一種培育抗蚜蟲的轉基因小麥的方法

2023-05-17 00:10:41

一種培育抗蚜蟲的轉基因小麥的方法
【專利摘要】本發明公開了一種培育抗蚜蟲的轉基因小麥的方法。本發明創新性的將含有掌葉半夏凝集素基因的重組表達載體導入目的小麥中，得到抗蚜的轉基因小麥，所述轉基因小麥對蚜蟲的抗性高於目的小麥，實驗證實，本發明的重組載體導入小麥中，得到19個轉基因小麥陽性株系。對這19個陽性株系的T3代依次進行了PCR、RT-PCR篩選鑑定以及抗蚜實驗，得到對蚜蟲具有良好抗性的轉基因小麥株系。在培育新的抗蚜小麥品種中有良好的應用前景。本發明方法也可應用於其他植物新品種的培育中。
【專利說明】一種培育抗蚜蟲的轉基因小麥的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及轉基因作物育種領域，特別涉及一種培育抗蚜蟲的轉基因小麥的方 法。

【背景技術】
[0002] 小麥是我國重要的糧食作物，蟲害一直是影響其品質和產量的重要因素。據報導， 每年全球糧食總產量因害蟲造成的損失超過10%。蚜蟲，屬半翅目，主要分布在北半球溫 帶地區和亞熱帶地區。目前世界已知約4700餘種，中國分布約1100種。其繁殖力很強，世 代重疊現象突出，生活史複雜。蚜蟲作為農業害蟲和植物病毒的傳播者，已經成為嚴重威脅 農業生產發展的重要害蟲之一，據研究在我國每年90%以上的麥田會不同程度發生蚜蟲災 害，致使小麥減產10% -30%。目前，對於小麥蚜蟲的防治仍主要使用化學殺蟲劑進行殺 除，由於此方法帶來的人類健康及環境汙染問題日益嚴重，並且花費巨大但效率不高。因此 更多的研究者把目光投向了抗蟲育種方面。其中利用基因工程獲得抗蚜蟲轉基因小麥的研 究尤為受到關注，成為培育小麥抗蚜蟲新品種的新的途徑。
[0003] 目前，已經克隆得到的抗蟲基因有許多種，根據它們的來源可分為三類：第一類 是從細菌中分離出來的抗蟲基因，主要是來自蘇雲金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt) 毒蛋白基因；第二類是從動物體內分離的毒素基因，主要有蠍毒素基因和蝴蛛毒素基因等； 第三類是從植物中分離出的抗蟲基因，主要為蛋白酶抑制劑基因、凝集素基因、澱粉酶抑 製劑基因等。
[0004] 在這三類抗蟲基因中，第一類轉Bt基因的作物由於具有特異性高、對哺乳動物無 害等特點發展迅速，80年代以來已經有許多商業化生產的例子。然而同時，其它非靶標害蟲 (主要是刺吸性害蟲）的種群發生數量卻明顯上升，危害日趨嚴重。另外，蘇雲金桿菌S內 毒素基因在植物中表達水平普遍較低，而且隨著轉基因植物在大田中的應用，昆蟲的抗性 或適應性問題也隨之產生，這也成為Bt基因在轉基因植物方面應用的挑戰問題。
[0005] 第二類從動物體內分離的毒素基因，尤其是蠍類毒素，由於多數能專一作用於昆 蟲，並具有對哺乳動物無害或毒性很小的特點，因而早在上世紀七、八十年代就引起了國內 外學者的關注，並在菸草、甘藍、楊樹等轉基因抗蟲方面取得了較好的成果。但是由於表達 抗昆蟲蠍毒素基因的重組杆狀病毒的研究安全性仍存在較大的爭議，因此離實際生產應用 尚有一定距尚。
[0006] 與其它兩類抗蟲基因相比，植物來源的抗蟲基因是來自於植物本身，因此此類轉 基因植物更容易被人們所接受，並且這類基因多具有更廣的抗蟲譜。目前植物來源的抗蟲 基因及其在作物基因育種中的應用日益受到人們的重視。其中，植物蛋白酶抑制劑比較成 功的例子僅限於轉化菸草、馬鈴薯等作物，在小麥、玉米、棉花、大豆等常見農作物方面的實 驗還不盡如人意。澱粉酶抑制劑的研究也多限於豆類、菸草等作物的效果較好。
