調控性ciapin1基因重組腺病毒及其製備方法和應用的製作方法
2023-04-27 07:48:56 1
專利名稱：調控性ciapin1基因重組腺病毒及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物基因工程領域，涉及一種基因重組腺病毒，特別涉及一種調控性 CiAPim基因重組腺病毒，還涉及該重組腺病毒的製備方法和應用。
背景技術：
神經膠質瘤是威脅人類健康的重要疾病，其治療新方法的研究一直是醫學和生命科學研究的重點。神經膠質瘤的生物治療已被世界醫學界公認為是繼手術、放療和化療之後的第四大治療方法，其中基因治療更是目前腫瘤生物治療中最活躍的研究領域之一。神經膠質瘤基因治療的原理是將目的基因用基因轉移技術導入靶細胞，使靶細胞表達此基因而獲得特定的功能，繼而執行或介導對腫瘤的殺傷和抑制作用，從而達到治療之目的。細胞因子誘導的凋亡抑制因子1 (cytokine induced apoptosis inhibitorl, CIAPIN1)是新近發現的一個細胞因子依賴性抗凋亡分子，並已經被證實是獨立於凋亡調節分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的Ras信號轉導通路中的另一個調節分子。從目前的研究結果來看，一方面CIAPim在不同組織來源的惡性腫瘤中表達水平存在明顯差異，使得CIAPim在相應腫瘤的發生過程及增殖凋亡過程中發揮的作用不同；另一方面CIAPIN1 參與了腫瘤多藥耐藥的發生及逆轉。因此，CIAPim基因的生物學功能仍未明了，內源性和外源性CIAPim基因可能發揮不同的功能，CIAPim與腫瘤的發生可能與多基因、多因素有關。迄今為止，國內外尚未見有關調控性CIAPim基因重組腺病毒及其在神經膠質瘤治療領域應用的研究報導。
發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種調控性CIAPim基因重組腺病毒，通過腫瘤特異性啟動子調控CIAPim基因的表達，使CIAPim基因能選擇性地表達於腫瘤細胞中，從而在準確殺傷腫瘤細胞的同時減少正常組織細胞的損傷；目的之二在於提供所述調控性CiAPim基因重組腺病毒的製備方法；目的之三在於提供所述調控性CiAPim基因重組腺病毒在神經膠質瘤治療領域中的應用。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案
1、調控性CIAPim基因重組腺病毒，系將一個CIAPim基因表達盒插入複製缺陷5型腺病毒基因組中而得到，所述CIAPim基因表達盒由Survivin啟動子、CIAPIN1基因和終止子組成，所述CIAPim基因的表達受Survivin啟動子調控。2、調控性CIAPim基因重組腺病毒的製備方法，包括以下步驟
a、Survivin啟動子的克隆根據Survivin基因啟動子片段的核苷酸序列設計併合成引物，以神經膠質瘤細胞U251基因組DNA為模板，PCR擴增兩端分別帶有Bio I酶切位點和Nco I酶切位點的Survivin啟動子片段，將其克隆入pGEM_T載體，得重組載體pGEM_T/ SurvivinP ；
b、ciAPmi基因的克隆根據CiAPim基因的核苷酸序列設計併合成引物，將人胚胎腎293細胞總RNA逆轉錄為cDNA，再以該cDNA為模板，PCR擴增兩端分別帶有Hind III 酶切位點和BamH I酶切位點的CIAPim全長cDNA，將其克隆入pMD18_T載體，得重組載體pMD18-T/CIAPim ；再自重組載體pMD18_T/CIAPmi中用Hind III和BamH I雙酶切出 CIAPim全長cDNA，與同樣經Hind III和BamH I雙酶切的真核表達載體pcDNA3. 1 (+)在 T4 DNA連接酶的作用下連接，得重組載體pcDNA3. 1-CIAPIN1 ；
c、調控性CIAPim基因重組腺病毒穿梭載體的構建自步驟a所得重組載體pGEM-T/ SurvivinP中用Xho I和Nco I雙酶切出Survivin啟動子片段，與同樣經Xho I和Nco I 雙酶切的步驟b所得重組載體pcDNA3. I-CIAPim在T4 DNA連接酶的作用下連接，得重組載體 pcDNA3. I-SurvivinP-CIAPINl ；再自重組載體 pcDNA3. I-SurvivinP-CIAPINl 中用 Xho I和BamH I雙酶切出SurvivinP-CIAPINl片段，與同樣經Xho I和BamH I雙酶切的腺病毒穿梭載體PShuttle在T4 DNA連接酶的作用下連接，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-SurvivinP-CIAPINl ；
