一種脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體及其應用的製作方法

2023-04-27 03:41:06 3

本發明涉及免疫學領域與疫苗學領域，具體地，涉及一種抗脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體及產生該抗體的雜交瘤細胞株以及抗體的應用。

背景技術：

脊髓灰質炎是由脊髓灰質炎病毒引起的嚴重危害兒童健康的急性傳染病，該病毒為嗜神經病毒，主要侵犯中樞神經系統的運動神經細胞，以脊髓前角運動神經元損害為主。患者多為1～6歲兒童，主要症狀是發熱，全身不適，嚴重時肢體疼痛，發生分布不規則和輕重不等的遲緩性癱瘓，俗稱小兒麻痺症。脊髓灰質炎臨床表現多種多樣，包括程度很輕的非特異性病變，無菌性腦膜炎(非癱瘓性脊髓灰質炎)和各種肌群的弛緩性無力(癱瘓性脊髓灰質炎)。脊髓灰質炎患者，由於脊髓前角運動神經元受損，與之有關的肌肉失去了神經的調節作用而發生萎縮，同時皮下脂肪、肌腱及骨骼也萎縮，使整個機體變細。

已知脊髓灰質炎病毒有3個血清型，這3個血清型病毒的核苷酸數目為7500個左右。雖然有71％左右的核苷酸為3個型別脊髓灰質炎病毒所共有，但不相同的核苷酸序列卻都位於編碼區內，因此3個型別病毒間中和試驗無交叉反應。用抗原抗體結合試驗可查出病毒有兩種抗原，一種稱為D(緻密)抗原，另一種稱為C(無核心)抗原。前者存在於成熟的、有感染性的病毒顆粒中，是該病毒的中和抗原，具有型特異性。C抗原存在於經過56℃滅活、或者未成熟的空心病毒顆粒中，是一種耐熱的抗原成份。D抗原與C抗原均可與病毒的抗血清均呈抗原抗體結合陽性反應。D抗原相對C抗原的一個優勢是其含量可以很好地反映免疫原性效力。

口服脊灰減毒活疫苗推廣後，全球消滅脊灰行動取得了令人矚目的成績。但是實現全球消滅脊灰的目標尚存在許多障礙和挑戰。2008年在奈及利亞脊灰死灰復燃後，蔓延到鄰近的8個國家。而在1995～1996年及1999年，我國雲南和青海省發生了分別由緬甸和印度輸入的脊灰野毒株病例，經當地疾病預防控制部門採取緊急措施後，才未發生二代病例。

自50年代中期以來，一直採用Salk滅活疫苗及Sabin減毒活疫苗，免疫效果良好，極大地降低了脊髓灰質炎的發病率。Salk疫苗由3個型別病毒經甲醛滅活後混合製成，肌肉注射，可誘導機體產生中和抗體。其優點是便於保存及運輸，無減毒株返祖現象，且副作用較少。Sabin疫苗是用減毒變異株製成，採用口服，方法簡便，不但可使機體產生抗體，還能刺激腸壁漿細胞產生分泌型IgA，對野毒株有消滅作用，從而切斷其在人群中的傳播，因而Sabin疫苗的免疫效果更好。

目前國際上正廣泛使用的3價疫苗為採用減毒的Sabin株經過滅活、純化後配製而成的注射劑型疫苗，該疫苗不僅免疫保護效果好，而且避免了毒力返祖的危險。Sabin株脊髓灰質炎病毒是WHO推薦使用的安全毒株，可用於疫苗的研究和臨床檢測。

脊髓灰質炎病毒抗體是指動物或人體抗脊髓灰質炎各型別病毒產生的IgG、IgM等類型抗體的總稱，廣泛應用於脊髓灰質炎病毒鑑定、脊髓灰質炎疫苗以及各型別抗原的定性和定量檢測中。

