一種用於b細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術的製作方法
2023-05-17 20:06:01 4
專利名稱：一種用於b細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽陣列合成技術，尤指一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術。
背景技術：
在後基因組時代，科學家已經把研究重心從基因組研究轉向蛋白質功能研究，從分子整體水平對蛋白質的組成及其活動規律等生物學功能進行研究，並探索人類健康和疾病的奧秘，即蛋白質組學。對蛋白質與蛋白質或其他物質(如核酸、多糖、化學物等)相互關係的研究是蛋白質組學中的關鍵熱點，而多肽技術正是這關鍵研究熱點的核心技術之一。多肽陣列是一種新型生物晶片，是後基因時代揭示各種疾病和生化現象的最直接的研究技術。通過該技術平臺的軟體設計系統和自動化設備，可以將任意設計的胺基酸序列一多肽，在經過特殊處理的晶片上予以高密度地原位合成，每張晶片可承載幾千個甚至更多的原位合成多肽。該陣列技術可以根據已知蛋白的胺基酸序列，按序列漂移原則在晶片上原位合成多肽胺基酸序列，或者也可以根據待測物質的結構任意合成胺基酸序列，並將這些多肽按一定次序高密度地排列在晶片上，然後將測試物質(如抗體、血清、靶蛋白等)和晶片反應，經過免疫或反射等檢測技術發現與測試物質有結合反應的位點/域；同時，結合反應的數據可以輸入計算機進行三維結構處理，從而尋找到蛋白質與測試物質的結合部位。另外，該技術可以根據目標蛋白質設計多肽抑制物或激動劑，使得新藥發現的過程大為縮短。多肽陣列技術被認為是後基因組時代與基因晶片、蛋白晶片相蓖美的新型蛋白位點檢測技術，而在疫苗、藥物、診斷試劑等研發領域具廣闊的應用前景。
發明內容
為解決上述技術問題，本發明提供一種高密度、高通量、可同時測定上萬個多肽相關相互作用的合成技術。本發明是一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，包括以下步驟:I)多肽晶片的合成，具體包括:1.1多肽微陣列晶片上的多肽合成:用半自動合成儀吸取足量的胺基酸活化溶液點印於纖維素膜上，進行多肽點合成反應；1.2多肽微陣列晶片合成中側鏈鈍化；1.3多肽微陣列晶片合成中每層Fmoc保護基團的去除；1.4多肽微陣列晶片合成過程中的染色；1.5重複1.2至1.4步驟繼續合成多肽微陣列晶片，按照預先設定的程序，直至多肽合成完成；1.6將完成最後一層胺基酸合成的多肽微陣列晶片膜置於-20°C冰箱保存或直接進行下一步反應；2)多肽側鏈保護基團的去除；
3)多肽晶片的雜交反應。所述步驟1.1中的的胺基酸活化溶液的配製方法為:I)配製胺基酸激活劑:以DMF為溶劑，配製0.5M DIC溶液；2)配製各種胺基酸儲備液溶液:以DMF為溶劑，配製0.5M HOBt溶液，再將配製好的0.5M的HOBt溶液作為溶劑分別配製不同種類的Fmoc保護胺基酸，使溶液達到濃度為
0.5M的胺基酸儲備液；3)配製胺基酸激活溶液:用步驟I)中配製0.5M的DIC胺基酸激活劑和步驟2)中各種胺基酸儲備液溶液以1:1的比例混合，所得溶液即濃度為0.25M的胺基酸激活溶液。所述胺基酸激活溶液配製後室溫靜置15min以上使用。還包括步驟4)多肽微陣列晶片的再生。所述步驟1.2多肽微陣列晶片合成中側鏈鈍化的方法為:在多肽微陣列晶片合成每一層結束後，纖維素膜正面朝下置於玻璃平皿中，用鈍化溶液I完全浸潤IOmin後，棄去鈍化溶液I，加入鈍化溶液II，再次靜置lOmin，棄去鈍化溶液II，將纖維素膜正面朝上，力口入DMF溶液，再震蕩洗膜6次，每次2min，所述鈍化溶液I為2%乙酸酐的DMF溶液，所述鈍化溶液II為含2%酸酐、2%二異丙基胺的 DMF溶液。所述步驟1.3多肽微陣列晶片合成中每層Fmoc保護基團的去除方法為:多肽微陣列晶片合成中側鏈鈍化後，將纖維素膜放入新的玻璃平皿中，加入去Fmoc保護基團溶液後震蕩反應去除Fmoc氨基保護基團，此步驟重複兩次，每次lOmin，之後用DMF溶液震蕩洗膜6次，每次2min ;再用無水乙醇震蕩洗膜兩次，每次2min，室溫晾乾，所述去Fmoc保護基團溶液為含20% Piperidine的DMF溶液。