一種重組表達葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其應用的製作方法

2023-04-27 15:01:06 1

一種重組表達葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組表達葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其應用，屬於生物【技術領域】。本發明通過構建重組質粒pINA1297-GOD，醋酸鋰轉化法轉化解脂耶氏酵母po1h，篩選獲得了具有較好產酶能力的重組菌株。該菌株在以蔗糖為唯一碳源，發酵168h後，葡萄糖氧化酶酶活力達到13.9U/ml，與原黑麴黴相比，提高了兩倍。
【專利說明】-種重組表達葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重組表達葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其應用，屬於生物技術 領域。

【背景技術】
[0002] 葡萄糖氧化酶佑Iucose Oxidase,簡稱G0D，E. C. 1. 1. 3. 4)是一種黃素糖蛋白，在 有氧條件下能專一性地催化目-D-葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氨。GOD廣泛分布於動植物 和微生物體內。由於微生物生長繁殖快、來源廣，是生產GOD的主要來源，主要生產菌株為 黑麴黴和青黴。目前GOD的應用領域不斷拓展，國內外市場需求量急劇增加。目前GOD的 應用領域不斷拓展，國內外市場需求量急劇增加。目前GOD基因已經在畢赤酵母GS115、大 腸桿菌、瑞氏木黴等中得到表達，但還未見其在非常規酵母解脂耶氏酵母中進行表達研究， 而解脂耶氏酵母被認為是安全的，因此，能用於食品和藥物生產上。
[000引解脂耶氏酵母化Id菌系中，編碼能水解其它蛋白質的AEP基因被剔除，使得外源 蛋白能更好地表達。人們將化Id系改造，生成一系列的派生菌系，如化化、Polg、化If。 Po化、化Ig在化Id系基礎上進行改造，只有一個營養缺陷型基因。化Ig被改造為適合W 地R322為基礎的質粒整合的菌系，化化將穿梭質粒的細菌部分在整合入酵母前剔除掉，形 成酵母框。它們均在化Id系的基礎上均被剔除了酸性蛋白酶基因，消除了全部蛋白酶活 性。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一株能夠高產葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母重組菌株，是W PINA1297為載體表達編碼葡萄糖氧化酶的基因。
[0005] 所述葡萄糖氧化酶基因來源黑麴黴Aspergillus niger CCTCC NO ;M2011291，其 核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 所述解脂耶氏酵母重組菌是W解脂耶氏酵母化比為出發菌株。
[0007] 本發明要解決的第二個技術問題是提供一種構建所述解脂耶氏酵母重組菌株的 方法，主要包括W下步驟；（1)構建重組表達載體PINA1297-G0D ; (2)醋酸裡法轉化解脂耶 氏酵母POlh ; (3)重組菌株的篩選；（4)重組菌株的驗證。
[0008] 本發明要解決的第H個技術問題是提供一種應用所述解脂耶氏酵母重組菌株發 酵產葡萄糖氧化酶的方法，是將重組菌接種到種子液體培養基YTO中，培養2化後W 10 %的 接種量轉接至發酵培養基PPB中，於28C、200r/min搖床中培養16她。
[0009] 本發明所得解脂耶氏酵母重組菌可利用藏糖等廉價的作碳源，適合高密度發酵。 且解脂耶氏酵母被認為是安全的，適用於食品、SCP等的工業化生產。此外，解脂耶氏酵母表 達體系選用營養缺陷型作為重組菌的篩選標記，也避免了抗生素危險人體健康的風險。因 而利用該酵母可構建食品安全級產葡萄糖氧化酶菌株。