由於目前脊髓灰質炎Ⅰ型病毒抗原檢測普遍採用的多克隆抗體包被——多克隆抗體夾心的檢測體系，該體系不僅對於Ⅱ、Ⅲ型存在較大的交叉反應，而且不能很好的區分D抗原和C抗原，尤其在用於3個型別混合疫苗Sabin IPVⅠ型抗原檢測時，由於交叉反應導致檢測結果不能真實反應Ⅰ型抗原的含量以及疫苗Ⅰ型的免疫原性，同時WHO也推薦採用多克隆抗體與單克隆抗體匹配的方式檢測三價脊灰疫苗中的各型抗原含量；目前國際上尚缺乏Sabin IPV D抗原檢測的標準化的試劑，製備特異性好，具有中和活性的單克隆抗體，可為Sabin IPV體外效力檢測方法的標準化奠定基礎。

因此，有必要製備一種型特異的脊髓灰質炎Ⅰ型單克隆抗體，用於Ⅰ型脊灰抗原、抗體的檢測與病毒的鑑別。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種脊髓灰質炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體，用於脊髓灰質炎Ⅰ型病毒抗原含量或抗體含量的檢測。本發明的另一目的在於提供上述單克隆抗體的應用。

因此，在第一方面，本發明首先提供一種分泌Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株JⅠ-112，該細胞株於2016年5月11日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，簡稱CGMCC，郵編100101)保藏，分類命名為脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCC No.12292。

在第二方面，本發明提供了第一方面的分泌Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株JⅠ-112即保藏編號為CGMCC No.12292的雜交瘤細胞在製備用於診斷脊髓灰質炎的診斷劑中的應用。

在第三方面，本發明提供了第一方面的分泌Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株JⅠ-112即保藏編號為CGMCC No.12292的雜交瘤細胞在製備用於預防或治療脊髓灰質炎的藥物中的應用。

在第四方面，本發明還提供了脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體，該抗體採用小鼠骨髓瘤細胞雜交瘤技術製備。

在一個實施方案中，所述製備可以包括以下步驟：將經脊髓灰質炎Ⅰ型病毒原液免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，分離出能夠分泌脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞，將該雜交瘤細胞接種小鼠腹腔，由此製備含有特異性脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體的腹水。

在一個進一步的實施方案中，所述小鼠經純化滅活的Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒原液免疫，所述純化滅活的Sabin株Ⅰ型脊髓灰質炎病毒液的製備方法為例如以下示例的方法：取Ⅰ型病毒製備的工作種子批毒種按MOI＝10～0.05接種Vero細胞或其他原代、傳代細胞，接種病毒時細胞的濃度為0.1-10×106細胞/ml，病毒培養後收穫細胞上清，即為Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒收穫液，濃縮(例如通過超濾膜包)10倍以上後，進行分子篩層析和離子交換層析以及甲醛滅活後即得純化滅活的Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒原液。

在一個具體實施方案中，所述脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體由第一方面的分泌Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株JⅠ-112即保藏編號為CGMCC No.12292雜交瘤細胞株分泌獲得。

在一個實施方案中，所述脊髓灰質炎I型病毒單克隆抗體不進行任何標記。

在另一個實施方案中，所述脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體經生物標記或化學標記。優選地，所述脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體經酶標記。優選地，所述的酶為辣根過氧化物酶(HRP)或鹼性磷酸酶(AP)。

在第五方面，本發明提供了第四方面的單克隆抗體在製備用於檢測脊髓灰質炎Ⅰ型病毒抗原的檢測劑中的應用。

在第六方面，本發明提供了第四方面的單克隆抗體在製備用於檢測脊髓灰質炎Ⅰ型病毒抗體的檢測劑中的應用。

在製備用於檢測脊髓灰質炎Ⅰ型病毒抗原或抗體的檢測劑的過程中，上述第四方面的單克隆抗體在不進行生物標記或化學標記時，可以通過添加經生物標記或化學標記(例如諸如辣根過氧化物酶(HRP)或鹼性磷酸酶(AP)的酶標記)的第二抗體來進行，即以一個物種的抗脊髓灰質炎病毒抗體作為包被抗體，以本發明的單克隆抗體為捕獲抗體，以上述經生物標記或化學標記的第二抗體作為檢測抗體，用於檢測或製備檢測試劑。