所述步驟1.4多肽微陣列晶片合成過程中的染色方法為:在多肽微陣列晶片合成中每層Fmoc保護基團的去除後，將纖維素膜放入新的玻璃平皿中，加入足量無水乙醇完全浸沒纖維素膜，並加入5-6滴溴酚藍染色溶液，搖動染色2min至膜上呈現藍色多肽點時用無水乙醇震蕩洗膜2-5次直至洗液無藍色出現，取出纖維素膜室溫晾乾或者使用冷風從晶片反面使纖維素膜乾燥，所述溴酚藍染色溶液為含0.1%溴酚藍的乙醇溶液。所述步驟步驟2)多肽側鏈保護基團的去除方法為:I)將完成最後一層胺基酸合成的多肽晶片膜，面向上置於玻璃平皿中，去保護基溶液浸沒，搖動反應兩次，每次5min ;此後，用DMF溶液搖動衝洗纖維素洗膜4次，每次2min ;再用DCM洗膜3次，每次2min，所述去保護基溶液為含20% Piperidine的DMF溶液；2)將玻璃平皿中殘餘DCM溶液棄盡，多肽晶片膜完全浸入cocktail I溶液中後蓋嚴玻璃蓋，置於通風櫥中靜置反應30min,所述cocktail I溶液為5%的去離子水,3%的三異丙基矽烷，I %的濃度為90 %的苯酚溶液，I %的二氯甲烷及90 %的TFA溶液混合製成；3)倒出盒中cocktail I溶液，使用DCM溶液震蕩洗滌盒中膜片5次，每次2min，完全洗淨cocktail I殘液；4)棄盡洗膜盒中殘餘DCM溶液，多肽晶片膜完全浸入cocktail II液體中後蓋嚴，置於通風櫥中靜置反應2h，所述cocktail II為2%去離子水，3%三異丙基矽烷，I %濃度為90%的苯酚溶液，44% DCM，及50% TFA混合製成；5)倒出盒中TFA cocktail II溶液，使用DCM溶液震蕩洗膜5次，每次2min ;用DMF洗膜3次，每次2min完全洗淨cocktail II殘液，之後用無水乙醇溶液震蕩洗膜5次，每次2min ；6)使用吹風機涼風乾燥多肽晶片膜後，密封於乾淨塑膠袋中置於-80°C冰箱長期保存；或者置於_20°C冰箱中待用。所述步驟3)多肽晶片的雜交反應的方法為:I)多肽微陣列晶片活化:將乾燥的多肽微陣列晶片膜，置於玻璃平皿中使用無水乙醇震蕩洗滌3次，每次5min，活化多肽微陣列晶片；2)多肽晶片平衡:活化後多肽微陣列晶片膜放入玻璃平皿中，使用TBS-T溶液震蕩洗滌3次，每次lOmin，平衡膜片使膜片的微環境與平衡液相似，所述TBS-T溶液為將Tween20加入TBS溶液中並且使Tween20濃度為0.2%的溶液；3)多肽晶片封閉:將平衡後的多肽微陣列晶片膜放入平皿中，加入封閉液，室溫震蕩封閉4h，所述封閉液為以TBS-T溶液作為溶劑配製含蔗糖5%、脫脂奶粉4%的封閉液；4)使用TBS-T溶液震蕩洗滌膜一次，5min，洗去微陣列晶片膜表面附著的封閉液；5)使用TBS-T封閉液稀釋樣品溶液使之含有的總蛋白量終濃度為0.1-lug/ml的反應溶液，將多肽微陣列晶片膜與反應溶液4°C震蕩孵育過夜或室溫震蕩孵育至少2h充分反應;6)使用TBS-T溶液震蕩洗膜3次，每次5min ；7)用封閉液稀釋HRP 標記的二抗溶液至終濃度為0.1-0.5ug/ml的反應溶液，將多肽晶片膜置於反應液中震蕩孵育2h ；8)使用TBS-T溶液震蕩洗膜3次，每次5min ；9)棄去多肽晶片膜上多餘緩衝溶液，在膜上滴加化學發光反應液，反應液完全覆蓋膜片表面後充分反應2min，保持膜片溼潤；10)將膜片放入化學發光檢測儀中掃描膜片上發光斑點，保存掃描圖片；11)使用TBS-T溶液震蕩洗膜一次，5min，使用去離子水洗膜三次，每次5min ;洗完後可進行膜再生。所述步驟4)多肽微陣列晶片的再生的方法為:I)用足量去離子水洗多肽微陣列晶片膜三次，每次5min ;用足量DMF洗滌多肽微陣列晶片膜三次，每次5min，取出膜片表面粘附的雜質；2)用足量再生液A浸潤多肽微陣列膜片，放入密閉容器內，室溫，過夜，使多肽微陣列膜片上的蛋白質變性脫離下來，所述再生液A為；用去離子水配製足量的蛋白變性液使其含有濃度為8M的尿素、質量分數I %的SDS、體積比為0.1 %巰基乙醇，即為再生溶液A ；3)用25ml再生液B洗膜三次，每次lOmin，將變性完成後的蛋白洗脫下來，再生液B為；用去離子水配製足量洗滌溶液使之含有體積比為50%乙醇、體積比為10%乙酸即為再生溶液B ；4)用25ml無水乙醇洗膜二次，每次lOmin，冷風吹乾或室溫晾乾膜；5)再生膜可_20°C保存或者置於_80°C保存或者直接用於免疫印跡實驗。本發明的有益技術效果在於:
