用的方法。定點(或位點特異性)誘變使用包含具有所需突變以及足夠數目的相鄰核苷酸的DNA序列的寡核苷酸序列來提供具有足夠尺寸和複雜度的序列以在所提議突變的兩側上形成穩定雙鏈體。通常，優選的是長約20到25個核苷酸的合成引物，其中在序列中所提議突變的兩側上的約5到10個殘基被改變。適用於定點誘變的典型載體包括所公開的載體，以及任何商業上或學術上可利用的質粒載體。一般來說，通過使適當的 DNA寡核苷酸序列與靶DNA退火併通過本領域中已知的PCR程序擴增靶序列來引入核苷酸取代。本發明涵蓋在編碼序列中使用每個可能的密碼子以用於產生根據本發明使用的所需 ORF序列。可使用定向進化技術來製備具有改進TR功能的序列變體。在定向進化技術中，可從含TR的多核苷酸開始，進行至少一輪核酸突變或核酸剪接或同源重組。突變、剪接和同源重組可按定向或隨機方式進行。例如，可設計一個或多個寡核苷酸用於如上所述的TR元件的定點誘變，或者可使一個或多個隨機產生的寡核苷酸與起始的含TR多核苷酸模板接觸。替代地或此外，可在允許誤差的條件和/或易錯的聚合酶下進行起始模板的PCR擴增以允許引入突變，這種技術稱為「錯誤傾向」PCR(" sloppy" PCR)。類似地，可按定向或隨機方式對一組同源的含TR元件的多核苷酸進行剪接或重組。例如，可使用一種或多種限制性核酸內切酶來隨機地或按預定方式消化同源多核苷酸模板，並接著將所得片段接合在一起。替代地或此外，可在體外或體內，將這組含TR元件的多核苷酸在有助於它們之間的同源重組的條件下合併並處理。特別是，可在數目上組合或擴增對於TR特異性翻譯效率較為重要的調節序列，使得產生含有多個拷貝的序列。對此工作，可採用突變和剪接或重組技術的任何組合。這些技術中的任一項可進行一輪或不止一輪。在一輪或多輪突變、剪接和/或重組之後，接著測試所得的多核苷酸以針對TR活性進行篩選。通常，這可通過將報告分子編碼序列置於已經產生的一個或多個TR變體的可操作控制之下來進行。接著使所得構建體在置於可發生TR翻譯的條件(諸如應激條件) 之下的細胞中表達。所述測試可用來檢測在TR元件功能方面的所需改進。例如，在TR元件翻譯對應激條件的特異性、TR元件激活對細胞應激反應的敏感性(例如，在細胞應激和 /或死亡之前的生物化學變化)或在TR元件激活之後翻譯起始的效率(即，幅度)的方面中任一方面的改進可以是所述試驗的焦點。基於試驗結果，可選擇一個或多個改進的TR元件來使用或進一步開發；在一些實施方案中，選定的改進TR元件核酸可用作另一輪或另外數輪定向進化的一個起始多核苷酸或一組起始多核苷酸。在本文的各個實施方案中，TR元件可包含或可通過PLP/DM20多核苷酸的突變製得，所述突變包含以下鹼基或對應於以下鹼基的鹼基圖沈鼠或人PLP/DM20 DNA序列的約27到約615/510 ；並且這可進一步包含以下鹼基或對應於以下鹼基的鹼基約616/511 到約702/597的鹼基、約703/598到約772/666的鹼基和/或約773/667到約810/705的鹼基。例如，TR元件可包含或可通過PLP/DM20多核苷酸的突變製得，所述突變包含約27 到約810/705的鹼基或對應於鹼基約27到約810/705的鹼基，其中省略或不省略鹼基約 616/511到約702/597，參照圖26編號。在PLP/DM20編碼序列和其TR元件或由其構建的TR元件中，可在對應於參照圖 26陳述的下列PLP/DM20位置的一個或多個位置上進行突變，但對TR元件功能無不利影響，即位置:01、02、03、04到21(包括此片段全部或一部分缺失)、25、26、314、332、560/455、 614/509,622/518到696/591 (包括此片段全部或一部分缺失，其去除外顯子5)、616/511、 703/598、806/701、811/706、817/712、818/713 和 827/722。在各個實施方案中，除前述以外的其它核鹼基在PLP/DM20編碼序列中可為保守的。例如，在各個實施方案中，PLP/DM20 編碼序列的核鹼基序列由此可在對應於PLP核苷酸位置41-48、50-56、75-81、150-156、 200-205,227-244,251-257和563-570的核苷酸位置上包含多聚嘧啶基序。在一些實施方案中，這種序列可進一步在PLP位置270-274、299-303、490-494、578-582、597-601中的一個或多個上包含多聚嘧啶基序；而在一些實施方案中，還在PLP位置626-632、642-648、 669-674、707-712、755-761、767-771和800-804中的一個或多個位置上包含多聚嘧啶基
3序。類似地，在各個實施方案中，PLP/DM20編碼序列的核鹼基序列由此可在對應於 PLP 核苷酸位置 130-133、142-145、190-193、220-223、305-308 的核苷酸位置上包含 GNRA基序；並且在一些實施方案中進一步在635-638上包含GNRA基序；以及在其它實施方案中， 進一步在位置3四-332、343-346和572-575中的一個或多個位置上包含GNRA基序；而又在一些實施方案中，進一步在位置650-653和683-686中的一個或多個位置上包含GNRA基序。然而，如上文所述，可在下列位置進行突變而無不利影響並且在一些情況下具有增強作用:01、04、06、07、08、17、18、21、27。在一些實施方案中，這些突變可為以下中的一個或多個:01t、04a、06t、07g、08a、17a、18g、21a* 27t。可進行突變但對功能無不利影響的其它位置包括在以下PLP位置中的一個或多個位置25、26、314、332、560/455、616/511、 703/598、806/701、811/706、817/712、818/713 和 827/722。