在第七方面，本發明提供了一種用於檢測脊髓灰質炎Ⅰ型病毒抗原的試劑盒，含有第四方面的單克隆抗體。

在第八方面，本發明提供了一種用於檢測脊髓灰質炎Ⅰ型病毒抗體的試劑盒，含有第四方面的單克隆抗體。

本發明提供了一種可以用於生產脊髓灰質炎治療性抗體的改造的細胞株，以及包含於細胞株的保護性抗體的基因信息。

本發明提供的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體具有如下一個或多個或全部的有益效果：

1、本發明的單克隆抗體具有較高的效價即反應性，間接法效價可達105以上。

2、本發明的單克隆抗體具有較好的中和病毒的能力，對於脊髓灰質炎Ⅰ型病毒的中和效價大於1：16384。

3、本發明的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體可以特異性地區分脊髓灰質炎Ⅰ型病毒與Ⅱ、Ⅲ型病毒，不與後者反應，是能夠與脊髓灰質炎Ⅰ型病毒特異性結合的單克隆抗體。

4、本發明的單克隆抗體與A肝病毒、腸道病毒71型病毒、柯薩奇A16病毒等均無交叉反應，有較好的病毒特異性。

5、本發明提供了一種技術構思全新的技術方案，即第四方面的單克隆抗體。

6、本發明的單克隆抗體基本上僅與作為可產生中和抗體的抗原D抗原反應，因此可以作為反映疫苗保護效果的有效工具。

7、除了與Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒發生特異性反應之外，本發明的單克隆抗體還可以與目前在國內外市售的由野毒株Mahoney株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒製備的脊髓灰質炎滅活疫苗發生反應，因此具有相當的廣譜性，可以廣泛應用。

8、本發明的單克隆抗體可廣泛應用於脊髓灰質炎Ⅰ型病毒的檢測、鑑別、篩查與對疫苗生產的抗原檢測以及流行病調查中；同時檢測的是Ⅰ型特異性抗原，可以更加有效地反映混合疫苗的Ⅰ型抗原含量，對疫苗的工藝研究與生產以及疫苗產品的質量控制和質量研究具有重要意義。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；實施例中所用的試劑為市售商品。

實施例1免疫原製備與動物免疫

(1)取Vero細胞工作細胞庫復甦後於36.5±0.5℃培養，至細胞濃度為0.1-10×106細胞/ml時，接種病毒。

(2)取Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒製備的工作種子批毒種按MOI＝5～0.1接種Vero細胞，置32.5±0.5℃培養。

(3)病毒培養2～4天,收穫細胞上清，即為Sabin株脊髓灰質炎病毒Ⅰ型病毒收穫液。

(4)Ⅰ型病毒收穫液澄清後用超濾膜包濃縮10倍以上。

(5)然後進行分子篩層析和離子交換層析，監測波長為280nm，分別收集洗脫液和流穿液，即得純化液，甲醛滅活後即得純化滅活的Sabin株脊髓灰質炎I型病毒原液。

(6)將純化滅活的Sabin株脊髓灰質炎I型病毒原液與弗氏佐劑(首次免疫為弗氏完全佐劑，後期免疫為弗氏不完全佐劑)等體積混合乳化後於第0、14、28天背部皮下多點免疫BALB/c小鼠，0.2ml/只。

