一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法

2023-05-17 06:58:01

專利名稱：一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法
技術領域：
本發明屬化學定量分析技術領域，具體涉及一種肌氨酸的定量檢測方法，尤其涉及一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法。
背景技術：
目前前列腺癌的篩查診斷方法主要包括血清前列腺特異抗原測定(PSA)、直腸指檢、經直腸超聲檢查、前列腺組織穿刺活檢等。PSA篩查被認為是預測前列腺癌最好的指標，並在臨床上廣泛應用。但其特異性有限，有些前列腺增生和前列腺炎患者PSA也會升高，誤診情況時有發生。前列腺系統性穿刺活檢是診斷前列腺癌最可靠的方法，屬於侵入性檢查，需要在B超引導下進行，檢查結果嚴重依賴於穿刺位置的準確性。更為重要的 是，已有的診斷方法往往使臨床腫瘤醫生能輕易地診斷出前列腺癌，卻無法判斷癌細胞的生物學特性是侵襲性還是非侵襲性，即判斷癌症的危險性。而這有可能導致惡性前列腺癌患者喪失了最佳的治療機會。通過檢測生物樣本中小分子或者大分子生物標誌物是疾病篩查與診斷的有效手段，對於疾病的早期診斷、治療和預後具有重要的參考價值和臨床意義。因此無論從解決臨床前列腺癌診治難題的角度出發，還是從提高癌症患者的生存率並降低治療成本的角度出發，尋找特異性更高的生物標誌物，特別是能表徵前列腺癌侵襲性的生物標誌物，都是臨床上亟需解決的問題。肌氨酸是一種存在於人體肌肉和其他組織的天然胺基酸，為甘氨酸的代謝產物。研究表明，肌氨酸在侵襲性前列腺癌中含量顯著升高，且可在尿樣中檢測出來，66例前列腺癌患者和200例正常健康人尿肌氨酸水平分別為404 ng/mL和104 ng/mL，肌氨酸值在前列腺癌病例中明顯增加(/7〈0. 001)。尿樣中肌氨酸及肌氨酸/肌酐比值的受試者工作特徵曲線(R0C曲線)下面積分別為0.904和0.946。提示肌氨酸具有非常高的檢驗靈敏度和特異性。這使得肌氨酸成為前列腺癌非損傷性診斷的一個候選生物標誌物，也有可能成為新的更好的前列腺癌診斷標誌物。目前對於肌氨酸的檢測，分別採用高效液相色譜法、氣相色譜一質譜法和液相色譜一質譜法，主要缺陷是特異性差，難以實現肌氨酸與幹擾物質的完全分離，樣品的處理方法步驟比較複雜。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法，能準確靈敏地定量檢測尿樣中肌氨酸的含量。為達到上述目的，本發明提供的一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法，其特徵在於
(I)尿樣乙腈稀釋隨機取100 i! L尿樣，加入20 UL濃度為50 U g/mL肌氨酸-d3內標工作液，加入200 V- L乙腈,混旋30s, 15000 rpm離心3 min,棄沉澱,吸取100 u L上清液與300 u L乙腈混合，轉移至進樣瓶，供分析測試；(2)色譜分離以矽膠鍵合相填料為分析柱，以水溶液為流動相A，乙腈溶液為流動相B，所述A相中含有0.02 0.4%甲酸和I 5mmol/L甲酸銨作為改性劑，流速為0. I I mL/min，等度洗脫或者梯度洗脫，將肌氨酸從分析柱上洗脫，與其他幹擾物質實現色譜分離；
(3)質譜檢測採用電噴霧離子源串聯質譜儀，在正離子檢測模式下，多反應監測掃描分析，檢測肌氨酸；