d、調控性CIAPim基因重組腺病毒載體的構建將步驟c所得重組腺病毒穿梭載體paiuttle-SurvivinP-CIAPim用Rne I酶切使線性化後，與腺病毒骨架載體 PAdEasy-I共轉染大腸桿菌BJ5183感受態細胞進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體 pAd-SurvivinP-CIAPINl ；
e、調控性CIAPim基因重組腺病毒的包裝、擴增和純化用脂質體法將步驟d所得重組腺病毒載體pAd-SurvivinP-CIAPim轉染293細胞，待細胞出現明顯病變時，離心收集細胞，反覆凍融使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，得重組腺病毒 Ad-SurvivinP-CIAPINl原液；將病毒原液再感染293細胞以擴增病毒，所得含病毒上清液採用氯化銫梯度離心純化，即得調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPINl。進一步，步驟a中所述引物序列為上遊引物5，-gcctcgaggctcaagtgacaagcaagt gtttat-3，；下遊弓丨物5，-gcccatgggggctcacctggctgctc-3，。進一步，步驟a中所述PCR循環條件參數為94°C預變性3分鐘，然後94°C變性1 分鐘、58°C退火1分鐘，72°C延伸1. 5分鐘，共30個循環，最後72°C延伸7分鐘。進一步，步驟b中所述引物序列為上遊引物5，-gggaagcttatggcagattttgggatc t_3，；弓L 5' -atgggatccctagtacgcagtaagcggtc-3『 進一步，步驟b中所述PCR循環條件參數為94°C預變性3分鐘，然後94°C變性30 秒、65 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘。3、調控性CIAPim基因重組腺病毒在製備神經膠質瘤治療藥物中的應用。本發明的有益效果在於本發明的調控性CIAPim基因重組腺病毒具有較強的選擇性和特異性，通過腫瘤特異性Survivin啟動子調控CIAPim基因的表達，能夠使CIAPIN1 基因選擇性地表達於神經膠質瘤細胞中，發揮抑制細胞克隆、誘導細胞凋亡的作用，在準確殺傷神經膠質瘤細胞的同時減少正常組織細胞的損傷，體內實驗顯示其能夠有效抑制神經膠質瘤細胞的生長，延長荷瘤裸鼠的平均生存期並提高平均生存率，因此，可用於製備神經膠質瘤治療藥物，在神經膠質瘤基因治療領域有著較好的開發應用前景。
圖1為Survivin啟動子PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標準，1為PCR產物。圖2為CIAPim基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標準，1 為PCR產物。圖3為感染本發明重組腺病毒的神經膠質瘤細胞和正常組織細胞的凋亡率比較圖。圖4為感染本發明重組腺病毒的神經膠質瘤細胞和正常組織細胞的克隆形成率比較圖。圖5為給予本發明重組腺病毒或PBS的荷瘤裸鼠的腫瘤生長曲線。圖6為給予本發明重組腺病毒或PBS的荷瘤裸鼠的平均生存率。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。一、調控性CIAPim基因重組腺病毒的製備 1、Survivin啟動子的克隆
採用基因組DNA提取試劑盒提取神經膠質瘤細胞U251基因組DNA，按照試劑盒說明書操作。以所得U251細胞基因組DNA為模板，以Fl :5，-gcctcgaggctcaa gtgacaagcaagtgtttat-3，(SEQ ID No. 1，下劃線部分為 Xho I 酶切位點)和 Rl 5' -gcccatgggggctcacctggctgctc-3' (SEQ ID No. 2，下劃線部分為 Nco I 酶切位點)為上下遊引物，採用PCR試劑盒擴增長980bp的Survivin啟動子片段(SEQ ID No. 3)，按照試劑盒說明書操作。PCR循環條件參數為94°C預變性3分鐘，然後94°C變性1分鐘、58°C退火 1分鐘，72°C延伸1. 5分鐘，共30個循環，最後72°C延伸7分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定(圖1)、凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與PGEM-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，測序鑑定，將陽性克隆質粒命名為pGEM-T/SurvivinP。2、CIAPim基因的克隆
