淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26及其微生物製劑和應用的製作方法

2023-04-27 12:10:06 1

淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26及其微生物製劑和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26及其微生物製劑和應用。本發明將淡紫擬青黴菌株20-7、山東（Sd）菌株搭載「神舟」8號飛船進行航天誘變，以未搭載的原始菌株為對照，比較航天搭載菌株在表形、色素變化、生長速度、產孢量和致病力等方面的變異性，以篩選獲得生長性能有所改善以及對根結線蟲卵的致病能力有顯著提高的突變株。本發明對航天搭載菌株通過生長速度、產孢量和致病力的篩選發現，山東菌株航天誘變菌株Sd-m-26在生長特性和致病力方面發生了較大幅度的正向變異，特別是在對根結線蟲卵的致病力上比原始菌株有了非常顯著的提升，在根結線蟲的生物防治上具有重要的應用潛力。
【專利說明】淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26及其微生物製劑和應用【技術領域】
[0001]本發明涉及淡紫擬青黴(Paecilomyces Iilacinus)航天誘變突變株,尤其涉及淡紫擬青黴山東株航天誘變突變株Sd-m-26及其微生物製劑，本發明進一步涉及該突變株在生物防治根結線蟲中的應用，屬於淡紫擬青黴突變株的篩選及其應用領域。
【背景技術】
[0002]航天誘變育種(Space Mutation Breeding),又叫空間誘變育種，就是將航天技術與傳統的物理、化學誘變及分子技術等相結合的新育種技術，利用衛星搭載微生物等生物體樣品，經特殊的空間環境條件(微重力、強宇宙射線、高真空、微重力等)的作用，引起生物體的染色體畸變，進而導致生物體遺傳變異，經地面選育試驗後，能快速而有效地育成生物新品種(系)，供生產和研究使用(張玲華，田興山.微生物空間誘變育種的研究進展[J].核農學報，2004，18 (4):294~296)。因此法能引起大幅度的生理變異和遺傳變異，所以成為高效率育種的新途徑。已有研究表明，一些農作物和微生物經過航天誘變，正向突變率和變異幅度大大高於常規誘變(宋滿剛，張滿貴，繆美鎖，紅曉祥，梁虹，羅寶君，.我國太空育種成果顯著[J].種子世界，2004，7:57)。
[0003]太空環境具有較好的誘變作用，可以產生改善菌種的有利性狀、創造新品種等有益變異，還可發誘發與產量有關的數量性狀變異，但很多變異具有一定的隨機性。搭載微生物的主要目的就是通過設計最佳方案篩選那些產量高、價值大的變異生產菌株，而為了選擇得到性狀穩定的新品種或品系，需要進行大量繁重的篩選和檢測試驗(張世成，林作楫，楊會民，賴菁茹.航天誘變條件下小麥若干性狀的變異[J].空間科學學報，1996，增刊:103~107 ;邊銀丙，翁曼麗，孫勇，王斌，趙培新，閔家順.香菇菌絲太空誘變效應研究I太空環境對香菇菌絲生長特性的影響[J].食用菌學報，1999，6 (4):11~14)。
[0004]淡紫擬青黴(Paecilomyces Iilacinus)是許多重要農作物病蟲的生防菌,能在土壤中習居並宿存，能夠寄生控制多種植物根結線蟲，還是多種非土棲害蟲如荔枝蝽蟓、稻黑蝽、稻葉蟬等的天敵。其能夠產生幾丁質酶和絲氨酸蛋白酶，並通過這兩種酶的作用破壞根結線蟲卵殼，從而菌絲侵入根結線蟲的卵並寄生於卵內，因此淡紫擬青黴菌株被認為是最具有應用前景的線蟲生防真菌(Khan A, Willianms K L, and Nevalainen H K M.Effectof Paecilomyces lilacius protease and chitinase on the eggshell structuresand hatching of Meloidogyne javanica juveniles[J].Biological Control，2004，3:346-352)。
[0005]現有的淡紫擬青黴菌株在生長速度、產孢量等生長性能以及對根結線蟲卵的致病力上都亟待提高，將淡紫擬青黴菌株通過航天誘變篩選得到在生產性能或對根結線蟲卵的致病力上有顯著提高的突變菌株，對於根結線蟲的生物防治將具有重要的應用價值。