(7)於第39天以純化滅活的Sabin株脊髓灰質炎I型病毒原液靜脈注射小鼠，3天後取小鼠脾臟，進行細胞融合。

實施例2細胞融合及建株

(1)細胞融合前復甦培養SP2/0細胞株，融合前3天擴大培養，融合前1天去除RPMI 1640細胞培養液(Gibco)，重新添加培養液，準備SP2/0細胞。

(2)處死免疫小鼠，按常規方法製備小鼠脾細胞懸液。

(3)根據脾細胞與SP2/0細胞計數結果分別加入適量不完全IMDM培養液(Gibco)，SP2/0細胞晃動混勻，脾細胞用移液管吹打均勻。然後將脾細胞與SP2/0細胞按1:2～10:1混合於50ml離心管中，混勻。

(4)加不完全IMDM培養液至50ml，離心5-10分鐘，倒淨上清。輕擊融合管底，使沉澱細胞鬆散均勻，離心管置37℃水浴，準備融合。

(5)將37℃預熱的50％的PEG4000 1ml用滴管緩慢滴入混合細胞管，邊滴邊轉動離心管，使細胞保存在混勻狀態。

(6)靜置90秒後立即緩慢加入15ml無血清的IMDM培養基(Gibco)(37℃)，然後離心5-10分鐘，棄去上清。

(7)加入IMDM完全培養液(Gibco)，混勻，將混懸液分別加至96孔細胞培養板中，100μl/孔，於37℃、5％CO2培養箱內培養。

(8)第2天向細胞板加HAT培養液(IMDM含1*HAT(Sigma))100μl/孔。

(9)每2-3天換一次HAT培養液，觀察是否出現雜交瘤，兩周後換為HT培養基(IMDM含1*HT(Sigma))，觀察融合細胞生長狀況。

(10)細胞融合後第七天開始觀察雜交瘤細胞的生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清進行抗體ELISA檢測。將陽性孔細胞轉入24孔板擴大培養，及時做亞克隆。

(11)經3次亞克隆得到能夠穩定分泌抗體的28個細胞系，綜合抗體效價和特異性(測試方法見下文)兩個指標，我們選擇其中一個最好的細胞系，將其命名為JⅠ-112，凍存該細胞。將雜交瘤細胞株進行保藏，保藏編號為CGMCC No.12292，分類命名為：脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏時間：2016年5月11日；保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。

實施例3單克隆抗體細胞株腹水製備及抗體ELISA法效價檢測

按常規方法將凍存的實施例2獲得的雜交瘤細胞進行復甦，培養，待細胞覆蓋25ml的細胞培養瓶瓶底50％以上時即可按照常規方法腹腔接種BALB/c小鼠，定期收集腹水JⅠ-112。

將純化滅活的Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒採用0.01M PBS 1:200稀釋，100μl/孔包被酶標板，2-8℃過夜，然後100μl/孔加入1:102起始10倍梯度稀釋的陰性對照和JⅠ-112單克隆抗體腹水，37℃反應1小時，100μl/孔加入1:4000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠二抗，37℃反應1小時後洗板、顯色、終止，讀取OD450nm，由此檢測本發明雜交瘤細胞分泌的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒腹水JⅠ-112的間接ELISA法抗體效價，抗體效價達105以上，效價較高。結果見表1。

表1抗體間接ELISA法效價檢測結果

實施例4單克隆抗體細胞株腹水中和抗體效價檢測

將JⅠ-112單克隆抗體腹水、陰性和陽性血清對照進行2倍梯度稀釋，然後50μl/孔加入細胞板，各稀釋度平行添加2孔，然後每孔加入100CCID50/0.05ml的Ⅰ型脊灰病毒，35.0±0.5℃培養箱孵育後加入100μl/孔0.2-1.6×105的Vero細胞懸液，繼續培養5～7天判定結果，檢測本發明雜交瘤細胞分泌的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒腹水JⅠ-112的中和抗體效價。中和抗體效價達1：16384以上，效價較高。