採用Trizol試劑提取人胚胎腎293細胞總RNA，按照試劑說明書操作。將所得細胞總 RNA 逆轉錄為 cDNA，再以該 cDNA 為模板，以 F2 :5』 -gggaagcttatggcagattttgggatct-3『 (SEQ ID No. 4，下劃線部分為 Hind III 酶切位點)和 R2 :5，-atgggatccctagtacgcagtaagc ggtc-3，(SEQ ID No. 5，下劃線部分為BamH I酶切位點)為上下遊引物，採用PCR試劑盒擴增長939bp的CIAPim全長cDNA (SEQ ID No. 6)，按照試劑盒說明書操作。PCR循環條件參數為94°C預變性3分鐘，然後94°C變性30秒、65°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共30 個循環，最後72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定(圖2)、凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與PMD18-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，測序鑑定，將陽性克隆質粒命名為pMDIS-T/ CIAPINlo自陽性克隆質粒pMD18-T/CIAPim中用Hind III禾Π BamH I雙酶切出CIAPim全長cDNA，與同樣經Hind III和BamH I雙酶切的真核表達載體pcDNA3. 1 (+)在T4 DNA連接酶的作用下連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆，抽提質粒，Hind III和BamH I雙酶切鑑定及測序鑑定，將陽性克隆質粒命名為 pcDNA3. I-CIAPmi。3、調控性CIAPim基因重組腺病毒穿梭載體的構建
自陽性克隆質粒pGEM-T/SurvivinP中用Xho I和Nco I雙酶切出Survivin啟動子片段，與同樣經Xho I和Nco I雙酶切的陽性克隆質粒pcDNA3. I-CIAPim在T4 DNA 連接酶的作用下連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨苄青黴素的 LB平板篩選陽性克隆，抽提質粒，B10 I和Nco I雙酶切鑑定，將陽性克隆質粒命名為 pcDNA3. I-SurvivinP- CIAPIN1。自陽性克隆質粒pcDNA3. I-SurvivinP-CIAPINl中用Xho I和BamH I雙酶切出 SurvivinP- CIAPim片段，與同樣經Β ο I和BamH I雙酶切的腺病毒穿梭載體pShuttle 在T4 DNA連接酶的作用下連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆，抽提質粒，B10 I和BamH I雙酶切鑑定，將陽性克隆質粒即調控性CIAPim基因重組腺病毒穿梭載體命名為pShuttle-SurvivinP-CIAPINl。4、調控性CIAPim基因重組腺病毒載體的構建
將調控性CIAPim基因重組腺病毒穿梭載體pShuttle-SurvivinP-CIAPim用Rne I 酶切使線性化後，與腺病毒骨架載體PAdEasy-I同時電轉化大腸桿菌BJ5183感受態細胞進行胞內同源重組，用含有卡那黴素的LB平板篩選陽性克隆，抽提質粒，Pac I酶切鑑定，將陽性克隆質粒即調控性CIAPim基因重組腺病毒載體命名為pAd-SurvivinP- CIAPINU5、調控性CIAPim基因重組腺病毒的包裝、擴增和純化
將人胚胎腎293細胞以40%飛0%的細胞密度接種至T-25培養瓶中，待細胞生長至309Γ 50%融合時棄去培養液，用Lipofectamine 2000試劑將調控性CIAPim基因重組腺病毒載體pAd-SurvivinP-CIAPim轉染293細胞，通過顯微鏡觀察細胞病理改變，待出現明顯細胞病變效應時離心收集細胞，用PBS重懸，反覆凍融3次使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒上清液，獲得調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPim原液；將病毒原液再感染293細胞以擴增病毒，最後將含病毒上清液採用氯化銫梯度離心純化，即得調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPINl。二、調控性CIAPim基因重組腺病毒的抗神經膠質瘤作用檢測 1、體外抗神經膠質瘤作用檢測
(1)細胞凋亡率檢測