[0007] 植物凝集素是近年來發現的一類很有前景的抗蚜基因，在自然界中廣泛存在。植 物凝集素是具有高度特異性糖結合活性的蛋白，能可逆地與單糖或寡糖結合，它可在胃腸 道中抵抗酶的降解，並和消化道表面的糖基受體結合，從而引起細胞和機體代謝發生改變。 目前，已經有多種植物凝集素被應用於各種重要作物的抗蟲研究。研究成果顯示，在作物 領域尤其是小麥的抗蟲研究方面，植物凝集素類的轉基因植物抗蟲效果較好。但是，目前 國內對於植物凝集素抗蟲的基因轉化研究大多集中在雪花蓮凝集素 （Galanthus nivalis Agglutinin，GNA)基因，在一定程度上影響了抗蟲的廣譜性並容易導致抗性害蟲產生，因 此，非常有必要發掘其他適於小麥抗蚜蟲的凝集素基因。天南星科半夏屬的三葉半夏和 掌葉半夏為我國特有的中草藥，研究表明三葉半夏和掌葉半夏塊莖的粗提液對蚜蟲有強 致死作用，粗提液的主要成分是植物凝集素蛋白（Pinellia ternate agglutinin, PTA和 Pinellia pedatisecta agglutnin, PPA)。已有研究表明，轉入的三葉半夏PTA基因的水稻 對蚜蟲和水稻褐飛蝨具有顯著抗性，顯示出了天南星科半夏屬植物凝集素在抗蟲基因工程 研究中的潛力。
[0008] 在糧食作物中，小麥屬於遺傳轉化最為困難的作物，加上轉基因研究起步較晚，基 因工程育種進程明顯落後於其它作物。但自1992年人類獲得第一株轉基因小麥以來，轉基 因小麥研究也已獲得了許多重大進展。目前國內外已有超過1〇〇例小麥轉基因的報導，其 中多數是將抗除草劑基因和抗病、抗蟲的基因轉入小麥。在這些報導中，半數以上是通過基 因槍法進行轉化，其餘多為利用花粉管通道法和農桿菌介導法進行小麥的基因轉化。還有 少數報導是利用PEG介導法、脂質體介導法、電激法、DNA注射法、離子束介導法等等。小麥 基因轉化的受體有幼胚、成熟胚、胚性愈傷組織、懸浮細胞、盾片組織、幼穗和花粉等。近幾 年發展起來的植物葉綠體轉化技術可使外源基因定嚮導入葉綠體基因組中並實現表達。葉 綠體遺傳轉化與傳統的核轉化相比具有許多優點：如高效表達外源基因、通過同源重組定 點整合方式導入外源基因從而消除了位置效應及基因沉默、能同時進行多基因表達、母系 遺傳方式可防止外源基因通過花粉擴散產生基因汙染、目的基因的表達具有葉片組織的特 異性，不會在果實中大量積累從而使得以籽實為食的轉基因植物的食用安全性大大增強 等。因此，葉綠體遺傳轉化愈來愈受到人們的重視，至今，已經在菸草、水稻、甜菜、番茄、大 豆、小麥、玉米、油菜、鹽藻、楊樹、衣藻等眾多物種方面利用葉綠體體系表達外源蛋白取得 了令人鼓舞的成果。所採用的葉綠體轉化方法主要有農桿菌介導轉化法、基因槍法、雷射微 束轉化法、花粉管導入法、PEG介導轉化法、玻璃珠法等等。
[0009] 目前，小麥基因轉化研究目前存在的主要問題：一是受體基因型範圍狹窄，農藝 性狀差；二是轉化目的基因少，報告基因多；三是缺乏適應大多數基因型的高效轉化體系； 四是轉基因後代穩定慢；五是標記基因的剔除困難。因此，拓寬小麥遺傳轉化的受體範圍， 利用適應當地生態環境的優良品種作為受體應該是今後的研究方向之一；研究適宜於不同 遺傳背景品種的高效愈傷誘導和再生體系是小麥基因轉化技術突破的關鍵；將一些控制優 質、抗病、抗逆和抗蟲的外源基因導入小麥，建立無標記基因轉化或標記基因剔除的技術 體系，將是今後小麥轉基因研究的重點；建立以單倍體為受體的轉基因技術體系將大大加 速基因純合過程，減少嵌合體形成，提高小麥基因轉化效率。
[0010] 本項目組從天南星科半夏屬掌葉半夏中克隆到一種新型植物凝集素（PPA)基因， 通過轉化菸草證實其確實具有很好的抗蚜蟲能力。本研究擬將這種具有自主智慧財產權的新 型有效凝集素抗蟲基因通過農桿菌侵染法導入小麥；通過田間和分子標記技術相結合的方 法，獲得抗蚜能力強的小麥新材料、新品系，培育抗蚜小麥新品種。因此，對豐富小麥抗蚜資 源、培育出適於推廣的優良抗蚜小麥品種具有重大意義。


