一種提高短短芽孢桿菌細菌素生產水平的發酵方法與流程
2023-05-17 11:30:46 1
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種提高短短芽孢桿菌細菌素生產水平的發酵方法。
背景技術：
細菌素是某些細菌產生的具有抗菌活性的物質，主要成分為小分子多肽、蛋白質、酶、或蛋白質複合物，最早是由jacob於1953年提出，後經konisly進一步補充完善。近年來，種類繁多的抗生素在食品工業、動物生產、醫療、畜禽飼料等方面廣泛使用的負面效應日益突出，尋找新型抗生素得到了研究者的足夠重視，細菌素作為一種新型抗生素在抗菌方面，具有高效無毒、耐酸鹼、耐高溫、無殘留、幾乎無抗藥性的特性，是極具潛力的傳統抗生素替代品。目前除了商業化生產的細菌素nisin外、其它的細菌素還處在試驗及臨床研究階段，其主要受限於細菌素的製備成本高，產量較低，產量不穩定。上述問題在較大的程度限制了各類細菌素的鑑定及開發利用。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題在於針對上述現有技術中的不足，提供一種提高短短芽孢桿菌細菌素生產水平的發酵方法，用於高效生產短短芽孢桿菌細菌素。
本發明採用以下技術方案：
一種提高短短芽孢桿菌細菌素生產水平的發酵方法，先獲取菌種，然後將獲取的菌種接種到發酵培養基中進行發酵獲得短短芽孢桿菌細菌素，根據菌體發酵開始後前6～18h的對數生長期和菌體發酵開始18h後至發酵結束的穩定期生長狀況按照發酵時間進行分段調整。
優選的，所述獲取菌種具體為：將發酵菌種短短芽孢桿菌接種到種子培養基中29～31℃培養12～16h得種子液。
優選的，所述種子培養基包括葡萄糖、蛋白腖、牛肉膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀和tween-20，所述葡萄糖的質量百分含量為0.5％，所述蛋白腖的質量百分含量為1.2％、牛肉膏的質量百分含量為0.65％，氯化鈉的質量百分含量為0.4％，磷酸二氫鉀的質量百分含量為0.14％、tween-20的質量百分含量為0.1％，所述種子培養基的ph為7.2。
優選的，所述發酵具體為：將產短短芽孢桿菌細菌素的菌種種子液按照體積比為2:25～3:50比例接種到發酵培養基中進行短短芽孢桿菌細菌素髮酵。
優選的，在發酵開始後的前6～18h內發酵體系溫度調整為29～31℃，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溫度調為27～29℃。
優選的，在發酵開始後的前6～18h內發酵體系中溶氧調高為60％～80％，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溶氧調低為40％～60％。
優選的，在發酵開始後的前6～18h內發酵體系ph調整為7.3～7.5，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系ph調整為6.8～7.2。
優選的，所述發酵培養基按質量百分含量包括馬鈴薯澱粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％和吐溫-800.2％，所述發酵培養基的ph為6.8。
優選的，所述菌種為bncc138469短短芽孢桿菌。
與現有技術相比，本發明至少具有以下有益效果：
本發明通過對短短芽孢桿菌發酵過程菌種生長及產短短芽孢桿菌細菌素規律的的深入研究，提出了一種提高短短芽孢桿菌細菌素生產水平的發酵方法，包括獲取菌種和短短芽孢桿菌細菌素髮酵，其中，短短芽孢桿菌細菌素髮酵過程為將培養14h後的菌種培養液按照體積比為2:25～3:50的比例接種到5l發酵罐的發酵培養基中製成發酵體系開始短短芽孢桿菌細菌素髮酵；在短短芽孢桿菌細菌素髮酵過程中按時間分段調控發酵體系的溫度、溶氧、以及ph，通過以上參數的調整可使發酵前期菌種能夠快速穩定的生長，發酵中後期菌種能夠高效穩定的產短短芽孢桿菌細菌素，降低其它副產物的生成。
進一步的，本發明工藝菌種種子培養基的成分比如下：葡萄糖0.5％、蛋白腖1.2％、牛肉膏0.65％、氯化鈉0.4％、磷酸二氫鉀0.14％、tween-200.1％，在此營養成分比下，製備的發酵所用種子液中菌種的生長繁殖更快，菌種的活力達到最高。
進一步的，本發明工藝根據產短短芽孢桿菌細菌素菌種的生長及產素規律，提出了分段控制發酵過程參數，有效的為菌種前期生長及後期產素提供了良好的條件，很大程度上提高了短短芽孢桿菌細菌素的生產水平，並且短短芽孢桿菌細菌素產量穩定，發酵培養基營養配方主要原料廉價易得，節省成本，適合工業規模化生產。
進一步的，本發明工藝菌種發酵培養基的成分比如下：馬鈴薯澱粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、tween-200.8％、tween-800.2％。在此營養成分比下，短短芽孢桿菌代謝分泌短短芽孢桿菌細菌素的活力更強，產量更高。
下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
附圖說明
圖1為採用本方法發酵對短短芽孢桿菌素抑菌活力的影響示意圖。
具體實施方式
本發明提供了一種提高短短芽孢桿菌細菌素生產水平的發酵方法，對短短芽孢桿菌的代謝規律進行深入研究，根據不同營養調節因子對短短芽孢桿菌菌株產短短芽孢桿菌細菌素量的影響不同，對發酵營養配方進行調整，同時根據菌體對數生長期和菌體穩定期的生長狀況的不同，對發酵條件比如溫度、溶氧和發酵體系ph等按照發酵時間進行分段調整，達到提高短短芽孢桿菌細菌素產量的目的。
本發明提高短短芽孢桿菌細菌素生產水平的發酵方法，包括獲取菌種以及將獲取的菌種接種到最適發酵培養基中進行發酵獲得短短芽孢桿菌細菌素，在短短芽孢桿菌細菌素髮酵過程中，在發酵開始後的前6～18h為菌種的菌體對數生長期，發酵開始18h後至發酵結束為菌種的菌體穩定期，根據菌體對數生長期和菌體穩定期生長狀況的不同對發酵條件按照發酵時間進行分段調整。
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系溫度調整為29～31℃，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溫度調為27～29℃；