實施例5抗體型特異性檢測結果

將純化滅活的Sabin株脊髓灰質炎Ⅱ型和Ⅲ型病毒原液採用0.01M PBS 1:10稀釋，100μl/孔包被酶標板，2-8℃過夜，檢測實施例3獲得的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體腹水JⅠ-112的抗體效價，同時設置陰性與陽性對照，均為陰性。結果見表2。

表2間接ELISA法抗體型特異性檢測結果

本發明中陽性對照具有較好的反應性，陰性對照無反應，試驗成立。JⅠ-112細胞株分泌的單克隆抗體(JⅠ-112)不與脊髓灰質炎Ⅱ型和Ⅲ型病毒反應，說明本發明的單克隆抗體能夠區分開脊髓灰質炎病毒Ⅰ型與Ⅱ型、Ⅲ型病毒。本發明的JⅠ-112雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體在用於脊髓灰質炎疫苗(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒混合的樣品)的抗原含量檢測時可以特異地識別脊髓灰質炎Ⅰ型抗原，而不被其他兩型幹擾，具有較好的型特異性和應用價值。

實施例6抗體對D抗原反應特異性的檢測結果

將Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型實心病毒(D抗原)、空心病毒(C抗原)、D抗原56℃加熱30min後病毒(熱處理C抗原)均用0.01M PBS 1:200倍稀釋後100μl/孔包被酶標板，2-8℃過夜；將本發明中的細胞株分泌的單克隆抗體(JⅠ-112)以1:102起始10倍梯度稀釋後100μl/孔加入酶標板，同時做陰性對照。其後試驗步驟與實施例3相同，檢測本發明雜交瘤細胞分泌的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒腹水JⅠ-112對上述抗原的效價及特異性，結果見表3。

表3抗體對D抗原反應特異性檢測結果

結果可見，脊髓灰質炎Ⅰ型病毒腹水JⅠ-112僅對Ⅰ型實心病毒具有較強的反應性，效價大約105，對於空心病毒以及熱處理病毒均不反應。文獻顯示，僅實心病毒(D抗原)可以產生針對脊灰Ⅰ型病毒的保護性抗體。本試驗表明，該單抗僅能檢測有效抗原即D抗原，對於無效抗原無反應性，具有較好的有效抗原的識別能力，可以將它用於有效抗原表位與含量的檢測，意義重大。

實施例7抗體亞類測定

將純化滅活的Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒原液採用0.01M PBS1:10倍稀釋後100μl/孔包被酶標板，2-8℃過夜，然後採用Sigma公司ISO2-1KT鼠單克隆抗體分型試劑按照單克隆抗體亞類試劑說明書進行試驗，最後加入HRP標記的兔抗羊二抗進行單克隆抗體亞類鑑定。結果顯示本發明的單克隆抗體為IgG1型。

實施例8免疫印跡(Western blotting)實驗

將純化滅活的Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒原液採用BIO-RAD的電泳電轉設備使用12％的SDS-PAGE電泳膠進行電泳，之後再電轉到硝酸纖維素膜，然後以本發明雜交瘤細胞腹水為一抗(1：2000)、AP-羊抗鼠IgG為二抗進行Western blotting鑑定。結果顯示，雜交瘤細胞JⅠ-112分泌的單克隆抗體與Sabin株脊髓灰質炎型病毒VP1、VP2、VP3、VP4均不反應，表明該單克隆抗體與變性後的抗原不能產生反應，說明本發明雜交瘤細胞JⅠ-112分泌的單克隆抗體JⅠ-112不能識別線性表位，是構象性單克隆抗體，識別空間結構。

實施例9親和常數測定

在本發明的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體JⅠ-112純化後檢測蛋白質含量。採用1:5、1:10、1:20稀釋的不同濃度的Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒橫向包被酶標板，100μl/孔，2-8℃包被過夜。第二天洗板後37℃封閉2小時，拍幹待用。將純化單克隆抗體JI-112二倍梯度稀釋，縱向加入包被後的酶標板，採用間接ELISA法檢測抗原抗體反應的OD值。以各抗原濃度下的曲線平坦段的OD值計為100％，計算50％OD值，考察50％OD值所對應點的單克隆抗體濃度[Ab]t，再根據親和常數計算公式可以得到本發明單克隆抗體的親和常數為0.996×109M-1。