【發明內容】

[0011] 為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的在於提供一種培育抗蚜蟲的轉基 因小麥的方法。
[0012] 為達到上述目的，本發明的技術方案為：
[0013] 一種培育抗蚜蟲的轉基因小麥的方法，該方法是將含有掌葉半夏凝集素基因的重 組表達載體導入目的小麥中，得到抗蚜的轉基因小麥，所述轉基因小麥對蚜蟲的抗性高於 目的小麥。
[0014] 進一步的，所述掌葉半夏凝集素基因是PPA基因，其序列被專利保護，申請號為 200910073815. 1，用PCR擴增PPA基因時，為了增強其轉化後在小麥中的表達量，在設計引 物的時候加入KOZAK序列GTCGCCACC，所述重組表達載體的出發質粒是pCambial380。
[0015] 進一步的，所述重組表達載體的構建方法如下：
[0016] 用EcoR I和BamH I酶切35S-T載體，得到含有35S基因的片段；用BamH I和 Hind III酶切KPPA-T載體，得到含有KPPA基因的片段；用Hind III和Bg II酶切⑶S-T載體， 得到含有GUS基因的片段；將這些片段依次插入到載體pCambial380的多克隆位點中，得到 所述重組表達載體命名為pCambial380-SKPG。
[0017] 進一步的，所述載體35S-T載體是將35S基因連接pGEM-T Easy vector得到，用 PCR擴增pCambial380的35S啟動子，所用的引物為
[0018] 5, -CCGAATTCCCCAACATGGTGGAGC-3，
[0019] 5，-CGGGATCCGCGAAAGCTCGAGAGAG-3，，
[0020] 擴增出的35S啟動子長度為0.8kb。
[0021] 進一步的，所述KPPA-T載體是將KPPA基因連接pGEM-T Easy vector得到，用PCR 擴增KPPA基因時，所用的引物為
[0022] 5, -CGGGATCCGTCGCCACCATGGCCTCCAAGCTC-3，
[0023] 5，-CCCAAGCTTCGCGGCAATTGG-3，，
[0024] 擴增出的KPPA長度為0· 8kb。
[0025] 進一步的，所述載體⑶S-T是將⑶S基因連接pGEM-T Easy vector得到，用PCR擴 增PTCK303的⑶S基因時，所用的引物為
[0026] 5' -CCCAAGCTTATGTTACGTCCTGTAGAAACC-3'
[0027] 5' -GAAGATCTTCATTGTTTGCCTCCCTG-3'，
[0028] 擴增出的⑶S長度為2. Okb。
[0029] 進一步的，所述目的小麥為石4185。
[0030] 相對於現有技術，本發明的有益效果為：
[0031] 本發明創新性的將含有掌葉半夏凝集素基因的重組表達載體導入目的小麥中，得 到抗蚜的轉基因小麥，所述轉基因小麥對蚜蟲的抗性高於目的小麥，實驗證實，本發明的重 組載體導入小麥中，得到19株轉基因小麥株系。對這19個陽性株系的T3代依次進行了 PCR、RT-PCR篩選鑑定以及抗蚜實驗，得到對蚜蟲具有良好抗性的轉基因小麥株系。在培育 新的抗蚜小麥品種中有良好的應用前景。本發明方法也可應用於其他植物新品種的培育 中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1表達載體pCambial380-SKPG的T-DNA區結構簡圖。LB，T-DNA左邊界； RB，T-DNA右邊界；CaMV35S，菸草花葉病毒35S啟動子；Nos, Nos終止子；HYG(R)，抗潮黴素 基因；KPPA，添加 KOZAK序列的PPA基因；GUS，β -葡萄糖苷酸酶基因（報告基因）。