在一些實施方案中，這些可為以下中的一個或多個:25g、26c、314g、332g、560/455c、616/511t、703/598t、806/701g、 811/706t、817/712a、818/713a 和 827/722g。此外，可在 PLP 位置 614/509 上插入例如多達或約5個核苷酸，而對功能無不利影響。此外，與位置831/726的融合，例如報告基因或其它靶基因編碼序列與其的框內融合，未表現對TR元件功能的任何不利影響。在另一實施方案中，本發明的TR元件來源於脊椎動物PLP或DM20序列而非人或小鼠。在一些實施方案中，這可以是靈長類、馬、牛、羊、豬、犬、貓、兔、有袋類、鳥類、魚類、兩棲類或爬蟲類動物序列。在各個實施方案中，脊椎動物序列可為天然序列，野生型的或是變異的；在一些實施方案中，脊椎動物序列可為野生型序列。本文中關於PLP/DM20序列所使用的「脊椎動物共有序列」指DNA序列SEQ ID NO :5。「脊椎動物特異性序列」指屬種智人(Homo sapiens)、猩猩(Pongo pygmaeus)、黑 MM (Pan troglodytes) > $^ (Macaca mulatta) >(Macaca fascicularis) > 豬(Sus scrofa)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、負鼠(Monodelphis domestica)、兔(Oryctolagus cuniculus)、牛(Bos taurus)、狗(Canis familiaris) (GalIus gallus)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、壁虎(Gekko japonicus)、非洲爪蟾 (Xenopus laevis)和腔棘魚(Latimeria chalumnae)的PLP或DM20序列。在一些實施方案中，脊椎動物特異性序列可包含或編碼具有以下基因庫編號的胺基酸序列中的任一序列 P60201 (人)、Q5R6E6 (猩猩)、XP_001140782 (黑猩猩)、XP_001088537 (獼猴)、Q8HXW7 (食蟹獼猴)、NP_999139 (豬)、NP_035253 (小鼠)、NP_112252 (大鼠)、ΧΡ_001374483 (負鼠)、P47789 (兔)、CAA08909 (牛)、39025 (狗)、CAA43839 (雞)、P47790 (斑胸草雀)、 AAW79015 (壁虎)、CAA79582 (蛙)或 BAA^2O7 (腔棘魚)。本領域的技術人員通過在http全球資訊網ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez網站上的核苷酸菜單中檢索NCBI基因庫，可容易獲得編碼這些的DNA序列。例如，有用的DNA 序列包括列在以下基因庫登錄號之下的那些序列AJ006976(人)、CR860432(猩猩)、 XM_001140782(黑猩猩)、ΧΜ_001088537 (獼猴)、AB083324 (食蟹獼猴)、NM_213974 (豬)、 NM_011123(小鼠)、NlLO3O99O (大鼠)、XM_001374446(負鼠)、NM_001082328 (兔)、 AJOO99I3 (牛)、X553I7 (狗)、X6166U 雞)、NM_001076703(殘基 113-946，斑胸草雀)、 AY880400 (壁虎)、Z19522 (蛙)和 ABO25938 (腔棘魚)。
本發明的TR元件在受脅迫和/或垂死細胞中表現選擇性翻譯。術語在受脅迫和 /或垂死細胞中「選擇性地翻譯」或「選擇性翻譯」意指在翻譯活性的峰值處，例如在用誘導細胞應激和/或死亡的急性毒劑處理之後的約6到約18小時內，在用本發明的TR表達盒轉化的任何細胞系的95%以上的細胞中觀察到mRNA翻譯活性，以及意指本發明表達盒的第一 ORF的翻譯水平上升到在用所述急性毒劑處理之後由缺乏可操作地連接的TR元件的相同表達盒轉錄和翻譯時同一 ORF表達水平的至少50%。例如，在用濃度為5 μ M的鈣離子載體Α23187處理之後的約9小時內，本發明表達盒內的TR元件在受脅迫和/或垂死細胞中表現選擇性翻譯，其中在用表達盒轉化的ΗΕΚ293細胞系的95%以上的細胞中觀察到 mRNA翻譯，並且表達盒的第一 ORF的翻譯水平是在處理之後由缺乏可操作地連接的TR元件的相同表達盒轉錄和翻譯時同一 ORF的翻譯水平的至少50%。在一些實例中，在用濃度為 5μΜ的鈣離子載體Α23187處理之後的約6到約9小時內，本發明表達盒內的TR元件在受脅迫和/或垂死細胞中表現選擇性翻譯，其中在用表達盒轉化的ΗΕΚ293細胞系的約96%、 97 %、98 %、99 %、99. 5 %或99. 9 %的細胞中觀察到mRNA翻譯，並且表達盒的第一 ORF的翻譯水平是在處理之後由缺乏可操作地連接的TR元件的相同表達盒轉錄和翻譯時同一 ORF 的翻譯水平的約 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或 95%。在本發明的一些實施方案中，TR元件是pip IRES元件，其不指導PIRP-M或PIRP-L 的翻譯。在其它實施方案中，TR元件不是來源於pip IRES。在一些實施方案中，哺乳動物細胞用核酸表達盒穩定轉化，所述核酸表達盒包含組成型啟動子和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因。用這種表達盒轉化允許鑑定出表現不同翻譯譜的所需的哺乳動物細胞亞群。在一個優選的實施方案中，這種細胞亞群表現不同的帽依賴性翻譯譜。可使用在哺乳動物細胞中可操作的任何組成型啟動子。