(4)結果計算以質譜檢測獲得的肌氨酸峰面積或峰高度，按同位素稀釋內標法計算肌氨酸在尿樣中的含量。所述步驟(3)質譜檢測離子源參數設置為肌氨酸檢測通道m/z 90/44,肌氨酸_d3檢測通道m/z 93/47，離子通道範圍為±0.5 m/z。 本發明定量檢測尿樣中肌氨酸的含量，屬於非損傷性檢測方法。採用乙腈稀釋處理尿樣，以矽膠鍵合相填料柱為分析柱，流動相添加甲酸和甲酸銨為改性劑，等度洗脫或者梯度洗脫，在正離子模式下，以多反應監測法測定，以肌氨酸質譜檢測獲得的峰面積或峰高度，按同位素稀釋內標法定量檢測。本發明能實現肌氨酸和內源性幹擾物完全分離而不相互幹擾，肌氨酸的最低定量限可達100 ng/mL,方法的精密度(以相對標準偏差計)小於12%，準確度為87. 8%-99. 5%。方法的特異性、靈敏度、精密度和準確性較高，且成本低廉、簡單快速，適用於臨床上低成本、大批量尿樣中肌氨酸定量檢測的要求。


圖I肌氨酸的標準曲線；
以肌氨酸濃度為X軸，以肌氨酸與內標峰面積比值為Y軸，經過1/X權重處理，在濃度100 ng/mL至5000 ng/mL範圍內，線性相關係數為0.9998。圖2尿樣中肌氨酸的色譜圖。圖中I 一肌氨酸色譜峰，2 —幹擾物色譜峰。由圖示可見，本發明能實現肌氨酸I和幹擾物2的完全分離而不相互幹擾，具有良好的色譜分辨能力。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進一步闡述，旨在說明本發明涉及的技術方案，揭示本發明的最佳實施例，使本領域技術人員能夠理解和實施本發明。但應當理解本發明並不限於公示的實施例，基於本發明的啟示，任何顯而易見的變換或替代，也應當被認為是落入本發明的保護範圍。標準曲線和質控配製用20%乙腈的水溶液配製，肌氨酸標準曲線濃度為100、200、500、1000、2000、5000 ng/mL。用20%乙腈的水溶液配製肌氨酸最低定量濃度(100 ng/mL)，低濃度(300 ng/mL)，中濃度(1200 ng/mL)，高濃度(4000 ng/mL)的質控樣品。另隨機取6份尿樣，作為方法檢測的實際尿液樣品。實施例中各物料的濃度除特別註明的以外，均為體積百分濃度。實施例I
檢測尿樣中肌氨酸濃度。(I)尿樣乙腈稀釋隨機取100 ii L尿樣，加入20 UL濃度為50 U g/mL肌氨酸_d3內標工作液，加入200 ii L乙腈,混旋30s, 15000 rpm離心3 min,棄沉澱,吸取100 y L上清液與300 u L乙腈混合，轉移至進樣瓶，供分析測試。(2)色譜分離以娃膠鍵合相填料柱(2. I X 100mm, 5 ii m, Hypersil, Thermo)為分析柱；流動相A為含0.02%甲酸和lmmol/L甲酸銨的水溶液，流動相B為乙腈，流動相A 流動相B的體積比為60% 40%,流速為0. 3mL/min,等度洗脫，進樣量5 u L，將肌氨酸從分析柱上洗脫。(3)質譜檢測採用電噴霧離子源串聯質譜儀(API 4000，美國AB Sciex公司)，在正離子檢測模式下，多反應監測掃描分析，肌氨酸檢測通道90/44 (±0.5 m/z)，肌氨酸-d3檢測通道93/47 (±0.5 m/z)。離子源參數設置為離子化電壓5000V ;離子化溫度550°C ;噴霧氣60 psi ;加熱氣60 psi ;氣簾氣25 psi ;碰撞氣中等；去簇電壓21V ;入口電壓4 V ;碰撞能20 V ;出口電壓 6 V。(4)結果計算方法為，以質譜檢測獲得的肌氨酸峰面積，與標準曲線比較，按內標法計算尿樣中肌氨酸的含量。建立肌氨酸的標準曲線，以肌氨酸濃度為X軸，以肌氨酸與內標峰面積比值為Y軸，經過1/X權重處理，在濃度100 ng/mL至5000 ng/mL範圍內，線性相關係數為0.9998 (圖I)。說明本發明提供的尿樣中肌氨酸的檢測方法線性關係良好。質控樣品中肌氨酸的檢測精密度(以相對標準偏差計)為3. 68% 10. 5%，準確度為92. 6% 103. 5%，說明本發明具有精密準確的定量能力。隨機取6份尿樣，編號為1、2、3、4、5、6，經過標準曲線計算，尿肌氨酸濃度分別為136>147>150>215>246>107 ng/mL,說明本發明能實現尿樣中肌氨酸的測定。尿樣中肌氨酸的色譜圖見圖2，圖中，I為尿樣中的肌氨酸的色譜峰，2為幹擾物的色譜峰。肌氨酸的色譜保留時間為5. 88 min。由圖2所示可見，本發明具有良好的色譜分辨能力，能實現肌氨酸I和幹擾物2的完全分離而不相互幹擾。實施例2