[0033] 圖2轉基因小麥ΡΡΑ基因的PCR檢測結果。其中0為陰性對照；CK為陽性對照 (以質粒為模板擴增）；1_20為不同株系的小麥植株鑑定結果；Μ為Marker，從下到上依次 為 10(^口、25(^口、50(^口、75(^口、100(^口、200(^口，最亮條帶為75(^口。
[0034] 圖3部分轉基因小麥PPA基因的RT-PCR檢測結果。Μ為Marker,從下到上依次 為 10(^口、25(^口、50(^口、75(^口、100(^口、200(^口，最亮條帶為75(^口；1-6為4(：1'預基因擴增 結果；7-12為PPA基因擴增結果；1、7為非轉基因小麥；2-6,8-12為在DNA水平鑑定為陽性 的5個轉基因小麥。
[0035] 圖4苗期轉基因小麥接接種蚜蟲的鑑定結果圖。（a)為非轉基因小麥；(b)為轉基 因小麥；（c)為（a)圖局部放大；（d)為（b)圖局部放大。
[0036] 圖5轉基因小麥接種蚜蟲的鑑定結果圖。（a)為非轉基因小麥；(b)為轉基因小 麥；(c)為（a)圖局部放大；(d)為（b)圖局部放大。

【具體實施方式】
[0037] 下面結合附圖及具體實施例對本發明技術方案做進一步詳細描述。
[0038] 試驗例1、PPA基因的克隆和重組載體的構建
[0039] 1、PPA基因的克隆
[0040] 由河北省農林科學院經濟作物研究所克隆，克隆載體名稱為PBI122-PPA，已申請 專利。專利號碼為200910073815. 1。
[0041] 2、重組載體的構建
[0042] 1)用PCR擴增pCambial380(本實驗室保存載體）的35S啟動子，所用的引物為 5' -CCGAATTCCCCAACATGGTGGAGC-3' 和 5' -CGGGATCCGCGAAAGCTCGAGAGAG-3'，擴增出的 35S 啟動子長度為〇.8kb。將此基因連接pGEM-T Easy vector (購自promega公司），命名為 35S-T。
[0043] 2)用PCR擴增PBI122-PPA (河北農林科學院經濟作物研究所吳志明博士提供）的 掌葉半夏凝集素 PPA基因，為了增強其轉化後在小麥中的表達量，我們在設計引物的時候 加入 Κ0ΖΑΚ 序列 GTCGCCACC。所用的引物為 5 '-CGGGATCCGTCGCCACCATGGCCTCCAAGCTC-3 ' 和 5' -CCCAAGCTTCGCGGCAATTGG-3'，擴增出的 PPA 長度為 0. 8kb。將此基因連接 pGEM-T Easy vector，命名為 KPPA-T。
[0044] 3)用PCR擴增PTCK303 (本實驗室保存載體）的⑶S基因，所用的引物為5' -CCC AAGCTTATGTTACGTCCTGTAGAAACC-3' 和 5' -GAAGATCTTCATTGTTTGCCTCCCTG-3'，擴增出的⑶S 長度為2. Okb。將此基因連接pGEM-T Easy vector，命名為⑶S-T。
[0045] 4)用EcoR I和BamH I酶切35S-T載體，得到0. 8kb的片段後純化並插入到 pCambial380載體的EcoR I和BamH I酶切位點之間得到重組載體，將重組載體命名為 pCambial380_35S。
[0046] 5)用BamH I和Hind III酶切KPPA-T載體，得到0. 8kb的片段後純化並插入到 pCambial380-35S載體的BamH I和Hind III酶切位點之間得到重組載體，將重組載體命名為 pCambial380-35S-KPPA。