實施例10雜交瘤細胞系分泌單克隆抗體的穩定性檢測

分別在3個月和12個月後，從液氮中取出凍存的JⅠ-112雜交瘤細胞株進行復甦、擴大培養後，製備腹水，進行間接ELISA檢測抗體效價，以前期製備的腹水為對照進行同時檢測。結果，本發明的雜交瘤細胞株製備的單克隆抗體腹水效價達到105以上，與前期腹水效價無差異，表明細胞保藏後製備的腹水的效價未下降。因此本發明單克隆細胞株分泌抗體的活性沒有降低，穩定性良好。

實施例11抗原含量檢測試劑盒的初步結果

將脊髓灰質炎Ⅰ型病毒兔多克隆抗體採用0.05M碳酸鹽緩衝液1:4000稀釋，100μl/孔包被酶標板，2-8℃過夜。封閉液37℃封閉2小時，分別加入脊髓灰質炎Ⅰ型抗原參比品和3批脊髓灰質炎滅活疫苗(所述脊髓灰質炎滅活疫苗包含Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型滅活病毒)，37℃反應1小時，洗板後加入1:8000的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體JⅠ-112，37℃反應1小時，洗板後加入1:4000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，37℃反應1小時後洗板進行顯色、終止、讀數，檢測脊髓灰質炎滅活疫苗的Ⅰ型抗原含量。結果見表4。

表4抗原含量檢測方法的應用

採用本發明建立的抗原含量檢測方法檢測了3批脊髓灰質炎滅活疫苗中的Ⅰ型抗原含量，檢測值相對於理論值的回收率在103％-126％之間，滿足質量標準的要求，在酶聯免疫法允許的誤差範圍以內，檢測方法準確可靠。本發明具有較好的應用效果。

實施例12抗原含量檢測試劑盒的特異性研究

將脊髓灰質炎Ⅰ型病毒兔多抗採用0.05M碳酸鹽緩衝液1:4000稀釋，100μl/孔包被酶標板2-8℃過夜。然後37℃封閉2小時，分別加入Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒原液、A肝滅活疫苗原液、柯薩奇A16(CA16)滅活疫苗原液、CA16收穫液、腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗原液、EV71收穫液，37℃反應1小時，洗板後加入1:8000的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體JⅠ-112，37℃反應1小時，洗板後加入1:4000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，37℃反應1小時後洗板進行顯色、終止、讀數，檢測樣品的Ⅰ型抗原含量，結果見表5。

表5本發明的單克隆抗體特異性(OD值)

本發明的單克隆抗體與Sabin株脊髓灰質炎Ⅱ和Ⅲ型病毒原液、A肝滅活疫苗原液、CA16滅活疫苗原液、CA16收穫液、EV71滅活疫苗原液、EV71收穫液均不反應，表明本發明的單克隆抗體可以有效地將脊髓灰質炎I型病毒與上述病毒區分開。同時採用本發明建立的體系和培養基以及Vero細胞培養物不存在交叉反應，因此本發明的單克隆抗體可以有效檢出脊髓灰質炎Ⅰ型抗原，具有高度的特異性。由於本發明的抗體具有作為區分脊髓灰質炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型混合疫苗中各型抗原最關鍵指標的特異性，因此本發明的單克隆抗體可對脊髓灰質炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型混合疫苗進行有效區分：在檢測Ⅰ型抗原時，本發明的單克隆抗體不與Ⅱ型和Ⅲ型抗原交叉反應，因此可以有效檢測脊髓灰質炎Ⅰ型抗原含量。