【發明內容】
[0006]本發明的主要目的是將淡紫擬青黴(Paecilomyces lilacinus)進行航天誘變獲得一株對根結線蟲卵的致病能力有顯著提高的突變株；
[0007]本發明的另一目的是將所獲得的突變株應用於根結線蟲的生物防治。
[0008]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0009]—株對根結線蟲卵的致病能力有顯著提高的淡紫擬青黴(Paecilomyceslilacinus)山東航天誘變突變株Sd-m-26，其微生物保藏號是:CGMCCN0.7770 ;分類命名:淡紫擬青黴Paecilomyces lilacinus ;保藏時間是:2013年6月20日;保藏單位是:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0010]本發明將淡紫擬青黴菌株20-7、山東(Sd)菌株各分為兩份，一份為原始菌株，留在地面常規保存用作對照(CK);另一份搭載「神舟」8號飛船進行航天誘變，航天搭載菌株返回地面後，以未搭載的原始菌株為對照，比較航天搭載菌株在表形、色素變化、生長速度、產孢量和致病力等方面的變異性，以篩選獲得對根結線蟲卵的致病能力有顯著提高的突變株。
[0011]本發明將航天搭載菌株通過5-6代繼代培養得到性狀穩定菌株後，觀察航天誘變對菌落形態和色素變化的影響，觀察發現，經航天誘變的20-7淡紫擬青黴菌株篩選得到的19個突變菌株，變異類型較多，且各菌株均出現比原始菌株明顯的輪紋，但產孢均比原始菌株少，與輪紋越明顯產孢越多的文獻中的結論不一致(王明祖.根結線蟲卵寄生真菌的研究I1.淡紫擬青黴菌生長和產孢條件[J].華中農業大學學報，1992，11 (I):52-56)。菌落出現不同程度的隆起，大致可分為三種類型:中心隆起，隆起或扁平。中心隆起和隆起菌株顏色均比原始菌株淺；扁平菌株顏色也比原始菌株淺，只有極少數菌株顏色加深呈紫色。菌落背後顏色一般呈炒米黃色，與原始菌株差異不大。
[0012]在山東(Sd)突變菌株中，菌落有明顯的形態分化，可將它們分為4種類型:1型菌落為性狀變化最大的一種，菌落正面為極淺淡紫色，接近白色，菌落背部色素初生長時為墨綠色，9d後由墨綠色變為黑-棕紅-白色的由深及淺的特徵，菌落直徑均比原始菌株小，即生長速度較原始菌株慢，其中Sd-m-30生長速度最慢，培養15d的菌落直徑僅5.85cm, I型菌落共8株，佔山東航天突變體菌落數的26.7%，其中Sd-m-3菌株邊緣不呈圓形而是呈現出類似花朵狀邊緣；另外兩種色素較原始菌株深，其中一種菌落中部為白色凸起外圍呈淡紫色，菌落輪紋明顯，為II型，共7株，佔山東航天突變體菌落數的23.3% ;另一種菌落平展，中部無凸起並出現輻射狀分支，為III型，共5株佔航天單孢菌落數的16.7%。其它菌落的大小均與原始菌株相近，其中12株菌株與原始菌株形態相似，為IV型，佔山東航天突變體菌落數的40%。
[0013]本發明採用顯微鏡觀察航天誘變對菌絲及孢子形態的影響，觀察結果發現山東突變體I型菌落均出現菌絲纏繞形成的環狀菌絲結構，環狀結構的成因還不明確，有待於進一步的實驗研究。II型、III型和IV型菌株有輪狀分枝的分生孢子梗，分生孢子多數稍呈稜形，少數近橢圓形或圓形，單細胞，無色，表面光滑，形態與原始菌株基本無差異。20-7突變體菌株的菌絲及孢子形態基本無變化。
[0014]本發明還觀察了航天誘變對菌株的生長速度以及菌絲乾重的影響，以篩選出生長速度比原始菌株有加快的突變菌株。觀察結果發現，與原始菌株相比，淡紫擬青黴20-7航天誘變菌落生長速度無明顯加快的菌株；山東(Sd)突變菌株生長速度與山東(Sd)原始菌株相比，出現了正負雙向變異，變異幅度較大，說明航天誘變可使山東菌株的生長速度產生不同趨向和不同幅度的變異。培養15d後菌落直徑大於或等於原始菌株的菌株佔突變菌株的26.7%，小於原始菌株的佔73.3% ;其中，生長速度最快的菌株為Sd-m-26，培養15d後菌落直徑為8.46cm,生長速度最慢的為菌株Sd-m-30，培養15d後菌落直徑僅為5.85cm。