[0047] 6)用Hind III和Bg II酶切⑶S-T載體，得到2. Okb後插入至lj pCambial380-35S-KPPA載體的Hind III和Bg II酶切位點之間得到重組載體，將重組載體命 名為 pCambial380-35S-KPPA-GUS,簡寫做 pCambial380-SKPG。
[0048] 構建的表達載體pCambial380_SKPG的T-DNA區結構簡圖如圖1。
[0049] 試驗例2、抗蚜轉基因小麥的獲得
[0050] 1、表達載體轉化農桿菌
[0051] 1)農桿菌感受態的製備
[0052] 從-80°C冰箱取出凍存的農桿菌菌株GV3101，分別在Amp和Rif抗性、Kan和Rif 抗性、Rif抗性的LB平板上劃線。28°C倒置培養48h，若Amp+和Kan+的平板均無菌落長出， 此管菌株可以作為製備感受態的原始菌株。挑取Rif抗性的LB平板上的根癌農桿菌的單 菌落於3-5mL的含Rif抗性的YEB液體培養基中，28°C 200rpm震蕩培養過夜。取過夜的 菌液按1:50接種於50mL含Rif的YEB培養基中擴培，28°C繼續搖培約6 - 7h，至0D6QQ = 0. 4-0. 6取出。將搖培好的菌液放入冰中，冰浴30min。5 000g，4°C離心5min，棄去上清回收 菌體。向回收的菌體中加入10ml0. 15MNaCl，輕輕吹吸，使菌體在溶液中完全混勻。5 000g， 4°C離心5min，倒去上清，菌體用lmL20mM冰冷的CaCl2輕輕懸浮。每管200μ L分裝，加入 終濃度為20%的無菌甘油，混勻，並放入液氮中速凍後轉入一 70°C保存。
[0053] 2)表達載體轉化農桿菌
[0054] 從_70°C冰箱中取出製備的農桿菌的感受態細胞，並置於冰上，感受態細胞融化 後，將10 μ L的質粒DNA加入到200 μ L的農桿菌感受態細胞中，輕輕吹吸混勻，放於冰上 冰浴30min。將裝有感受態細胞的ΕΡ管放入液氮中速凍5min，隨即放入37°C恆溫水浴鍋 中保溫5min。取出離心管，在管中加入lmL無抗生素的YEB液體培養基，28°C 150rpm搖培 3-5h，同時製備含有（Kan+100mg/L，Rifl25mg/L)抗性的YEB固體培養基。室溫5 OOOrpm， 離心5min，棄去部分上清，用大槍輕輕吹吸混勻，使菌體均勻分布在培養基中，並塗布在含 有Kan+的YEB固體培養基上，在恆溫培養箱中，28°C倒置培養24-48h，均可見單菌落。
[0055] 農桿菌不是天然保存質粒的菌株，質粒在農桿菌中不能高拷貝的複製，致使質粒 提出來的濃度很低，因而我們採用恢復動員的方法，對質粒進行鑑定：從農桿菌中提出質粒 DNA，隨後將質粒DNA轉回到大腸桿菌中（DH5 α )，並挑取大腸桿菌的單菌落，將其放入液體 培養基中搖培，提取質粒DNA進行酶切鑑定。結果顯示載體pCambial380-SKPG已成功轉入 農桿菌中。
[0056] 2、轉化小麥
[0057] 1)外植體的獲得
[0058] 取開花後約10-12天的小麥幼胚，幼胚的胚長直徑是1mm至1. 5mm,將去穎殼的幼 嫩的種子用75 %的酒精浸泡30s，隨後用無菌水衝洗3次，用0. 1 %升汞消毒5min，再用無 菌水衝洗3次，最後種子在無菌蒸餾水中浸泡15min，用鑷子小心取出幼胚，盾片朝上，接種 於愈傷誘導培養基中（MS+2, 4-D2mg/L+鹿糖30g/L+arger8g/L)，每瓶接20粒幼胚，將接種 好的胚放置在25°C暗箱中培養。
[0059] 小麥幼胚愈傷組織在誘導時主要有兩種形態：一種是淡黃色緻密的狀態，另一種 則是白色鬆軟的狀態，前者稱為胚性愈傷組織。胚性愈傷的主要特點是：質地鬆脆緻密，色 澤淡黃，在分化的過程中，該類型的愈傷具有較強的分化能力，成苗率也比較高。後者是非 胚性愈傷組織，它由胚部產生，質地鬆軟，只有少數能分化出苗。因而，胚性愈傷組織是作為 農桿菌轉化的最適材料。
