一株具有多環芳烴降解功能的植物促生內生細菌及其應用的製作方法

2023-04-27 21:21:56 2

一株具有多環芳烴降解功能的植物促生內生細菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株具有多環芳烴降解功能的植物促生內生細菌及其應用。一株具有多環芳烴降解功能的植物促生內生細菌馬賽菌(Massilia sp.)Pn2，於2014年8月26日保藏於中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC 1.12927。利用該菌株製備的菌劑在實驗室搖瓶培養條件下3d內對初始濃度為150mg·L‐1的菲降解率可達95％以上，同時該菌可在不同程度上降解萘、苊、蒽和芘。利用浸根處理將菌劑定殖於植物根表後將植物種植於受菲汙染的營養液中，能夠在短時間內使植物體內的菲含量降低50％以上，顯著降低了植物體的菲汙染風險，且對植物生長有明顯的促進作用。CGMCC 1.1292712014.08.26
【專利說明】一株具有多環芳烴降解功能的植物促生內生細菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於環境多環芳烴（PAHs)汙染生物修復領域，涉及一種具有PAHs降解功 能的植物促生內生細菌及其生產的菌劑和應用。

【背景技術】
[0002] 多環芳烴（PAHs)是由2個或2個以上苯環組成的土壤環境中常見的一類重要持 久性有機汙染物，其疏水性強、難於降解。作為疏水性有機汙染物，土壤中PAHs可被植物吸 收並在體內積累。如何減低植物PAHs汙染風險是當前農業環境領域研究的熱點之一。
[0003] 植物內生細菌是指能夠定殖在植物健康組織間隙或細胞內、並與宿主植物建立和 諧共生關係的一類微生物，具有促進植物生長、增強宿主植物抗逆性、抗病蟲害等作用，並 可作為生防菌和外源基因的重要載體。然而，關於植物內生菌影響植物吸收有機汙染物的 報導至今仍很少。有研究表明，內生細菌可以提高有機汙染土壤上植株的根長和生物量，增 強植株對有機汙染物的耐受性。而Barac等將利用基因改造過的內生細菌浸染黃色羽扇 豆，發現通過植物葉片揮發的甲苯量減少50?70%。
[0004] 有學者推測篩選具有降解特性的植物內生菌並將其定殖在目標植物上，有望提高 植物對有機汙染物的降解作用，降低有機物在植物體內的積累，進而減低作物有機汙染風 險。然而，針對PAHs等持久性有機汙染物，國內外仍少有資料報導，且未見相關專利研究和 應用報導。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是針對上述技術問題，提供一種具有PAHs降解功能的植物促生內 生細菌（以下簡稱功能內生細菌）。
[0006] 本發明的另一目的是提供該功能內生細菌生產的菌劑。
[0007] 本發明的又一目的是提供該功能內生細菌在降低植物PAHs汙染風險中的應用。
[0008] 本發明的目的可通過以下技術方案實現：
[0009] 功能內生細菌馬賽菌（Massilia sp. )Pn2,2014年8月26日保藏於中國微生物菌 種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC 1.12927，保藏地址為中國北京 市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。
[0010] -種用所述的馬賽菌（Massilia sp. )Pn2所生產的功能內生細菌菌劑，是通過以 下方法生產而成：
[0011] 1)將保藏編號為CGMCC 1. 12927的馬賽菌（Massilia sp. )Pn2試管種接種於發酵 培養基中，振蕩培養至對數期；
[0012] 2)將上述培養好的菌種按5% (V/V，以培養基體積為基準，下同）的接種量接種入 種子罐，培養至對數期；
[0013] 3)將種子液按10 %的接種量接入生產罐培養；
[0014] 4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:1. 2,攪拌速度為200 轉/分，培養溫度為30°C，全流程培養時間為60小時，發酵結束後菌體數量達到10億個/ ml以上；其中，所述的發酵培養基，種子罐所用的培養基和生產罐所用的培養基相同，配方 均為：胰蛋白腖〇· 5g · I71，可溶性澱粉0· 5g · I71，葡萄糖0· 5g · I71，酵母膏0· 5g · I71，酪蛋 白胺基酸〇. 5g · I71，磷酸氫二鉀0. 3g · I71，丙酮酸鈉0. 3g · I71，七水合硫酸鎂0. 05g · I71， pH 7. 0-7. 4 ；
[0015] 5)發酵完成後培養液出罐，用發酵培養基調節培養液濃度至0D600nm = 0. 55,即 為功能內生細菌菌劑，可直接用於植物的浸根處理。
[0016] 所述的保藏編號為CGMCC 1. 12927的馬賽菌（Massilia sp. )Pn2在降解PAHs的 應用；優選所述的馬賽菌（Massilia sp.)Pn2在降解水體，土壤以及植物體內PAHs的應用。
[0017] 所述的多環芳烴（PAHs)選自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一種或多種。
[0018] 本發明所述的降解菌劑在降解多環芳烴中的應用；優選在降解水體，土壤或植物 體內多環芳烴的應用。
[0019] 所述的多環芳烴優選自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一種或多種。
[0020] 有益效果
[0021] 本發明篩選獲得一株馬賽菌（Massilia sp.)Pn2(CGMCC L 12927)，利用該菌株制 備的功能內生細菌菌劑在實驗室搖瓶培養條件下3d內對初始濃度為150mg · Γ1的菲降解 率可達95%以上，同時該菌可在不同程度上降解萘、苊、蒽和芘。利用浸根處理將該菌劑定 殖於植物根表後將植物種植於受菲汙染的營養液中，能夠在短時間內使植物體內的菲含量 降低50%以上，顯著降低了植物體的菲汙染風險，且對植物生長有明顯的促進作用。
[0022] 本發明描述的環境修復菌劑可以用發酵工業通用發酵設備進行生產，具有生產成 本低，使用方便，去除效果好的優點，適合治理水體，土壤以及植物體內的PAHs汙染。本發 明為在PAHs汙染區生產健康的農產品提供了技術支持，同時對於保障PAHs汙染環境下的 農產品安全具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1菌株Pn2的菌落照片和透射電鏡照片
[0024] A圖為菌株Pn2的菌落照片，B圖為菌株Pn2的透射電鏡照片
[0025] 圖2菌株Pn2以150mg · L-I菲為唯一碳源時的生長和降解曲線
[0026] 生物材料保藏信息
[0027] 功能內生細菌Pn2,分類命名為馬賽菌（Massilia sp.)保藏於中國微生物菌種保 存管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址為中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國 科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC 1. 129271，保藏日期為2014年8月26日。