流動相A改為含改性劑0. 1%甲酸和lmmol/L甲酸銨的水溶液，流動相B為乙腈，流動相A 流動相B的體積比為60% 40%,等度洗脫，流速改為0. lmL/min,進樣量5 y L，其它同實施例I操作，同樣測定6份尿樣中肌氨酸濃度，分別為127、135、142、218、250、112 ng/mL，與實施例I測定結果接近，說明採用本實施例的流動相組合，同樣能實現肌氨酸的準確測定。實施例3
採用娃膠鍵合相填料柱(4. 6X 150mm, 5 iim,Hypersil, Thermo)為分析柱,流動相A改為含改性劑0. 4%甲酸和5 mmol/L甲酸銨的水溶液，流動相B為乙腈，流動相A 流動相B的體積比為60% 40%，等度洗脫，流速改為1.0 mL/min，進樣量10iiL。採用峰高法計算，其它同實施例I操作，同樣測定6份尿樣中肌氨酸濃度，分別為141、152、158、223、248、115ng/mL，與實施例I測定結果接近，說明採用本實施例的流動相組合，同樣能實現肌氨酸的準確測定。實施例4
將實施例I中流動相A改為含改性劑0. 2%甲酸和5mmol/L甲酸銨的水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫。洗脫程序為0 I min，流動相B體積佔總體積的30% ；1 2min，流動相B佔70% ；2 3min，流動相B佔90% ；3 6min，流動相B又改為佔30%。流速0. 3mL/min,進樣量5 u L，其它同實施例I操作，同樣測定6份尿樣中肌氨酸濃度，分別為133、142、147、210、241、109 ng/mL，與實施例I測定結果接近，說明採用本實施例的流動相組合，同樣能實現肌氨酸的準確測定。實施例5
對尿樣中肌氨酸測定方法進行方法學驗證。尿樣中肌氨酸的批內精密度(以相對標準偏差計)小於12%，準確度為87. 8% 99. 5%。批間精密度(以相對標準偏差計)小於10%，準確度為91. 4% 97. 4%。穩定性試驗結果表明，經預處理後的待測尿樣在自動進樣器中(4°C)放置48小時，尿樣室溫放置24小時、經過3次凍融都保持穩定、尿樣_20°C凍存49天，均保持穩定。I.標準曲線和定量範圍
按實施例I方法配製肌氨酸標準曲線，分3批次，每個濃度配製平行樣2次，進樣分析。以肌氨酸濃度為X軸，肌氨酸與內標峰面積之比為Y軸，進行線性回歸，建立回歸方程。由 圖I結果可見，肌氨酸具有良好的線性相關性。本法肌氨酸的最低定量限為100 ng/mL。2.準確度與精密度
按實施例I方法配製肌氨酸的質控樣品。每種濃度配製6份，在同一天內按上述樣品
處理方法及檢測分析條件進行處理和分析，計算批內精密度和準確度。按上述方法，分3天
配製3批樣品處理和分析，計算批間精密度和準確度，結果見表I。
^ I Wkfft戰爾墳獅《:體結I丨:3批次,鉍批n-6 I
I 丨 -內 I m巧 I；''i f..........................................................................................................................................r.................................................................................................................................................f..................................................... ........................................................................................................................................................................................................................I