在一些實施方案中，組成型啟動子選自由勞斯肉瘤病毒(RSV)長末端重複 (LTR)啟動子、巨細胞病毒即刻早期基因(CMV)啟動子、猿猴病毒40早期(SV40E)啟動子、 細胞質β-肌動蛋白啟動子、腺病毒主要晚期啟動子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動子組成的群組。在一些優選的實施方案中，組成型啟動子選自由SV40E啟動子、CMV啟動子和細胞質 β-肌動蛋白啟動子組成的群組。在更優選的實施方案中，組成型啟動子是細胞質β-肌動蛋白啟動子。在又一優選實施方案中，組成型啟動子是CMV啟動子。本發明的核酸表達盒在5'到3'方向上具有以下元件編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因。另外，表達盒還可包括以下元件TR元件5'端的至少一個轉錄效應子序列；含有本領域中常見的限制性酶位點的側接TR元件的3'序列；和/或聚腺苷酸化序列。在一些所述實施方案中，本發明的表達盒包含調節基因表達的上遊轉錄效應子序列。在一個實施方案中，轉錄效應子序列是哺乳動物啟動子。此外，轉錄效應子還可包括額外啟動子序列和/或轉錄調節子，諸如增強子和沉默子或其組合。這些轉錄效應子序列可包括已知與細胞組分結合的部分，該細胞組分調節任何可操作地連接的編碼序列的轉錄。 例如，增強子或沉默子序列可包括與已知細胞組分(諸如轉錄調節蛋白)結合的序列。轉錄效應子序列可選自任何適合的核酸，諸如基因組DNA、質粒DNA、病毒DNA、mRNA或cDNA，或任何適合的生物體(例如，病毒、細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物)。基於所利用的轉錄和/或翻譯系統來選擇適當的轉錄效應子序列在本領域的技能範圍之內。任何個別調節序列都可按野生型排列(如按天然基因組的順序存在)或按人工排列來排列在轉錄效應子元件內。例如，經過修飾的增強子或啟動子序列可包括調節序列的重複單元使得來自載體的轉錄活性通過這些變化而修飾。在一個實施方案中，含TR的表達盒中所使用的啟動子選自組成型、組織特異性和腫瘤特異性啟動子。組成型啟動子可選自例如勞斯肉瘤病毒(RSV)長末端重複(LTR)啟動子、巨細胞病毒即刻早期基因(CMV)啟動子、猿猴病毒40早期(SV40E)啟動子、細胞質 β-肌動蛋白啟動子、腺病毒主要晚期啟動子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在一個優選實施方案中，組成型啟動子是CMV啟動子。在另一優選實施方案中，組成型啟動子是SV40E啟動子。組織特異性啟動子可選自例如轉鐵蛋白(TF)、酪氨酸酶(TYR)、白蛋白(ALB)、肌肌酸激酶(CKM)、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)和突觸蛋白I(SYNl)啟動子。在一優選實施方案中，組織特異性啟動子是突觸蛋白I(SYm)啟動子。在另一優選實施方案中，組織特異性啟動子是ALB啟動子。腫瘤特異性啟動子包括但不限於用於血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(即， KDR、E-選擇素或endoglin)、α -甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、erbB2 (v-erb_b2成紅細胞白血病病毒同源癌基因幻、骨鈣素(骨Y-羧基穀氨酸蛋白；BGLAP)、SLP1 (分泌性白細胞蛋白酶抑制劑或抗白細胞蛋白酶1)、低氧反應元件(HRE)、L-plastin(淋巴細胞胞漿蛋白1)和己糖激酶II(HK2)的啟動子。在一個優選實施方案中，腫瘤特異性啟動子是α -甲胎蛋白(AFP)啟動子。在另一優選實施方案中，腫瘤特異性啟動子是SLPl啟動子。在一些實施方案中，分離特異性轉錄效應子元件並且然後可操作地連接到最小啟動子以產生轉錄活性依賴於單一類型或有限類型細胞反應(例如，熱休克反應或金屬調節元件)的表達盒。在附加的實施方案中，表達盒可包含物種特異性轉錄調節序列。這種DNA調節序列可基於表達盒將會插入其中的細胞類型來選擇，並且可從原核或真核細胞(包括但不限於細菌、酵母、植物、昆蟲、哺乳動物細胞)分離或從病毒分離。在此類例子中，將選擇哺乳動物啟動子以在哺乳動物細胞中表達所選的核酸。用於報告蛋白的開放閱讀框序列置於表達盒中TR元件或組成型啟動子的3'端。 用於報告蛋白的核酸序列可為全基因組序列(例如，包括內含子)、合成核酸或編碼報告蛋白的基因的cDNA拷貝。在一個優選實施方案中，報告蛋白的cDNA序列由於通過去除mRNA 剪接位點使基因組複雜度降低而用於本發明的目的。如本文所述，報告基因編碼賦予細胞可檢測的生物化學或可視覺觀察的(例如， 螢光)表型的產物。報告蛋白還可包括融合或雜合多肽，其中另一多肽在所述多肽或其片段的N末端或C末端融合。通過將編碼一種多肽的核酸序列(或其一部分)與編碼另一多肽的核酸序列(或其一部分)一起在框內克隆來產生融合多肽。用於產生融合多肽的技術在本領域是已知的，並且包括接合編碼多肽的編碼序列使得它們是框內的，並且融合多肽的翻譯處在TR盒的控制之下或它的轉錄處在組成型啟動子的控制之下。例如，將pip ORF與增強型綠色螢光蛋白(EGFP) ORF 一起在框內克隆產生融合蛋白，其被用於監測所述融合蛋白在培養細胞中的表達、亞細胞定位和生物效應((Candour S等Gli乂200 40 (3) 300-11 ；Boucher S 等 J Neurosci(2002)22(5) :1772-83)。一種常用類型的報告基因編碼酶或其它生物化學標誌物，其在哺乳動物細胞中表達時引起細胞或細胞環境中的可視變化。