[0015]淡紫擬青黴菌株20-7和山東(Sd)菌株的突變體菌株培養過程菌絲乾重總體均變化幅度較大，培養4d的航天突變菌株菌絲乾重均在0.3g以下。在20-7突變菌株中，除H20-7-1菌絲乾重為0.2592g，比20_7原始菌株的0.2555g重外，其它突變體均輕於原始菌株。山東突變體菌株菌絲乾重最重的Sd-m-26為0.2751g ;總體上看，20_7和山東兩種菌株負變異率均大於正變異率。
[0016]本發明進一步的觀察了航天誘變對菌株產孢量的影響，觀察結果發現，20-7原始菌株經航天誘變後，篩選得到的19株菌株中產孢量均少於原始菌株，其中產孢量最小的H20-7-4隻有0.24X 107cfu/mL,說明航天誘變使菌落的產孢量較難在菌株本身產孢量較高的基礎上更優而產生正向變異，而是更趨向於產生負向變異並且負向變異的幅度較大。相對於20-7菌株，山東菌株本身產孢量要小於20-7菌株，而經航天誘變後的菌株出現了不同趨向、不同幅度的變異。正向變異的幅度比較小，負向變異幅度較大。從觀察結果可見，山東航天誘變突變株Sd-m-26的產孢量相比於原始菌株有了非常顯著的提升。 [0017]為了篩選出對根結線蟲卵的致病能力有顯著提高的突變株，本發明對20-7、山東(Sd)菌株的航天搭載株進行了根結線蟲卵的致病力測定，測定結果發現，20-7的各航天誘變菌株都保持了對根結線蟲卵的致病能力，但未見致病力提高的菌株，H20-7-16寄生率最低為4.0%。山東試驗菌株中，大部分航天誘變菌株保持了原始菌株的致病水平，寄生率提高菌株佔突變菌株的46.7%。其中菌株Sd-m-26致病力顯著提高，其致病力達到了 94.0%，比原始菌株的致病力提高了 14.3%。寄生率最低的突變菌株為Sd-m-17，僅為16.3%。
[0018]生長速度、產孢量和致病力是篩選生物防治菌株的重要指標，航天誘變使這些特性表現出不同變異趨向和幅度，證明了航天誘變是非定點的、廣泛性的、正負雙向性的，且誘變位點多、誘變率高，所導致的生物體變異有生理性變異也可能有遺傳性變異(農向群，張澤華，胡攀，高松，張禮生.航天誘變對昆蟲病原真菌的生物學效應[J].菌物學報，2006，25(4):674~681)。兩株原始菌株相比，20_7無論是產孢量、生長速率還是致病力等方面均優於山東(sd)菌株，經航天誘變後，20-7菌株只在生長速度、菌絲乾重上出現了少量正向變異，產孢量、致病力等均無正向變異出現，而山東菌株出現了正負雙向變異，說明在誘變率高低與出發菌株本身性狀的優劣密切相關。
[0019]通過生長速度、產孢量和致病力的篩選發現，山東菌株航天誘變菌株Sd-m-26在生長特性和致病力方面發生了較大幅度的正向變異，尤其是在致病力上相比於原始菌株有了非常顯著的提升。本發明進一步將山東菌株航天誘變菌株Sd-m-26按照常規的微生物菌劑製備成可溼性粉劑，同時按照同樣的方法將山東原始菌株製備成可溼性粉劑，比較了二者對根結線蟲的生防效果；從實驗結果可見，用淡紫擬青黴山東航天誘變突變株Sd-m-26製備的可溼性粉劑對根結線蟲的相對防治效果高出對照菌劑(用淡紫擬青黴山東原始菌株製備的可溼性粉劑)32.66%，幼蟲減少百分率高出對照菌劑32.1% ;實驗結果表明，淡紫擬青黴山東航天誘變突變株Sd-m-26對於根結線蟲的生物防治效果要遠遠優於原始菌株對於根結線蟲的生物防治效果。
[0020]本發明提供了一種防治根結線蟲的淡紫擬青黴微微生物製劑，包括:淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26的孢子粉或發酵液和載體。
[0021]作為參考，本領域技術人員可參考下述方法製備得到淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26孢子粉:(1)製備淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26發酵液；(2)從淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26發酵液中回收孢子產物；(3)乾燥所回收的淡紫擬青黴孢子產物，即得淡紫擬青黴粉。