【具體實施方式】
[0028] 實施例1菌株的分離和鑑定
[0029] 將採自南京江寧揚子石化芳烴廠排汙口的新鮮看麥娘植株進行表面消毒：植物用 自來水衝洗乾淨後，於超淨臺內用75 %酒精漂洗3?5min，而後用無菌水衝洗3?4次，再 用1%次氯酸鈉溶液漂洗2?5min，最後用無菌水再衝洗數次。將經表面消毒的植物樣品 移入LB固體平板上，於30°C培養24h後，檢查平板上是否有細菌生長。若無菌落長出，則說 明植株表面消毒成功。
[0030] 將經檢驗消毒完全的植株移入無菌研缽，用滅菌剪刀剪碎後，加無菌水充分研磨， 取上清液以5%的接種量加入到IOOmL的無機鹽培養基中，並添加菲至150mg · I/1作為唯 一碳源，於30°C，180r · miiT1搖床培養7d，以5%的接種量轉接到相同的培養基中，連續轉 接三次後，梯度稀釋富集液，取KT 4-KT7稀釋度的富集液各0. ImL塗布於添加150mg· I/1 菲的無機鹽平板上，於30°C恆溫培養3d後，挑取長出的單菌落接種於含有150mg · I/1菲 的無機鹽液體培養基中，於30°C，180r min_1搖床培養7d，驗證其對菲的降解效果。無機 鹽培養基配方為：NH4NO 3L Og .I/1，KH2PO4O.如·！/1，K 2HPO4L 如·！/1，NaCl LOg .I/1， MgSO4 · 7H20 0· 2g · I/1，pH 7· 0 ;固體培養基加 16g · I/1 瓊脂。
[0031] 降解效果的驗證方法：向培養液中加入等體積色譜甲醇後，超聲處理30min，使瓶 中菲全部溶解，12000r HiirT1離心去除沉澱後取上清液用濾膜過濾（孔徑0.22 μ m)，用高 效液相色譜法測定其中的菲含量。高效液相色譜（島津LC - 20AT，檢測器型號SPD - 20A) 設定參數為：Inertsil ODS - SP - C18反相色譜柱（150mmX4. 6mm，5 μ m)，流動相為甲醇： 水=90:10，流速0.901111^1^11_1，柱溫401：，紫外檢測波長24511111，進樣量1(^1。外標法按 峰面積定量。
[0032] 從富集液中分離到一株菲降解菌，命名為菌株Pn2。菌株Pn2降解菲前後的液相 色譜檢測結果表明菌株Pn23d內對初始濃度為150mg · I/1的菲降解率大於95%。菌株 Pn2在固體培養基上生長3d後，菌落為圓形，表面光滑，邊緣整齊，呈乳白色，有光澤，菌體 易挑起。在透射電子顯微鏡下該菌呈短杆狀，端生鞭毛，不形成芽孢。G_，好氧生長，其生 理生化特性見表1。菌株Pn2的形態和生理生化特徵和Bergey's manual of systematic bacteriology上對馬賽菌的描述是一致的。
[0033] 以菌株Pn2的基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA基因序列通用引物進行PCR擴 增，得到長度為HOObp的16S rRNA基因序列（GenBank登錄號為JX270637)。在RDP數據 庫（https://rdp.cme. msu.edu/)中進行Blast，結果表明菌株Pn2與馬賽菌屬菌株的同源 性最近，與Massilia niastensis 5516S-1T菌株的序列相似性達到98%。結合生理生化 特徵將該菌鑑定為馬賽菌屬（Massilia sp.)，將該菌送交中國微生物菌種保存管理委員會 普通微生物中心（CGMCC)保藏，保藏編號為CGMCC 1. 12927,保藏日期為2014年8月26日。
[0034] 表1菌株Pn2的生理生化特性
[0035]