[0060] 2)農桿菌介導轉化與培養
[0061] 選取繼代培養基中淡黃色緻密的愈傷組織，並將其轉入到鋪有紗布的空的平板 中，隨即倒入含有菌體的重懸液，並使愈傷組織完全浸泡在重懸液中（1/10MS+2, 4-D2mg/ L+CH100mg/L+MES400mg/L+AS200 μ mol/L+麥芽糖40g/L)，保證農桿菌與愈傷組織完全的 接觸。浸泡40min，用事先在空平板中鋪好的紗布將愈傷託起，並空幹愈傷組織中的水分， 然後將愈傷組織轉移到鋪有三層濾紙的空平板中，封好平板，置於24°C黑暗條件下共培養 2-3 天。
[0062] 3)愈傷組織的脫菌以及恢復培養
[0063] 共培養2-3天的愈傷組織放入鋪有紗布的空的平板中，然後倒入含有抗生素 Timentin 的脫菌液（MS+2, 4-D2mg/L+CH100mg/L+麥芽糖 40g/L+Timentin500mg/L)，並使脫 菌液完全浸泡愈傷組織，使脫菌更徹底。浸泡40min，隨即用事先鋪好在平板中的紗布將愈 傷組織託起，並轉移到滅菌的濾紙中，並在超淨臺中吹30min，使愈傷組織上的脫菌液吹乾， 防止愈傷組織在恢復培養基中出現滲水的現象。將吹乾後的愈傷組織轉移到含有抗生素的 恢復培養基中（MS+2, 4-D2mg/L+CH100mg/L+ 麥芽糖 40g/L+Timentin300mg/L+arger8g/L)， 24 °C黑暗培養一周。
[0064] 4)抗性愈傷篩選
[0065] 在抗性愈傷恢復一周後，將其轉入到含有潮黴素篩選培養基中（MS+2,4-D2mg/ L+CH100mg/L+麥芽糖 40g/L+Hyg50mg/L+Timentin300mg/L+arger8g/L),並轉移到 25°C (12h/12h光照/黑暗）進行篩選培養2周。篩選兩周後，進行第二次篩選，將愈傷組 織再次轉入到第二次篩選培養基中（MS+2, 4-D2mg/L+CH100mg/L+麥芽糖40g/L+Hyg60mg/ L+Timentin300mg/L+arger8g/L)培養 2 周。
[0066] 5)愈傷組織的分化及再生
[0067] 篩選4周後，將篩選出的愈傷組織繼代到分化培養基中（MS+KT2mg/L+NAA0. lmg/ L+ 麥芽糖 40g/L+Timentin300mg/L+arger8g/L)，並轉移至溫度為 25°C (12h/12h 光照 / 黑 暗）條件下培養，每4周繼代一次。潮黴素對分化有潛在的影響，因而在配置分化培養基的 時候，不加潮黴素，但是必須要加 Timentin對農桿菌進行抑制作用。2周後在分化培養基中 的愈傷組織表面會出現綠點，3周後，有些綠點會形成幼苗，而有些綠點會形成根。當幼苗發 育到2-3cm時，可以將帶有小苗的愈傷接種到壯苗培養基中（2/3MS大量+其餘MS的成分 不變+ΝΑΑ0. 5mg/L+麥芽糖40g/L+Timentin300mg/L+植物凝膠3g/L)，其主要作用是促進 小苗生根。生根壯苗後即可將麥苗轉移到春化箱中進行春化，4°C，14/10光照培養1個月。 將接有麥苗的錐形瓶置於將要移栽的環境中，6天後去除錐形瓶上的封口膜，再培養1天即 可移栽到營養土或者土地中。注意移栽之前要將麥苗根部粘有的培養基清洗乾淨，以防根 部腐爛壞死。移栽後的小麥自交授粉獲得I代種子，長成?\代小麥。經過3年的自交繁殖 分別獲得?\代種子、T2代小麥、T2代種子、T3代小麥、T3代種子。
[0068] 3、轉基因小麥的檢測
[0069] 1)DNA水平的檢測