1.高密度、高通量:可同時測定上萬個蛋白-多肽生化反應。2.高特異性:深層揭示蛋白結合機制，準確定位抗體特異表位和蛋白結合區域。3.成本低、周期短、操作簡單:基於化學合成的多肽陣列晶片成本為基於生物培養的抗體晶片、全蛋白晶片的數百分之一。4.準確可靠(純度穩定、結果明確、直觀、易分析)。5、高速陣列膜合成:採用自控機器人逐層胺基酸點膜技術，比多肽逐點點膜技術速度提高几十倍。6、介質-多肽分子「立式」固定:與多數其他多肽晶片合成採用的「臥式」分子固定方式相比，更接近於生物液相反應環境。
圖1:本發明單張晶片示意圖表。
圖2:圖編號為N的陰性實驗結果(血吸蟲病人血清印跡反應實驗)。
圖3:圖編號為L的血吸蟲病人血清印跡反應實驗結果。
圖4:圖編號為C的重度血吸蟲病人血清印跡反應實驗結果。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。本發明是多肽微陣列晶片的合成與生物樣本檢測技術。採用軟體設計多肽微陣列，採用自控機器人逐層胺基酸點膜技術進行多肽微陣列的化學合成。合成多肽微陣列可用於實驗室的常規分子生物學試驗，例如尋找藥物的靶位點、蛋白質相互作用機理研究、篩查特定疾病試劑盒，建立與某種疾病相關的多肽資料庫、探討蛋白質作用的機理等等。1、胺基酸儲備液、工作溶液的製備本發明採用邊配製邊用的方法，提高多肽微陣列晶片上胺基酸的結合效率；並且相較於應用與活化胺基酸溶液大大節省成本。1.1胺基酸激活劑的配製以DMF為溶劑，配製0.5M DIC(註解:DIC，二異丙基碳化二亞胺diisopropylcarbodiimide,MW126.2)溶液，所得溶液即為胺基酸激活劑。此濃度的胺基酸激活液可與0.5M的胺基酸溶液等體積混合得到0.25M的活化的胺基酸溶液，操作方便易行。此配置方法得到的溶液是為了製作多肽微陣列專門優化處理的最佳試劑比例。1.2各種胺基酸儲備液溶液的配製稱取一定量的HOBt用DMF為溶劑溶解，完全溶解後，加DMF定量，使配製的HOBt溶液濃度達到0.5M。以配好的0.5M的HOBt溶解作為溶劑分別配製不同種類的Fmoc保護胺基酸，配製完成後使他們濃度為0.5M的胺基酸儲備液。由於胺基酸溶液沒有被DIC激活，處於相對穩定的水平，此儲備液可在_20°C保存至少一周；下表給出各種Fmoc保護的胺基酸的分子量，和配製2.5ml、5ml、10ml胺基酸儲備液所需的Fmoc保護的胺基酸的質量供操作者參考。這樣就不必每次合成前配製胺基酸溶液，可大大降低實驗工作量量。
權利要求
1.一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，包括以下步驟: 1)多肽晶片的合成，具體包括: 1.1多肽微陣列晶片上的多肽合成:用半自動合成儀吸取足量的胺基酸活化溶液點印於纖維素膜上，進行多肽點合成反應； 1.2多肽微陣列晶片合成中側鏈鈍化； 1.3多肽微陣列晶片合成中每層Fmoc保護基團的去除； 1.4多肽微陣列晶片合成過程中的染色； 1.5重複1.2至1.4步驟繼續合成多肽微陣列晶片，按照預先設定的程序，直至多肽合成完成； 1.6將完成最後一層胺基酸合成的多肽微陣列晶片膜置於_20°C冰箱保存或直接進行下一步反應； 2)多肽側鏈保護基團的去除； 3)多肽晶片的雜交反應。