[0022]本領域所屬技術人員可按照文獻中所公開的各種方法製備得到淡紫擬青黴發酵液；例如，採用三級培養方法，即:種子培養、二級液體擴大培養和液體發酵培養，製備得到淡紫擬青黴菌航天誘變突變株Sd-m-26發酵液；其中，在液體發酵培養時，可以採用發酵罐發酵或採用搖瓶培養的方式進行發酵培養；三級培養所用到的培養基及其培養條件均已在文獻中公開，作為參考，其中，所述的液體發酵培養基的組成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限於葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性澱粉或玉米粉中的任一種或多種。所述的氮源包括但不限於硝酸鈉、硫酸銨、蛋白腖或黃豆粉中的任一種或多種。
[0023]本發明進一步提供一種製備防治根結線蟲的淡紫擬青黴微生物製劑的方法，該方法包括以下步驟:將淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26的孢子粉或發酵液和載體混合在一起，攪拌均勻，粉碎過篩，製備得到相應的微生物製劑，例如，可以是顆粒製劑、粉劑、可溼性粉劑或微膠囊菌劑等。 [0024]其中，所述的載體可以是硅藻土、高嶺土、木屑、活性碳、草炭、農作物秸杆、乾燥的農家肥等；此外，本發明的淡紫擬青黴微生物製劑中還可加入輔料或/和助劑；所述的輔料可以是蟹殼粉或幾丁質等；所述的助劑可以是潤溼劑、分散劑或穩定劑等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1航天誘變20-7菌落形態變異菌株與20-7原始菌株。
[0026]圖2航天誘變山東菌株形態變異4種類型與山東原始菌株及花朵狀邊緣Sd-m-3菌株。
[0027]圖3航天誘變山東突變體I型菌落的環狀菌絲結構。
【具體實施方式】
[0028]通過下列實施例將更具體說明本發明的實施方式，但是應理解所述實施例僅是範例性的，不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護範圍。
[0029]實施例1淡紫擬青黴可溼性粉劑的製備
[0030]—、淡紫擬青黴(P.lilacinus)航天誘變突變株Sd-m-26孢子粉的製備
[0031](一)、淡紫擬青黴發酵液的製備
[0032]1、將淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26菌種活化後，進行搖瓶種子培養；
[0033]搖瓶種子培養培養基的組成(按質量百分比計):
[0034]
【權利要求】
1.一株淡紫擬青黴(Paecilomyces Iilacinus)山東航天誘變突變株Sd-m_26,其特徵在於，其微生物保藏號是=CGMCC N0.7770。
2.權利要求1所述的淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26在防治植物害蟲中的應用。
3.按照權利要求2所述的應用，其特徵在於:所述的植物害蟲是線蟲。
4.按照權利要求3所述的應用，其特徵在於:所述的線蟲是根結線蟲。
5.一種防治植物害蟲的微生物製劑，其特徵在於，包括:權利要求1所述的淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26的孢子粉或發酵液以及載體。
6.按照權利要求5所述的微生物製劑，其特徵在於:所述的載體是硅藻土、高嶺土、木屑、活性碳、草炭、農作物秸杆或乾燥的農家肥。
7.按照權利要求5所述的微生物製劑，其特徵在於:還含有輔料或助劑。
8.按照權利要求7所述的微生物製劑，其特徵在於:所述的輔料是蟹殼粉或幾丁質；所述的助劑是潤溼劑、分散劑或穩定劑。
9.一種製備權利要求5-8任何一項所述微生物製劑的方法，包括以下步驟:將淡紫擬青黴航天誘變突變株Sd-m-26的孢子粉或發酵液和載體混合在一起，攪拌均勻，粉碎過篩，得到相應的微生物製劑。
10.按照權利要求5所述的微生物 製劑，其特徵在於:所述的植物害蟲是根結線蟲。
【文檔編號】A01P5/00GK103602595SQ201310538360
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】汪來發, 王源, 樸春根, 王曦茁, 馬建偉 申請人:中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所