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系中溶氧調高為60％～80％，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溶氧調低為40％～60％；
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系ph調整為7.3～7.5，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系ph調整為6.8～7.2；
所述短短芽孢桿菌細菌素髮酵方法具體步驟如下：
(1)獲取菌種：將發酵菌種短短芽孢桿菌接種到種子培養基中30℃培養14h得種子液；
(2)將產短短芽孢桿菌細菌素的所述菌種種子液按照體積比為2:25～3:50比例接種到發酵培養基中進行短短芽孢桿菌細菌素髮酵。
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系溫度調整為30℃，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溫度調為28℃。
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系中溶氧調高為70％，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溶氧調低為50％。
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系ph調整為7.4，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系ph調整為7.0。
所述種子培養基包括葡萄糖、蛋白腖、牛肉膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀和tween-20，所述葡萄糖的質量百分含量為0.5％，所述蛋白腖的質量百分含量為1.2％、牛肉膏的質量百分含量為0.65％，氯化鈉的質量百分含量為0.4％，磷酸二氫鉀的質量百分含量為0.14％、tween-20的質量百分含量為0.1％，所述種子培養基的ph為7.2。
所述發酵培養基按質量百分含量包括馬鈴薯澱粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％和吐溫-800.2％，所述發酵培養基的ph為6.8。
所述菌種為短短芽孢桿菌(bncc138469)。
根據上述方法進行短短芽孢桿菌細菌素髮酵：
短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力測定
本發明涉及的細菌素活力測定為杯碟抑菌圈法測定：指示菌為金黃色葡萄球菌cicc21600，短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力表示方法(效價值au/ml)；將發酵上清液用ph6.8的tris-hcl緩衝液進行二倍系列稀釋，取樣200μl進行抑菌實驗，以觀察不到抑菌圈出現的最高稀釋度定義為一個活力單位(1au)，其倒數即為原發酵液短短芽孢桿菌細菌素的效價值au/ml。
短短芽孢桿菌細菌素產量的測定
將發酵上清液(1l)採用旋轉蒸發儀在0.1mpa，45℃的條件下濃縮至400ml，80％乙醇沉澱，透析除鹽24h，sephadexg-50凝膠純化，冷凍乾燥20h，得粉末狀短短芽孢桿菌細菌素，稱其質量。
實施例1
(1)菌種獲取：將短短芽孢桿菌株接種於斜面，於30℃恆溫培養箱中培養，然後將斜面培養基上活化後的菌株製備成濃度為3×106個/ml。
菌懸液，按照2％的接種量接種於新鮮的種子培養基中，於30℃，200rpm的搖床上震蕩培養。
(2)將培養14h後的種子液按照6％接種量接種至新鮮的發酵培養基中(5l發酵罐裝液量3.6l)進行培養，在短短芽孢桿菌細菌素髮酵過程中，在發酵開始後的前6～18h為菌種的菌體對數生長期，在發酵開始後的18h直至發酵結束為菌種的菌體穩定期，根據菌體對數生長期和菌體穩定期生長狀況的不同對發酵條件按照發酵時間進行分段調整。
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系溫度調整為30℃，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溫度調為28℃；
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系中溶氧調高為70％，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溶氧調低為50％；
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系ph調整為7.4，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系ph調整為7.0；
發酵50h結束，採用短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力測定方法測定發酵液中短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力，得到短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力為814.08au/ml。同時採用短短芽孢桿菌細菌素產量的測定方法測得短短芽孢桿菌細菌素產量為12.72g/l。
其中，發酵過程中採用1mol/l的hcl調節發酵液的ph。
短短芽孢桿菌細菌素最適發酵培養基成分組成：馬鈴薯澱粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％、吐溫-800.2％，初始ph為6.8。
實施例2
(1)菌種獲取：將短短芽孢桿菌株接種於斜面，於30℃恆溫培養箱中培養，然後將斜面培養基上活化後的菌株製備成濃度為3×106個/ml。
菌懸液，按照2％的接種量接種於新鮮的種子培養基中，於29℃，220rpm的搖床上震蕩培養。