這種變化可被直接觀察，可涉及添加被轉化成可檢測產物的適當底物，或者涉及代謝示蹤劑的添加和結合。這些報告基因的例子有編碼 β-半乳糖苷酶(β-gal)的細菌IacZ基因、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、熒火蟲螢光素酶(鞘翅目甲蟲)、海腎螢光素酶(海腎)、GaUSSia螢光素酶、單純皰疹病毒1胸苷激酶(HSVl-TK) 和突變的單純皰疹病毒1胸苷激酶(HSVl-sr39tk)基因。在β-gal的情況下，用滷素衍生化半乳糖孵育表達細胞產生可用組織化學方法或螢光法檢測和定量的著色或螢光產物。 在CAT的情況下，用放射性標記的氯黴素或另一乙醯基供體分子諸如乙醯輔酶A孵育細胞裂解物，並用色譜分析法測定乙醯化的氯黴素產物。其它有用的報告基因編碼天然發螢光的蛋白質，包括綠色螢光蛋白(GFP)、增強型黃色螢光蛋白(EYFP)或單體紅色螢光蛋白 (mRFPl)。如以上可見，示例性報告基因可選自螢光素酶、GFP、EYFP, mRFPl、β -Gal和CAT， 但也可使用本領域中已知的任何其它的報告基因。在一個優選的實施方案中，報告基因是熒火蟲螢光素酶。在另一優選的實施方案中，報告基因是海腎螢光素酶。在又一優選的實施方案中，報告基因是Gaussia螢光素酶。可用於本發明中的另一報告蛋白是G蛋白偶聯受體(GPCR)，它是一種將激素或配體結合轉變為細胞內信號的整合膜蛋白。在所有動物、昆蟲和植物中都發現有GPCR。GPCR 信號轉導在調節多種生理功能(包括光轉導、嗅覺、神經傳遞、血管張力、心輸出量、消化、 疼痛和體液與電解質平衡)中起作用。儘管GPCR參與多種生理功能，但它們共享許多共同的結構特點。它們含有七個膜域，其通過交替的胞內環與胞外環和可變長度的胞內羧基末端尾來橋接。GPCR的羧基末端尾開始於跨膜7之後，並且在許多GPCR中，它在緊接標誌第七個跨膜域的末端的保守NPXXY基序之後開始。羧基末端尾可較長(大約數幾十到幾百個胺基酸)、較短(大約幾十個胺基酸)或幾乎不存在(少於大約十個胺基酸)。它還可含有 (多個)棕櫚醯化的半胱氨酸殘基。任何G蛋白偶聯受體(GPCR)都可用於本發明的方法中，諸如已知的GPCR、未知的或孤兒GPCR，和嵌合的或修飾的GPCR，但優選是對其存在已知配體或針對受體的抗體的 GPCR0可與本發明一起使用的已知GPCR的非限制性列表示出在表1。表1
類型配體數目組織生理機能
權利要求
1.一種用於鑑定所需的哺乳動物細胞亞群的方法，其中所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細胞亞組以形成毒素處理細胞，用包含以下任一項的核酸表達盒穩定轉化所述哺乳動物細胞(1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的 mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從所述TR元件翻譯；或( 組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；測定相比於參照標準所表達的所述報告蛋白水平的所述毒素處理細胞中由所述報告基因編碼的報告蛋白的水平，以鑑定所述哺乳動物細胞亞組是否表現所述所需哺乳動物細胞亞群的表型；如果所述哺乳動物細胞的所述毒素處理細胞表現所述所需哺乳動物細胞亞群的表型， 那麼從所述哺乳動物細胞分離至少一個細胞以形成細胞培養物；使所述細胞培養物生長以形成哺乳動物細胞亞群；和任選地，用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細胞亞群，並重複所述測定、分離和生長步驟直到鑑定出所述所需的哺乳動物細胞亞群。
2.一種用於鑑定哺乳動物細胞翻譯是否對一種物質有抗性或用於測定一種物質是否對哺乳動物細胞有毒性的方法，所述方法包括用包含以下任一項的核酸表達盒穩定轉化所述哺乳動物細胞以形成穩定轉化的細胞 (1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從所述TR元件翻譯；或( 組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；用至少一種毒素處理穩定轉化的哺乳動物細胞的亞組以形成毒素處理細胞；測定相比於參照標準所表達的所述報告蛋白水平的所述毒素處理細胞中由所述報告基因編碼的報告蛋白的水平，以鑑定所述穩定轉化的哺乳動物細胞亞組是否表現所述所需哺乳動物細胞亞群的表型；如果所述哺乳動物細胞的所述毒素處理細胞表現所述所需哺乳動物細胞亞群的表型， 那麼從所述穩定轉化的哺乳動物細胞分離至少一個細胞以形成細胞培養物；使所述細胞培養物生長以形成哺乳動物細胞亞群；任選地，用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細胞亞群，並重複所述測定、分離和生長步驟直到鑑定出所述所需的哺乳動物細胞亞群；使所述所需的哺乳動物細胞亞群與所述物質接觸；和所述所需的哺乳動物細胞亞群與所述物質接觸後，檢測所述報告蛋白的存在或測定所述報告蛋白的水平，其中與未暴露於所述物質的對照哺乳動物細胞相比，所述物質的毒性和哺乳動物細胞翻譯對所述物質的抗性和所述報告蛋白的存在或所述報告蛋白的水平增加相關，並且與未暴露於所述物質的對照哺乳動物細胞相比，所述物質毒性的缺乏和哺乳動物細胞翻譯對所述物質抗性的缺乏和不存在所述報告蛋白或所述報告蛋白的水平降低相關。
3.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述組成型啟動子選自由CMV、PGK和 β-肌動蛋白組成的組。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中在mRNA翻譯活性處於它的峰值時測定所述哺乳動物細胞亞群中所述報告蛋白的水平。