2.根據權利要求1所述的一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，所述步驟1.1中的的胺基酸活化溶液的配製方法為: 1)配製胺基酸激 活劑:以DMF為溶劑，配製0.5M DIC溶液； 2)配製各種胺基酸儲備液溶液:以DMF為溶劑，配製0.5M HOBt溶液，再將配製好的0.5M的HOBt溶液作為溶劑分別配製不同種類的Fmoc保護胺基酸，使溶液達到濃度為0.5M的胺基酸儲備液； 3)配製胺基酸激活溶液:用步驟I)中配製0.5M的DIC胺基酸激活劑和步驟2)中各種胺基酸儲備液溶液以1:1的比例混合，所得溶液即濃度為0.25M的胺基酸激活溶液。
3.根據權利要求2所述的一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，所述胺基酸激活溶液配製後室溫靜置15min以上使用。
4.根據權利要求1所述的一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，還包括步驟4)多肽微陣列晶片的再生。
5.根據權利要求1所述的一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，所述步驟1.2多肽微陣列晶片合成中側鏈鈍化的方法為:在多肽微陣列晶片合成每一層結束後，纖維素膜正面朝下置於玻璃平皿中，用鈍化溶液I完全浸潤IOmin後，棄去鈍化溶液I，加入鈍化溶液II，再次靜置lOmin，棄去鈍化溶液II，將纖維素膜正面朝上，加入DMF溶液，再震蕩洗膜6次，每次2min，所述鈍化溶液I為2%乙酸酐的DMF溶液，所述鈍化溶液II為含2%酸酐、2%二異丙基胺的DMF溶液。
6.根據權利要求1所述的一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，所述步驟1.3多肽微陣列晶片合成中每層Fmoc保護基團的去除方法為:多肽微陣列晶片合成中側鏈鈍化後，將纖維素膜放入新的玻璃平皿中，加入去Fmoc保護基團溶液後震蕩反應去除Fmoc氨基保護基團，此步驟重複兩次，每次lOmin，之後用DMF溶液震蕩洗膜6次，每次2min ;再用無水乙醇震蕩洗膜兩次，每次2min，室溫晾乾，所述去Fmoc保護基團溶液為含20% Piperidine的DMF溶液。
7.根據權利要求1所述的一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，所述步驟1.4多肽微陣列晶片合成過程中的染色方法為:在多肽微陣列晶片合成中每層Fmoc保護基團的去除後，將纖維素膜放入新的玻璃平皿中，加入足量無水乙醇完全浸沒纖維素膜，並加入5-6滴溴酚藍染色溶液，搖動染色2min至膜上呈現藍色多肽點時用無水乙醇震蕩洗膜2-5次直至洗液無藍色出現，取出纖維素膜室溫晾乾或者使用冷風從晶片反面使纖維素膜乾燥，所述溴酚藍染色溶液為含0.1%溴酚藍的乙醇溶液。
8.根據權利要求1所述的一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，所述步驟步驟2)多肽側鏈保護基團的去除方法為: 1)將完成最後一層胺基酸合成的多肽晶片膜，面向上置於玻璃平皿中，去保護基溶液浸沒，搖動反應兩次，每次5min ;此後，用DMF溶液搖動衝洗纖維素洗膜4次，每次2min ;再用DCM洗膜3次，每次2min，所述去保護基溶液為含20% Piperidine的DMF溶液； 2)將玻璃平皿中殘餘DCM溶液棄盡，多肽晶片膜完全浸入cocktailI溶液中後蓋嚴玻璃蓋,置於通風櫥中靜置反應30min,所述cocktail I溶液為5%的去離子水,3%的三異丙基矽烷，I %的濃度為90 %的苯酚溶液，I %的二氯甲烷及90 %的TFA溶液混合製成； 3)倒出盒中cocktailI溶液，使用DCM溶液震蕩洗滌盒中膜片5次，每次2min，完全洗淨cocktail I殘液 ； 4)棄盡洗膜盒中殘餘DCM溶液，多肽晶片膜完全浸入cocktailII液體中後蓋嚴，置於通風櫥中靜置反應2h，所述cocktail II為2%去離子水，3%三異丙基矽烷，I %濃度為90%的苯酚溶液，44% DCM，及50% TFA混合製成； 5)倒出盒中TFAcocktail II溶液，使用DCM溶液震蕩洗膜5次，每次2min ;用DMF洗膜3次，每次2min完全洗淨cocktail II殘液，之後用無水乙醇溶液震蕩洗膜5次，每次2min ； 6)使用吹風機涼風乾燥多肽晶片膜後，密封於乾淨塑膠袋中置於-80°C冰箱長期保存；或者置於_20°C冰箱中待用。