實施例13抗原含量檢測試劑盒對D抗原的檢測

將脊髓灰質炎Ⅰ型病毒兔多克隆抗體採用0.05M碳酸鹽緩衝液1:4000稀釋，100μl/孔包被酶標板，2-8℃過夜。封閉液37℃封閉2小時；將Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒(D抗原)以及脊髓灰質炎滅活疫苗56℃加熱30min，然後將樣品加入酶標板。後續試驗同實施例12，考察檢測試劑盒對於加熱前和加熱後的樣品中D抗原的檢測效果。結果見表6。

表6本發明的單克隆抗體對Ⅰ型病毒D抗原的檢測結果

根據現有文獻中的記載以及本發明人在先的研究，脊髓灰質炎病毒原液和滅活疫苗經過56℃加熱30min後免疫動物，動物的免疫血清的中和效價極低，表明經熱處理的樣品中的脊髓灰質炎病毒不再具有免疫原性。而在本申請中，根據表6，本發明的單克隆抗體與Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒原液以及滅活疫苗具有良好的反應，但與加熱後的上述樣品具有較差的反應，均低於3％，這表明抗原含量的檢測結果與現有的動物試驗的免疫原性具有良好的一致性。

另外，已知多克隆抗體-多克隆抗體的脊髓灰質炎抗原含量檢測系統與加熱後的脊髓灰質炎病毒依然具有較強的反應，和現有的動物試驗的免疫原性結果不一致。因此，本發明單克隆抗體的檢測系統能夠較好地檢測D抗原，更好地反映疫苗的保護效果，檢測結果更理想，更適合用於疫苗的中間產品和終產品的質量控制。

本發明的單克隆抗體在用於抗原含量檢測時，可以作為雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的包被抗體，也可對它進行生物標記或化學標記，作為雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的夾心酶標抗體；同時，也可以將它和另一物種的多克隆抗體配對使用，通過加入夾心抗體的第二酶標抗體的方法製備抗原含量檢測試劑盒。

本發明用於抗體檢測試劑盒時，可以作為包被抗體或者酶標競爭抗體，也可以作為競爭抗體並加入抗鼠酶標二抗的方法進行檢測。

實施例14抗原含量檢測試劑盒對市售各毒株脊髓灰質炎Ⅰ型病毒的檢測

將脊髓灰質炎Ⅰ型病毒兔多克隆抗體採用0.05M碳酸鹽緩衝液1:4000稀釋，100μl/孔包被酶標板，2-8℃過夜後封閉，然後加入Sabin株脊髓灰質炎Ⅰ型抗原參比品及其脊髓灰質炎滅活疫苗，以及Mahoney株國際標準品及其脊髓灰質炎滅活疫苗(所述脊髓灰質炎參比品、標準品、滅活疫苗均包含Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型滅活病毒)，37℃反應1小時，洗板後加1:8000的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒單克隆抗體JⅠ-112，37℃反應1小時，洗板後加入1:4000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，37℃反應1小時後洗板進行顯色、終止、讀數，檢測脊髓灰質炎滅活疫苗的Ⅰ型抗原含量。結果見表7。

表7抗原含量檢測方法的應用

目前已在國際上廣泛銷售的上市脊髓灰質炎滅活疫苗的Ⅰ型病毒包括Sabin株和Mahoney株兩種，均可有效預防由於Ⅰ型脊髓灰質炎病毒帶來的感染。採用本發明的細胞株製備的單抗腹水JⅠ-112建立的雙抗體夾心檢測系統，對於Sabin株和Mahoney株兩種脊髓灰質炎滅活疫苗中的Ⅰ型D抗原的檢測結果回收率在90％-110％之間，在酶聯免疫法允許的誤差範圍以內，回收率較好，檢測方法準確可靠。表明，採用該單抗可以有效檢測市售疫苗中的Ⅰ型D抗原含量，對市售疫苗的產品質量研究與質量控制具有廣譜適用性。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。