6.根據權利要求5所述的方法，其中在用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細胞後至少6小時時測定所述哺乳動物細胞亞群中所述報告蛋白的水平。
7.根據權利要求6所述的方法，其中在用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細胞後 6小時到約30小時的時間點測定所述哺乳動物細胞亞群中所述報告蛋白的水平。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞亞群是I類細胞，其特徵在於所述報告蛋白的水平大於所述參照標準中所述報告蛋白水平高達500%，所述參照標準是用所述核酸表達盒穩定轉化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細胞。
9.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞亞群是II類細胞， 其特徵在於所述報告蛋白的水平大於所述參照標準中所述報告蛋白水平的500%以上且不超過1，400%，所述參照標準是用所述核酸表達盒穩定轉化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細胞。
10.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞亞群是III類細胞，其特徵在於所述報告蛋白的水平大於所述參照標準中所述報告蛋白水平的1，400%以上且不超過75，000%，所述參照標準是用所述核酸表達盒穩定轉化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細胞。
11.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中用至少兩種毒素的組合來處理所述哺乳動物細胞。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述至少兩種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿蔔素、諾考達唑、長春花鹼、鈣離子載體A23167、秋水仙鹼、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
13.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中用至少三種毒素的組合來處理所述哺乳動物細胞。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述至少三種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿蔔素、諾考達唑、長春花鹼、鈣離子載體A23167、秋水仙鹼、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
15.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中用至少五種毒素的組合來處理所述哺乳動物細胞。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述至少五種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿蔔素、諾考達唑、長春花鹼、鈣離子載體A23167、秋水仙鹼、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是癌細胞或癌幹細胞。
18.根據權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是人原代細胞或鼠原代細胞。
19.根據權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞選自由HEK293、 HT1080、NTERA-2D、HeLa, Caco2、H印G2、HCT116、MDA231、U2 OS、DU145、LNCaP, LoVo, MiaPaCa2、AsPCl、MCF-7、PC3、Capan-2、C0L0201、C0L0205、H4、HuTu80 和 SK-N-MC 組成的組。
20.根據權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是胚胎幹細胞。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述胚胎幹細胞是鼠胚胎幹細胞mES或人胚胎幹細胞hES。
22.根據權利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述報告基因選自由EGFP、GFP、 EYFP、熒火蟲螢光素酶、Gaussia螢光素酶、海腎螢光素酶、LacZ, CAT、TK和TKsr39組成的組。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述報告基因是熒火蟲螢光素酶。
24.根據權利要求1-23中任一項所述的方法，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
25.根據權利要求對所述的方法，其中所述TR元件選自由SEQID N0:1(小鼠pip TR)、SEQ ID NO 2(小鼠 dm TR)、SEQ ID NO :3 (人 pip TR)和 SEQ ID NO :4 (人 dm TR)組成的組。