將神經膠質瘤細胞U251和美洲綠猴腎細胞C0S-7分別接種於培養瓶內，培養M 小時後，將調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPim按感染複數(Μ0Ι) 為100感染細胞，同時設置相應對照組(用PBS替代調控性CIAPim基因重組腺病毒 Ad-SurvivinP-CIAPINl),感染3天後，收集細胞，用PBS洗滌並調整細胞濃度為1 X IO5/ ml，加入濃度為250μ g/ml的異硫氰酸螢光素標記的磷脂結合蛋白V (Annexin V) 5μ 1禾口濃度為250μ g/ml的碘化丙啶(PI) 5 μ 1，冰浴避光孵育10分鐘，用PBS洗滌細胞，用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡情況=Armexin V和PI均低染的細胞為正常活細胞； Annexin V高染而PI低染的細胞為凋亡細胞，Annexin V和PI均高染的細胞為壞死細胞。結果見圖3，感染調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPim或PBS的神經膠質瘤細胞U251的凋亡率分別為(34士5)%和(8士2)%，而感染調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPim或PBS的正常組織細胞C0S-7的凋亡率分別為(7士 1)% 和(6士 1)%，表明本發明的調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPmi能夠有效並且特異地誘導神經膠質瘤細胞的凋亡。(2)細胞克隆形成率檢測
分別將神經膠質瘤細胞U251和美洲綠猴腎細胞C0S-7各200個接種於6孔板， 培養M小時後，將調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPmi按MOI 為100感染細胞，同時設置相應對照組(用PBS替代調控性CIAPim基因重組腺病毒 Ad-SurvivinP-CIAPINl)，感染2周至細胞集落形成後，行吉姆薩染色，鏡下計數大於50 個細胞的集落，按下述公式計算細胞克隆形成率細胞克隆形成率=克隆數/接種細胞數 X100%ο結果見圖4，感染調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPmi或 PBS的神經膠質瘤細胞U251的克隆形成率分別為(8士 1.2)%和(76士 10)%，而感染調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPmi或PBS的正常組織細胞C0S-7的克隆形成率分別為(73士 12)%和(72士 11)%，表明本發明的調控性CIAPim基因重組腺病毒 Ad-SurvivinP-CIAPINl能夠有效並且特異地抑制神經膠質瘤細胞的克隆。 2、體內抗神經膠質瘤作用檢測
將IXlO5個神經膠質瘤細胞U251接種於裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠，將荷瘤裸鼠隨機分為兩組對照組和實驗組，對照組尾靜脈注射PBS，實驗組尾靜脈注射調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPINl，觀察60天內兩組小鼠的生存率和腫瘤體積，繪製腫瘤生長曲線。兩組小鼠的腫瘤生長曲線見圖5，第30天時，對照組小鼠腫瘤體積達到^OOmm3, 而實驗組小鼠腫瘤生長緩慢，腫瘤體積僅為700mm3 ；兩組小鼠的平均生存率見圖6，對照組小鼠於35天內全部死亡，而實驗組小鼠60天的生存率為50%;表明本發明的調控性 CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPim能夠有效抑制神經膠質瘤細胞的生長，延長荷瘤裸鼠的平均生存期並提高平均生存率。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和範圍。
權利要求
1.調控性CiAPim基因重組腺病毒，其特徵在於將一個CiAPim基因表達盒插入複製缺陷5型腺病毒基因組中而得到，所述CIAPim基因表達盒由Survivin啟動子、CIAPIN1 基因和終止子組成，所述CIAPim基因的表達受Survivin啟動子調控。
2.權利要求1所述調控性CIAPim基因重組腺病毒的製備方法，其特徵在於包括以下步驟a、Survivin啟動子的克隆根據Survivin基因啟動子片段的核苷酸序列設計併合成引物，以神經膠質瘤細胞U251基因組DNA為模板，PCR擴增兩端分別帶有B10 I酶切位點和Nco I酶切位點的Survivin啟動子片段，將其克隆入pGEM_T載體，得重組載體pGEM_T/ SurvivinP ；b、ciAPmi基因的克隆根據CiAPim基因的核苷酸序列設計併合成引物，將人胚胎腎293細胞總RNA逆轉錄為cDNA，再以該CDNA為模板，PCR擴增兩端分別帶有Hind III 酶切位點和BamH I酶切位點的CIAPim全長cDNA，將其克隆入pMD18_T載體，得重組載體pMD18-T/CIAPim ；再自重組載體pMD18_T/CIAPmi中用Hind III和BamH I雙酶切出 CIAPim全長cDNA，與同樣經Hind III和BamH I雙酶切的真核表達載體pcDNA3. 