9.根據權利要求1所述的一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，所述步驟3)多肽晶片的雜交反應的方法為: 1)多肽微陣列晶片活化:將乾燥的多肽微陣列晶片膜，置於玻璃平皿中使用無水乙醇震蕩洗滌3次，每次5min，活化多肽微陣列晶片； 2)多肽晶片平衡:活化後多肽微陣列晶片膜放入玻璃平皿中，使用TBS-T溶液震蕩洗滌3次，每次lOmin，平衡膜片使膜片的微環境與平衡液相似，所述TBS-T溶液為將TWeen20加入TBS溶液中並且使TWeen20濃度為0.2%的溶液； 3)多肽晶片封閉:將平衡後的多肽微陣列晶片膜放入平皿中，加入封閉液，室溫震蕩封閉4h，所述封閉液為以TBS-T溶液作為溶劑配製含蔗糖5%、脫脂奶粉4%的封閉液； 4)使用TBS-T溶液震蕩洗滌膜一次，5min，洗去微陣列晶片膜表面附著的封閉液； 5)使用TBS-T封閉液稀釋樣品溶液使之含有的總蛋白量終濃度為0.1-lug/ml的反應溶液，將多肽微陣列晶片膜與反應溶液4°C震蕩孵育過夜或室溫震蕩孵育至少2h充分反應； 6)使用TBS-T溶液震蕩洗膜3次，每次5min； 7)用封閉液稀釋HRP標記的二抗溶液至終濃度為0.1-0.5ug/ml的反應溶液，將多肽晶片膜置於反應液中震蕩孵育2h ； 8)使用TBS-T溶液震蕩洗膜3次，每次5min；9)棄去多肽晶片膜上多餘緩衝溶液，在膜上滴加化學發光反應液，反應液完全覆蓋膜片表面後充分反應2min，保持膜片溼潤； 10)將膜片放入化學發光檢測儀中掃描膜片上發光斑點，保存掃描圖片； 11)使用TBS-T溶液震蕩洗膜一次，5min，使用去離子水洗膜三次，每次5min;洗完後可進行膜再生。
10.根據權利要求4所述的一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，其特徵在於，所述步驟4)多肽微陣列晶片的再生的方法為: 1)用足量去離子水洗多肽微陣列晶片膜三次，每次5min;用足量DMF洗滌多肽微陣列晶片膜三次，每次5min，取出膜片表面粘附的雜質； 2)用足量再生液A浸潤多肽微陣列膜片，放入密閉容器內，室溫，過夜，使多肽微陣列膜片上的蛋白質變性脫離下來，所述再生液A為；用去離子水配製足量的蛋白變性液使其含有濃度為8M的尿素、質量分數1%的SDS、體積比為0.1 %巰基乙醇，即為再生溶液A ; 3)用25ml再生液B洗膜三次，每次lOmin，將變性完成後的蛋白洗脫下來，再生液B為；用去離子水配製足量洗滌溶液使之含有體積比為50%乙醇、體積比為10%乙酸即為再生溶液B ; 4)用25ml無水乙醇洗膜二次，每次lOmin，冷風吹乾或室溫晾乾膜； 5)再生膜可_20°C保存 或者置於_80°C保存或者直接用於免疫印跡實驗。
全文摘要
本發明是一種用於B細胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術，包括以下步驟1)多肽晶片的合成，用半自動合成儀吸取足量的胺基酸活化溶液點印於纖維素膜上，進行多肽點合成反應；2)多肽側鏈保護基團的去除；3)多肽晶片的雜交反應。本發明提供一種高密度、高通量、可同時檢測上萬個多肽相關相互作用的合成技術。本發明採用自控機器逐層胺基酸點膜技術進行多肽微陣列的化學合成。合成多肽微陣列可用於蛋白質間以及蛋白質與其它生物大分子間的相互作用研究，例如尋找抗體識別多肽序列、藥物的作用靶位點、蛋白質相互作用位點、篩查特定疾病相關蛋白的抗原表位，建立與某種疾病相關的多肽資料庫、探討蛋白質構效關係及作用機理等。
文檔編號G01N33/68GK103245788SQ201310093099
公開日2013年8月14日 申請日期2013年3月22日 優先權日2013年3月22日
發明者趙樹民, 鮑勇剛, 石松傳 申請人:趙樹民