26.根據權利要求1-25中任一項所述的方法，其中所述毒素選自由cAMP、TPA、紫杉醇、 MG132、毒胡蘿蔔素、諾考達唑、長春花鹼、鈣離子載體A23167、秋水仙鹼、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
27.根據權利要求116中任一項所述的方法，其中所述篩選包括微量酶標儀分析、螢光顯微鏡技術、免疫組織化學、ELISA、光度計、FACS或分光光度計。
28.根據權利要求1-27中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞亞群的分離包括通過亞克隆的單集落分離。
29.一種哺乳動物細胞亞群，其通過根據權利要求1或346中任一項所述的方法所獲得。
30.一種I類哺乳動物細胞，其通過根據權利要求8或11- 中任一項所述的方法所獲得。
31.一種II類哺乳動物細胞，其通過根據權利要求9或11- 中任一項所述的方法所獲得。
32.—種III類哺乳動物細胞，其通過根據權利要求10-28中任一項所述的方法所獲得。
33.一種適用於毒性試驗的試劑盒，其包含通過根據權利要求9或11- 中任一項所述的方法所獲得的II類哺乳動物細胞或其細胞裂解物；和所述試劑盒的使用說明書。
34.一種適用於毒性試驗的試劑盒，其包含通過根據權利要求10-28中任一項所述的方法所獲得的III類哺乳動物細胞或其細胞裂解物；和所述試劑盒的使用說明書。
35.一種用於重組表達目標多肽的方法，所述方法包括向根據權利要求32所述的III類哺乳動物細胞中引入第二核酸表達盒，所述表達盒包含以下任一項(1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從所述TR元件翻譯；或 (2)組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；使表達所述第二核酸表達盒的所述哺乳動物細胞在允許表達所述目標多肽的條件下生長；和純化所述目標多肽。
36.根據權利要求35所述的方法，其中所述組成型啟動子選自由CMV、PGK和β-肌動蛋白組成的組。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
38.根據權利要求35所述的方法，其中兩個表達盒中的所述TR元件是相同的。
39.根據權利要求35所述的方法，其中兩個表達盒中的所述TR元件是不同的。
40.根據權利要求35所述的方法，其中用哺乳動物病毒載體瞬時轉化或感染所述第二表達盒。
41.根據權利要求35所述的方法，其中所述第二表達盒被穩定轉化。
42.根據權利要求35-41中任一項所述的方法，其中所述TR元件選自由SEQID NO=U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 組成的組。
43.根據權利要求35-42中任一項所述的方法，其中使所述哺乳動物細胞生長的所述步驟包括將所述III類哺乳動物細胞暴露於至少一種毒素。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述毒素選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿蔔素、諾考達唑、長春花鹼、鈣離子載體A23167、秋水仙鹼、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
45.根據權利要求35-42中任一項所述的方法，其中使所述哺乳動物細胞生長的所述步驟包括將所述III類哺乳動物細胞暴露於至少兩種毒素的組合。
46.根據權利要求45所述的方法，其中所述至少兩種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿蔔素、諾考達唑、長春花鹼、鈣離子載體A23167、秋水仙鹼、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
47.根據權利要求35-42中任一項所述的方法，其中使所述哺乳動物細胞生長的所述步驟包括在至少五種毒素的組合的存在下培養所述III類哺乳動物細胞。
48.根據權利要求47所述的方法，其中所述至少五種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿蔔素、諾考達唑、長春花鹼、鈣離子載體A23167、秋水仙鹼、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
49.一種用於鑑定在非帽依賴性翻譯的調節中所涉及的蛋白質的方法，所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細胞以形成毒素處理細胞，用包含以下項的核酸表達盒穩定轉化所述哺乳動物細胞編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的 TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從所述TR元件翻譯；從所述毒素處理細胞製備細胞裂解物；分離編碼所述TR元件和可操作地連接到所述TR元件的所述核苷酸序列的mRNA ； 使所述mRNA和來自所述細胞裂解物的蛋白質接觸以形成與所述mRNA結合的蛋白質；和鑑定與所述mRNA結合的所述蛋白質。
50.根據權利要求49所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是通過根據權利要求8所述的方法鑑定的細胞。