(2)將培養12h後的種子液按照7％接種量接種至新鮮的發酵培養基中(5l發酵罐裝液量3.6l)進行培養，在短短芽孢桿菌細菌素髮酵過程中，在發酵開始後的前6～18h為菌種的菌體對數生長期，在發酵開始後的18h直至發酵結束為菌種的菌體穩定期，根據菌體對數生長期和菌體穩定期生長狀況的不同對發酵條件按照發酵時間進行分段調整。
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系溫度調整為29℃，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溫度調為27℃；
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系中溶氧調高為60％，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溶氧調低為40％；
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系ph調整為7.3，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系ph調整為6.8；
發酵54h結束，採用短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力測定方法測定發酵液中短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力，得到短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力為726.4au/ml。同時採用短短芽孢桿菌細菌素產量的測定方法測得短短芽孢桿菌細菌素產量為11.46g/l。
其中，發酵過程中採用1mol/l的hcl調節發酵液的ph。
短短芽孢桿菌細菌素最適發酵培養基成分組成：馬鈴薯澱粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％、吐溫-800.2％，初始ph為6.8。
實施例3
(1)菌種獲取：將短短芽孢桿菌株接種於斜面，於30℃恆溫培養箱中培養，然後將斜面培養基上活化後的菌株製備成濃度為3×106個/ml。
菌懸液，按照2％的接種量接種於新鮮的種子培養基中，於31℃，180rpm的搖床上震蕩培養。
(2)將培養16h後的種子液按照8％接種量接種至新鮮的發酵培養基中(5l發酵罐裝液量3.6l)進行培養，在短短芽孢桿菌細菌素髮酵過程中，在發酵開始後的前6～18h為菌種的菌體對數生長期，在發酵開始後的18h直至發酵結束為菌種的菌體穩定期，根據菌體對數生長期和菌體穩定期生長狀況的不同對發酵條件按照發酵時間進行分段調整。
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系溫度調整為31℃，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溫度調為29℃；
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系中溶氧調高為80％，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系溶氧調低為60％；
在發酵開始後的前6～18h內發酵體系ph調整為7.5，發酵開始18h後至發酵結束髮酵體系ph調整為7.2；
發酵58h結束，採用短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力測定方法測定發酵液中短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力，得到短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力為747.6au/ml。同時採用短短芽孢桿菌細菌素產量的測定方法測得短短芽孢桿菌細菌素產量為11.12g/l。
其中，發酵過程中採用1mol/l的hcl調節發酵液的ph。
短短芽孢桿菌細菌素最適發酵培養基成分組成：馬鈴薯澱粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％、吐溫-800.2％，初始ph為6.8。
另外，請參閱圖1，為採用本工藝發酵對短短芽孢桿菌素抑菌活力的影響，其中，1未採用本工藝發酵抑菌直徑18.2mm，2為採用本工藝發酵抑菌直徑24.6mm，ck1為無菌水，ck2為空白髮酵培養基，生產階段中對發酵過程不進行控制以及對種子培養基及發酵培養基成分組成不做調整作為空白實驗，經比較，採用本發明方法進行實施案例1、2、3，即在不同發酵工藝條件下短短芽孢桿菌細菌素髮酵，獲得的短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力及其產量與未採用本發明方法發酵獲得的短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力及其產量高低如下表1、2、3所示。採用本發明方法進行實施案例1、2、3，短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力及其產量分別比未採用本發明方法提高了59％和48.9％、46.1％和38.7％、48.3％和36.1％。
根據實施例1得出下表
表1為是否採用本發明方法細菌素抑菌活力及產量的比較
根據實施例2得出下表
表2為是否採用本發明方法細菌素抑菌活力及產量的比較
根據實施例3得出下表
表3為是否採用本發明方法細菌素抑菌活力及產量的比較
表4為種子液製備培養基成分比改進前後對菌體生長的影響
能夠得出在此營養成分比下，製備的發酵所用種子液中菌種的生長繁殖更快，菌種的活力達到最高。
表5為本發酵工藝所用發酵培養基營養成分優化前後對短短芽孢桿菌細菌素抑菌活力及產量的影響(舊工藝下測定)
本發明中所用的短短芽孢桿菌(bncc138469)由北納創聯生物技術有限公司(bncc)購得。
以上內容僅為說明本發明的技術思想，不能以此限定本發明的保護範圍，凡是按照本發明提出的技術思想，在技術方案基礎上所做的任何改動，均落入本發明權利要求書的保護範圍之內。