【具體實施方式】
[0010] 主要試劑；蛋白腺和酵母粉購自OXIOD公司；E. COli感受態試劑盒、Primer star DNA聚合酶、膠回收試劑盒、DNA連接酶、限制性內切酶、DNA突變試劑盒均購自TaKaRa公司 (大連）；質粒提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；酵母基因組提取試劑盒購自天 根生化科技（北京）有限公司；SDS-PAGE試劑盒和蛋白質標準分子量購於碧雲天生物技術 研究所（南通）；其他試劑均為國產分析純。
[0011] 所需培養基；Yro培養基（g/L);葡萄糖20;蛋白腺20;酵母粉10。YNB培養基 (g/L);葡萄糖20 ;YNB1. 7 ;硫酸饋5。PPB培養基（g/L);藏糖20 ;酵母提取物1. 32 ;氯化 饋1. 32 ;磯酸二氨鍾0. 32 ;無水硫酸鎮0. 132 ;維生素B13. 34X10-4 ;溶於巧樣酸鹽緩衝液 P冊.0中。固體培養基在此基礎上添加2 %瓊脂粉。
[0012] Y. Iipolytica種子培養條件：從-8(TC保藏的工程菌甘油管點至YTO固體培養基， 28C培養過夜，用接種針挑取單菌落接種於用250mL H角瓶裝有25mL的Yro液體培養基 中，於28°C培養18?2化，轉速為200巧m。
[0013] Y. Iipolytica發酵培養條件：採用PPB培養基，培養基用250血H角瓶裝液25血， 接種量為10%，於28C培養，轉速為200巧m，培養至發酵結束。
[0014] 酶活測定方法：
[0015] 酶活力單位定義：在30°C, P冊.0的條件下，Imin從1 Ji mol的目-D-葡萄糖氧化 成D-葡萄糖酸和&化所需的酶量為一個葡萄糖氧化酶酶活力單位，W U/mL表示。
[0016] 試管中加入2. 5血鄰聯茵香胺溶液，0. 3血的18%葡萄糖，0. 1血的lOOU/ml辣根 過氧化物酶，30°C保溫2min後，向試管中加入稀釋好的酶液樣品0. ImU反應3min後，加入 2mol/L硫酸終止反應。取出試管，測0D500的吸光值，W熱失活的酶液做空白對照。
[0017] 結果表示與計算：
[001 引 X = [ A A今（7. 5XtX0. 1)] XSXn
[0019] 式中：
[0020] A A- 500nm 吸光值
[002U t-測定時間，min
[0022] 0.1-樣品體積，ml
[002引 5-終反應體積，ml
[0024] 7. 5-消光係數
[00幼 n-稀釋倍數
[0026] 實施例 1 質粒 PINA1297-G0D，PINA1296-G0D 的構建。
[0027] 分別W pINA1297、pINA1296作為合成葡萄糖氧化酶外源基因的表達載體。
[002引通過PCR用引物Al和A2從黑麴黴Aspergillus niger基因組獲得基因內Sfil 位點突變的葡萄糖氧化酶基因片段，轉化大腸桿菌JM109。通過PCR用引物Bl和B2從大 腸桿菌JM109基因組克隆得到帶有Sfi I和BamH I酶切位點的葡萄糖氧化酶基因片段。 PCR產物和表達載體分別用相應的限制性內切酶酶切W後，連接轉化，篩選得到重組質粒 PINA1297-G0D。通過PCR用引物Cl和C2從大腸桿菌JM109基因組克隆得到帶有化ndIII 和化nl酶切位點的葡萄糖氧化酶基因片段。PCR產物和表達載體分別用相應的限制性內切 酶酶切W後，連接轉化，篩選得到重組質粒PINA1296-G0D。
[0029] 實施例2葡萄糖氧化酶生產菌的構建。
[0030] 將Not I線性化的重組質粒pINA1297-G0D、pINA1296-G0D用醋酸裡轉化法導入解 脂耶氏酵母中。
[0031] 由於質粒pINA1296( W地R322為基礎的單拷貝整合質粒）和質粒pINA1297(含 zeta位點的多拷貝整合質粒）的不同選擇性標記及整合機制，將經NotI線性化的重 組表達載體 PINA1297-G0D 和 PINA1296-G0D 分別轉化至 Y. Lipolytica Polh (化a-) 菌株和Y. Lipolytica化lg(Leu-，含地R322整合平臺）中，利用缺陷型的YNB平 板進行陽性轉化子的篩選，經菌落PCR驗證，成功篩選出陽性單菌落，得到重組菌 Y. lipol5Ttica(pINA1297-GOD)及 Y. lipol5Ttica(pINA1296-GOD)。經 NotI 線性化之後， PINA1297-G0D含細菌部分的Kan抗性基因已被去除。
[0032] 實施例3重組菌株搖瓶發酵生產葡萄糖氧化酶。
[0033] 重組菌在YTO平板上活化培養一定階段，接種到種子液體培養基YPD中，2化後W 10%的接種量轉接至發酵培養基PPB中，於28C、200r/min搖床中培養，測定發酵上清液的 葡萄糖氧化酶活力。比較不同轉化子的發酵液酶活力，Y. lip〇lytica(pINA1297-G0D)培養 16她後的發酵液上清葡萄糖氧化酶活力達到13. 9U/ml，是Y. lipol5Ttica(pINA1296-GOD) 的9倍。與原黑麴黴產酶能力4.抓/ml相比，提高了兩倍。
[0034] 雖然本發明已W較佳實施例公開如上，但其並非用W限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範 圍應該W權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1. 一株能夠高產葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母重組菌，其特徵在於，是以解脂耶氏酵 母Polh為宿主，以PINA1297為載體表達編碼葡萄糖氧化酶的基因。
2. 根據權利要求1所述的重組菌，其特徵在於，所述葡萄糖氧化酶基因來源黑麴黴 Aspergillus niger CCTCC NO ：M2011291〇
3. 根據權利要求1所述的重組菌，其特徵在於，所述葡萄糖氧化酶基因的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
4. 一種構建權利要求1所述解脂耶氏酵母重組菌的方法，其特徵在於，主要包括以下 步驟：（1)構建重組表達載體PINA1297-G0D ; (2)醋酸鋰法轉化解脂耶氏酵母Polh ; (3)篩 選驗證重組菌株。
5. 權利要求1所述解脂耶氏酵母重組菌在葡萄糖氧化酶生產中的應用方法。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，是將重組菌接種到種子液體培養基YPD 中，培養24h後以10%的接種量轉接至發酵培養基PPB中，於28°C、200r/min搖床中培養 168h。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述YH)培養基按g/L計含有：葡萄糖20 ; 蛋白腖20;酵母粉10。
8. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述PPB培養基按g/L計含有：蔗糖20， 酵母提取物1. 32,氯化銨1. 32,磷酸二氫鉀0. 32,無水硫酸鎂0. 132,維生素& 3. 34 X 10_4 ; 溶於pH 6. 0的檸檬酸鹽緩衝液中。
【文檔編號】C12R1/645GK104357343SQ201410653076
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】陳堅, 劉曉筱, 張娟, 堵國成, 顧磊 申請人:江南大學