51.根據權利要求49所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是通過根據權利要求9所述的方法鑑定的細胞。
52.根據權利要求49所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是通過根據權利要求10所述的方法鑑定的細胞。
53.根據權利要求49-52中任一項所述的方法，其中所述鑑定蛋白質的方法包括 Southernffestern免疫印跡、Western免疫印跡、蛋白質提取、抗體超遷移試驗或微質譜測序。
54.一種用來產生目標多肽的哺乳動物細胞，所述目標多肽通過包括以下步驟的方法獲得向根據權利要求32所述的III類哺乳動物細胞中引入第二核酸表達盒，所述表達盒包含以下任一項(1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從所述TR元件翻譯；或 (2)組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；和使表達所述第二核酸表達盒的所述哺乳動物細胞在允許表達所述目標多肽的條件下生長。
55.根據權利要求M所述的哺乳動物細胞，其中所述組成型啟動子選自由CMV、PGK和 β-肌動蛋白組成的組。
56.根據權利要求55所述的哺乳動物細胞，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
57.根據權利要求Μ-56中任一項所述的哺乳動物細胞，其中所述報告基因是熒火蟲螢光素酶。
58.根據權利要求Μ-57中任一項所述的哺乳動物細胞，其中兩個表達盒中的所述TR 元件是相同的。
59.根據權利要求Μ-57中任一項所述的哺乳動物細胞，其中兩個表達盒中的所述TR 元件是不同的。
60.根據權利要求Μ-59中任一項所述的哺乳動物細胞，其中所述第二表達盒被瞬時轉化。
61.根據權利要求Μ-59中任一項所述的哺乳動物細胞，其中所述第二表達盒被瞬時轉化。
62.根據權利要求Μ-61中任一項所述的哺乳動物細胞，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
63.根據權利要求62所述的哺乳動物細胞，其中所述TR元件選自由SEQID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 組成的組。
64.一種用於驗證I類、II類或III類哺乳動物細胞保留它們的表型的方法，所述方法包括用至少一種毒素處理根據權利要求四-32中任一項所述的哺乳動物細胞的亞組； 測定相比於參照標準所表達的所述報告蛋白水平的所述哺乳動物細胞亞組中由所述報告基因編碼的報告蛋白的水平；驗證所述哺乳動物細胞保留它們的表型，其中所述I類細胞的特徵在於所述報告蛋白的表達大於未曾用所述毒素處理的所述哺乳動物細胞中所述報告蛋白表達高達500%，所述II類細胞的特徵在於所述報告蛋白的表達大於未曾用所述毒素處理的所述哺乳動物細胞中所述報告蛋白表達的500%以上到1400%，並且所述III類細胞的特徵在於所述報告蛋白的表達大於未曾用所述毒素處理的所述哺乳動物細胞中所述報告蛋白表達的1400% 以上到約75000% ο
65.一種用於測定一種物質抑制哺乳動物細胞中蛋白質翻譯的能力的方法，其中所述方法包括使根據權利要求30-32中任一項所述的哺乳動物細胞與所述物質接觸；和測定相比於未曾用所述物質處理的所述細胞所產生的所述報告蛋白表達的與所述物質接觸後由所述哺乳動物細胞所產生的所述報告蛋白的表達，其中由所述物質處理細胞所產生的所述報告蛋白的表達相比於未曾用所述物質處理的所述細胞所產生的所述報告蛋白表達的減少表明所述物質抑制蛋白質翻譯。
66.一種用於測定一種物質抑制哺乳動物細胞中蛋白質翻譯的能力的方法，其中所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細胞亞組以形成毒素處理細胞，用包含以下任一項的核酸表達盒穩定轉化所述哺乳動物細胞(1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的 mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從所述TR元件翻譯；或( 組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；測定相比於參照標準所表達的所述報告蛋白水平的所述毒素處理細胞中由所述報告基因編碼的報告蛋白的水平，以鑑定所述哺乳動物細胞亞組是否表現所述所需哺乳動物細胞亞群的表型；如果所述哺乳動物細胞的所述毒素處理細胞表現所述所需哺乳動物細胞亞群的表型， 那麼從所述哺乳動物細胞分離至少一個細胞以形成細胞培養物；使所述細胞培養物生長以形成哺乳動物細胞亞群；和任選地，用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細胞的亞群，並重複所述測定、分離和生長步驟直到鑑定出所述所需的哺乳動物細胞亞群；使所述所需的哺乳動物細胞亞群與所述物質接觸；和測定相比於未曾用所述物質處理的所述細胞所產生的所述報告蛋白表達的與所述物質接觸後由所述所需的哺乳動物細胞亞群所產生的所述報告蛋白的表達，其中由所述物質處理細胞所產生的所述報告蛋白的表達相比於未曾用所述物質處理的所述細胞所產生的所述報告蛋白表達的減少表明所述物質抑制蛋白質翻譯。
67.根據權利要求65-66中任一項所述的方法，其中用包含以下項的核酸表達盒穩定轉化的所述哺乳動物細胞被用來測定所述物質抑制非帽依賴性翻譯的能力編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從所述TR元件翻譯。