[0070] 以CTAB法提取小麥基因組DNA，以各株系的基因組DNA為模板，質粒 pCambial380-SKPG為陽性對照，未轉化小麥的基因組DNA為陰性對照，進行PCR檢 測。所用引物為 KPPAtest-F :5'-AGCCTCCAAGCTCCTCCTCTT-3' 和 KPPAtest-R : 5' -TGATGATGAGCTCGCCCTTGTG-3'。PCR 反應程序為：94°C預變性 5min ;94°C變性 30s ;55°C 退火30s ;72°C延伸lmin ;30個循環；72°C延伸5min。反應結束後，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳 檢測擴增結果。能擴增出特異的722bp基因片段的植株為陽性植株（圖2)。
[0071] 2)RNA水平的檢測
[0072] 為了檢測1)中的PCR陽性株中PPA基因是否得到轉錄，進一步進行RT-PCR檢測。
[0073] a從1)鑑定為陽性的小麥中隨機挑選5個，以葉片為材料採用TRIZ0L法各自提取 總RNA，取2 μ g總RNA，採用MMLV (promega)製備cDNA，整個操作均按照試劑盒推薦的條件 進行。以獲得的非轉化小麥和轉pCambial380-SKPG小麥植株的cDNA為模板，進行半定量 PCR擴增。
[0074] b根據已報導的小麥ACTIN基因序列設計內參引物，正向引物（ACTIN-S:5 7 -TG TTGTTCTCAGTGGAGGTTCT-3 '），反向引物（ACTIN-A: : 5 ' -TCATACAGCAGGCAAGCACC-3 '），PC R反應程序為：96°C預變性3min ;94°C變性40s ;55°C退火40s ;72°C延伸40s ;25個循環； 72°C延伸 lOmin。
[0075] c將PCR反應產物進行凝膠電泳檢測，電泳得到430bp的片段即為小麥ACTIN的片 段。調節cDNA模板濃度，使非轉化小麥和轉pCambial380-SKPG小麥植株擴增片段亮度一 致。
[0076] d根據步驟c確定的非轉化小麥和轉pCambial380_SKPG小麥植株植株cDNA模板 濃度，進行 PPA 基因的 PCR 擴增。正向引物（BDL-S: 5 7 -ATCTCAGGAACAGCGACTTCG-3 7 )， 反向引物（BDL-A: 5 ' -CGTACTTGCCGCCGTACA-3 ' )，PCR 反應程序為：96 °C 預變性 3min ; 94°C變性 40s ;55°C退火 40s ;72°C延伸 40s ;25 個循環；72°C延伸 lOmin。
[0077] 將PCR反應產物進行凝膠電泳檢測，電泳得到435bp的產物即為PPA基因片段。電 泳圖結果如圖3所示，圖中1-6為ACTIN基因擴增結果。7-12為PPA基因擴增結果。1、7 為非轉基因小麥（對照）。2-6,8-12為在步驟1)中鑑定為陽性的轉基因小麥。結果表明 PPA基因在小麥中得到了表達，而不同的株系表達峰度略有不同。
[0078] 試驗例3、抗蚜功能檢測
[0079] 為了鑑定轉PPA基因植株的抗蚜蟲特性，開展了轉基因植株的抗蚜蟲接種試驗。
[0080] 1、小麥幼苗期抗蚜功能檢測
[0081] 將得到的陽性植株在小麥苗期進行了人工接種蚜蟲的實驗，觀察葉部表現。每株2 頭，以未轉基因小麥作為對照，16天後觀察蚜蟲生長情況：對照蚜蟲發生嚴重，且葉片已退 綠；轉基因植株未有蚜蟲侵染（圖4)。
[0082] 2、小麥穗期抗蚜功能檢測