【權利要求】
1. 一株具有多環芳烴降解功能的植物促生內生細菌馬賽菌（Massilia sp.)Pn2,2014 年8月26日保藏於中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC 1. 12927。
2. -種用權利要求1所述的功能內生細菌馬賽菌Pn2所生產的降解菌劑，其特徵在於 是通過以下方法生產而成： 1) 將保藏編號為CGMCC 1. 12927的馬賽菌Pn2試管種接種於發酵培養基中，振蕩培養 至對數期； 2) 將上述培養好的菌種按5%的接種量接種入種子罐，培養至對數期； 3) 將種子液按10 %的接種量接入生產罐培養； 4) 在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:1. 2,攪拌速度為200轉/ 分，培養溫度為30°C，全流程培養時間為55?60小時，發酵結束後菌體數量達到10億個/ ml以上； 其中，所述的發酵培養基，種子罐所用的培養基和生產罐所用的培養基相同，配方均 為：胰蛋白腖〇. 5g · I/1，可溶性澱粉0. 5g · I/1，葡萄糖0. 5g · I/1，酵母膏0. 5g · I/1，酪蛋 白胺基酸〇. 5g噸―1，磷酸氫二鉀0. 3g .I/1，丙酮酸鈉0. 3g .I/1，七水合硫酸鎂0. 05g .I/1， pH 7. 0 - 7. 4 ； 5) 發酵完成後培養液出罐，用發酵培養基調節培養液濃度至0D600nm = 0. 55,即為所 述的降解菌劑。
3. 權利要求1所述的功能內生細菌馬賽菌Pn2在降解多環芳烴中的應用。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述的功能內生細菌馬賽菌Pn2在降解水 體，土壤或植物體內多環芳烴中的應用。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於所述的多環芳烴選自萘、苊、蒽、菲和芘中 的任意一種或多種。
6. 權利要求2所述的降解菌劑在降解多環芳烴中的應用。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特徵在於權利要求2所述的降解菌劑在降解水體，土 壤或植物體內多環芳烴的應用。
8. 根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述的多環芳烴選自萘、苊、蒽、菲和芘中 的任意一種或多種。
【文檔編號】C12N1/20GK104263682SQ201410467144
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】高彥徵, 劉娟, 劉爽, 孫凱 申請人:南京農業大學