；丨m *%..丨 I丨i
;-UM in!. ^ 1^i Wrk-H. i^:. .1；^ ;
I 。丨 I 走次 2 釀:V 3 Itr ；^； I丨丨 L;U 丨丨i
IIlMiI11.2 IU 54HI TOIM.KOImAI
IJlillI4.H5:.55 4.65D|iUyA^4J4|
Imm丨(O柳.5丨1廠考1丨4:4I
I捕_I1-6^TjH 5 26mK^IJIWJ5 JfiImi)|3.回收率
樣品濃度、處理方法和進樣條件都同精密度和正確度測定項下，測得的回收率為85. 9% 90. 5%o4.穩定性
樣品濃度、處理方法和進樣條件都同精密度和準確度測定項下，考察自動進樣器中48小時、凍融3次、室溫放置24小時、_20°C放置49天，穩定性試驗結果表明，經預處理後的待測尿樣和化學樣品的肌氨酸在自動進樣器中(4°C)放置48h，尿樣室溫放置24h、經過3次凍融都保持穩定、尿樣_20°C凍存49d，均保持穩定。尿樣中肌氨酸的最低定量限為100 ng/mL，100-5000 ng/mL濃度範圍內，線性相關係數大於0. 99，準確度在87. 8% 99. 5%之間，批內、批間精密度均小於12%。本方法可區分樣品中結構類似的幹擾物，樣本經稀釋後直接檢測，在特異性方面具有明顯優勢，且試劑成本低廉，適用於臨床大量樣本的檢測要求。
權利要求
1.一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法，其特徵在幹 (1)尿樣こ腈稀釋隨機取100μ L尿樣，加入20 μ L濃度為50 Ug/mL肌氨酸_d3內標工作液，加入200 μ Lこ腈,混旋30s, 15000 rpm離心3 min,棄沉澱，吸取100 μ L上清液與300 μ Lこ腈混合，轉移至進樣瓶，供分析測試； (2)色譜分離以矽膠鍵合相填料為分析柱，以水溶液為流動相Α，こ腈溶液為流動相B，所述A相中含有O. 02 O. 4%甲酸和I 5mmol/L甲酸銨作為改性劑，流速為O. I ImL/min,等度洗脫或者梯度洗脫，將肌氨酸從分析柱上洗脫； (3)質譜檢測採用電噴霧離子源串聯質譜儀，在正離子檢測模式下，多反應監測掃描分析，檢測肌氨酸； (4)結果計算以質譜檢測獲得的肌氨酸峰面積或峰高度，按同位素稀釋內標法計算肌氨酸在尿樣中的含量。
2.根據權利要求I所述尿樣中肌氨酸的定量檢測方法，其特徵在於所述步驟(3)質譜檢測離子源參數設置為肌氨酸檢測通道m/z 90/44,肌氨酸-d3檢測通道m/z 93/47，離子通道範圍為±0.5 m/z ο
全文摘要
本發明涉及一種尿樣中肌氨酸的定量檢測方法，屬化學定量分析領域，其步驟依次為(1)用有機溶劑乙腈對尿樣進行稀釋處理，加入內標工作液肌氨酸-d3，混旋離心，棄沉澱，吸取上清液與乙腈混合，供分析測試；(2)以矽膠鍵合相填料為分析柱，流動相乙腈水溶液中加入甲酸和甲酸銨作為改性劑，使肌氨酸與其他幹擾物質色譜分離；(3)採用電噴霧離子化串聯質譜儀，在正離子檢測模式下，檢測肌氨酸；(4)結果計算以獲得的峰面積或峰高度，按同位素稀釋內標法計算肌氨酸在尿樣中的含量。本發明方法的特異性、靈敏度和準確性高，且成本低廉、簡單快速，適用於臨床上低成本、大批量尿樣中肌氨酸定量檢測的要求。
文檔編號G01N30/02GK102662013SQ201210154590
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月18日 優先權日2012年5月18日
發明者餘琛, 劉罡一, 周菊珍, 張夢琪, 朱建民, 李水軍, 茅曉寅, 賈晶瑩, 酈俊生 申請人:上海市徐匯區中心醫院