68.根據權利要求65-66中任一項所述的方法，其中用包含以下項的核酸表達盒穩定轉化的所述哺乳動物細胞被用來測定所述物質抑制帽依賴性翻譯的能力組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因。
69.根據權利要求65、66或68中任一項所述的方法，其中所述組成型啟動子選自由 CMV、PGK和β -肌動蛋白組成的組。
70.根據權利要求69所述的方法，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
71.一種用於恢復所需哺乳動物細胞亞群的表型的方法，其中所述方法包括培養所述哺乳動物細胞的至少一個亞組以形成培養細胞，其中用核酸表達盒穩定轉化所述哺乳動物細胞，該表達盒包含選擇標記的核苷酸序列和以下任一項(1)編碼在受脅迫和/或垂死細胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報告基因並從所述TR元件翻譯；或( 組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報告基因；用所述選擇標記對其提供抗性的物質處理所述培養細胞，使得不再含有所述核酸表達盒的所述培養細胞死亡；使所述處理細胞生長以形成哺乳動物細胞亞群；和任選地重複所述培養、處理和生長步驟，直到恢復所述所需哺乳動物細胞亞群的所述表型。
72.根據權利要求71所述的方法，其中所述選擇標記選自由新黴素、氨苄青黴素、卡那黴素、四環素、氯黴素、潮黴素B、滅瘟素和G418組成的組。
73.根據權利要求71-72中任一項所述的方法，其中所述組成型啟動子選自由CMV、PGK 和β-肌動蛋白組成的組。
74.根據權利要求73所述的方法，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
75.根據權利要求71-74中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞亞群是I類細胞，其特徵在於所述報告蛋白的水平大於參照標準中所述報告蛋白水平高達500%，所述參照標準是用所述核酸表達盒穩定轉化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細胞。
76.根據權利要求71-74中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞亞群是II類細胞，其特徵在於所述報告蛋白的水平大於參照標準中所述報告蛋白水平的500%以上且不超過1，400%，所述參照標準是用所述核酸表達盒穩定轉化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細胞。
77.根據權利要求71-74中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞亞群是III類細胞，其特徵在於所述報告蛋白的水平大於參照標準中所述報告蛋白水平的1，400%且不超過75000%，所述參照標準是用所述核酸表達盒穩定轉化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細胞。
78.根據權利要求71-77中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是癌細胞或癌幹細胞。
79.根據權利要求71-77中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是人原代細胞或鼠原代細胞。
80.根據權利要求71-77中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞選自由ΗΕΚ293、 ΗΤ1080、NTERA-2D、HeLa, Caco2、H印G2、HCT116、MDA231、U2 OS、DU145、LNCaP, LoVo, MiaPaCa2、AsPCl、MCF-7、PC3、Capan-2、C0L0201、C0L0205、H4、HuTu80 和 SK-N-MC 組成的組。
81.根據權利要求71-77中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是胚胎幹細胞。
82.根據權利要求81所述的方法，其中所述胚胎幹細胞是鼠胚胎幹細胞mES或人胚胎幹細胞hES。
83.根據權利要求71-82中任一項所述的方法，其中所述報告基因選自由EGFP、GFP、 EYFP、熒火蟲螢光素酶、Gaussia螢光素酶、海腎螢光素酶、LacZ, CAT、TK和TKsr39組成的組。
84.根據權利要求83所述的方法，其中所述報告基因是熒火蟲螢光素酶。
85.根據權利要求71-73和75-84中任一項所述的方法，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
86.根據權利要求85所述的方法，其中所述TR元件選自由SEQID N0:1(小鼠pip TR)、SEQ ID NO 2(小鼠 dm TR)、SEQ ID NO :3 (人 pip TR)和 SEQ ID NO :4 (人 dm TR)組成的組。
全文摘要
本發明大體上涉及具有獨特核糖體翻譯譜，即翻譯活性的哺乳動物細胞亞群。本發明進一步涉及用於鑑定和分離這些細胞的方法、包含這些細胞的試劑盒，或利用這些哺乳動物細胞亞群的不同翻譯活性的方法。
文檔編號C12N15/63GK102395685SQ201080016414
公開日2012年3月28日 申請日期2010年2月18日 優先權日2009年2月18日
發明者L·卡洛克, M·齊普赫爾 申請人:韋恩州立大學