[0083] 將轉PPA基因小麥植株在溫室裡接種蚜蟲進行鑑定，於春季5月初開始接種，在溫 室飼養的小麥蚜蟲用毛筆輕輕轉移到轉基因小麥的穗部，每株20頭，然後用防蟲網套袋， 套袋後轉移至室外，以未轉基因小麥作為對照，觀察自然條件下小麥抗蚜情況。接種20天 後，對照小麥植株的穗部蚜蟲發生嚴重，轉基因植株穗部則未有蚜蟲發生（圖5)。此結果證 實了 PPA在小麥體系中同樣具有良好的抗蚜蟲特性。
[〇〇84] 以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何 不經過創造性勞動想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的 保護範圍應該以權利要求書所限定的保護範圍為準。
【權利要求】
1. 一種培育抗蚜蟲的轉基因小麥的方法，其特徵在於，該方法是將含有掌葉半夏凝集 素基因的重組表達載體導入目的小麥中，得到抗蚜的轉基因小麥，所述轉基因小麥對蚜蟲 的抗性高於目的小麥。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述掌葉半夏凝集素基因是PPA基因，其序 列被專利保護，申請號為200910073815. 1，用PCR擴增PPA基因時，為了增強其轉化後在小 麥中的表達量，在設計引物的時候加入KOZAK序列GTCGCCACC，所述重組表達載體的出發質 粒是 pCambial380。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述重組表達載體的構建方法如下： 用EcoR I和BamH I酶切35S-T載體，得到含有35S基因的片段；用BamH I和Hind III 酶切KPPA-T載體，得到含有KPPA基因的片段；用Hind III和Bg II酶切⑶S-T載體，得到含 有⑶S基因的片段；將這些片段依次插入到載體pCambial380的多克隆位點中，得到所述重 組表達載體命名為pCambial380-SKPG。
4. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述載體35S-T載體是將35S基因連接 pGEM-T Easy vector得到，用PCR擴增pCambial380的35S啟動子，所用的引物為 5' -CCGAATTCCCCAACATGGTGGAGC-3'
5. -CGGGATCCGCGAAAGCTCGAGAGAG-3,， 擴增出的35S啟動子長度為0. 8kb。
5. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述KPPA-T載體是將KPPA基因連接pGEM-T Easy vector得到，用PCR擴增KPPA基因時，所用的引物為 5 ' -CGGGATCCGTCGCCACCATGGCCTCCAAGCTC-3 ' 5' -CCCAAGCTTCGCGGCAATTGG-3'， 擴增出的KPPA長度為0. 8kb。
6. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述載體GUS-T是將GUS基因連接pGEM-T Easy vector得到，用PCR擴增PTCK303的⑶S基因時，所用的引物為 5 ' -CCCAAGCTTATGTTACGTCCTGTAGAAACC-3 ' 5' -GAAGATCTTCATTGTTTGCCTCCCTG-3'， 擴增出的⑶S長度為2.0kb。
7. 如上述任一權利要求所述的方法，其特徵在於，所述目的小麥為石4185。
【文檔編號】C12N15/29GK104059939SQ201410275381
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】魏景芳, 李朝煒, 朱昀, 韓春雨, 李冬傑, 劉穎 申請人:河北科技大學