1 (+)在 T4 DNA連接酶的作用下連接，得重組載體pcDNA3. 1-CIAPIN1 ；c、調控性CIAPim基因重組腺病毒穿梭載體的構建自步驟a所得重組載體pGEM-T/ SurvivinP中用Xho I和Nco I雙酶切出Survivin啟動子片段，與同樣經Xho I和Nco I 雙酶切的步驟b所得重組載體pcDNA3. I-CIAPim在T4 DNA連接酶的作用下連接，得重組載體 pcDNA3. I-SurvivinP-CIAPINl ；再自重組載體 pcDNA3. l-SurvivinP-CIAPINl 中用Xho I和BamH I雙酶切出SurvivinP-CIAPmi片段，與同樣經Xho I和BamH I雙酶切的腺病毒穿梭載體pShuttle在T4 DNA連接酶的作用下連接，得重組腺病毒穿梭載體 pShuttle-SurvivinP- CIAPIN1 ；d、調控性CIAPim基因重組腺病毒載體的構建將步驟c所得重組腺病毒穿梭載體paiuttle-SurvivinP-CIAPim用Rne I酶切使線性化後，與腺病毒骨架載體 PAdEasy-I共轉染大腸桿菌BJ5183感受態細胞進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體 pAd-SurvivinP-CIAPINl ；e、調控性CIAPim基因重組腺病毒的包裝、擴增和純化用脂質體法將步驟d所得重組腺病毒載體pAd-SurvivinP-CIAPim轉染293細胞，待細胞出現明顯病變時，離心收集細胞，反覆凍融使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，得重組腺病毒 Ad-SurvivinP-CIAPINl原液；將病毒原液再感染293細胞以擴增病毒，所得含病毒上清液採用氯化銫梯度離心純化，即得調控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPINl。
3.根據權利要求2所述調控性CIAPim基因重組腺病毒的製備方法，其特徵在於步驟a中所述引物序列為上遊引物5，-gcctcgaggctcaagtgacaagcaagtgtttat-3』 ；下遊引物5' - gcccatgggggctcacctggctgctc-3'ο
4.根據權利要求3所述調控性CIAPim基因重組腺病毒的製備方法，其特徵在於步驟a中所述PCR循環條件參數為94°C預變性3分鐘，然後94°C變性1分鐘、58°C退火1分鐘，72 °C延伸1. 5分鐘，共30個循環，最後72°C延伸7分鐘。
5.根據權利要求2所述調控性CIAPim基因重組腺病毒的製備方法，其特徵在於步驟b中所述引物序列為上遊引物5，-gggaagcttatggcagattttgggatct-3，；下遊引物5，_atgggatccctagtacgcagtaagcggtc-3』。
6.根據權利要求5所述調控性CIAPim基因重組腺病毒的製備方法，其特徵在於步驟b中所述PCR循環條件參數為94°C預變性3分鐘，然後94°C變性30秒、65°C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘。
7.權利要求1所述調控性CIAPim基因重組腺病毒在製備神經膠質瘤治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種調控性CIAPIN1基因重組腺病毒及其製備方法和應用，該重組腺病毒是將一個CIAPIN1基因表達盒插入複製缺陷5型腺病毒基因組中而得到，CIAPIN1基因表達盒由Survivin啟動子、CIAPIN1基因和終止子組成，CIAPIN1基因的表達受Survivin啟動子調控；該重組腺病毒具有較強的選擇性和特異性，通過腫瘤特異性Survivin啟動子調控CIAPIN1基因的表達，能夠使CIAPIN1基因選擇性地表達於神經膠質瘤細胞中，發揮抑制細胞克隆、誘導細胞凋亡的作用，在準確殺傷神經膠質瘤細胞的同時減少正常組織細胞的損傷，體內實驗顯示其能夠有效抑制神經膠質瘤細胞的生長，延長荷瘤裸鼠的平均生存期並提高平均生存率，因此，可用於製備神經膠質瘤治療藥物，在神經膠質瘤基因治療領域有著較好的開發應用前景。
文檔編號C12N15/861GK102286435SQ20111017117
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月23日 優先權日2011年6月23日
發明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學