一種植物乳桿菌的電穿孔遺傳轉化方法
2023-05-17 13:48:21 2
一種植物乳桿菌的電穿孔遺傳轉化方法
【專利摘要】本發明提供了一種利用優化後的電穿孔技術對植物乳桿菌進行外源基因的高效遺傳轉化方法：利用添加最適濃度外源基因(質粒)、菌體最適生長狀態，恢復培養基製成最適濃度的蔗糖溶液、以及控制電擊後的恢復時間，從而實現了一種高效的電轉化的方法使得外源DNA進入植物乳桿菌中。本發明的有益效果體現在：可以用於植物乳桿菌的分子生物學研究，如研究該菌降膽固醇的分子機制以及產酸耐膽鹽的分子學機制；可以用來對植物乳桿菌實施基因工程從而進行遺傳改良，提高降膽固醇的能力。
【專利說明】一種植物乳桿菌的電穿孔遺傳轉化方法
(—)【技術領域】
[0001]本發明涉及植物乳桿菌的電穿孔遺傳轉化技術，適用於植物乳桿菌的遺傳工程以及植物乳桿菌分子生物學研究等領域。
(二)【背景技術】
[0002]乳酸菌作為人和動物腸道內正常菌群之一，已被證明具有諸多益生功能，而且被公認為安全無毒的(Generally regarded as safe,GRAS)。由於乳酸菌在發酵、農業、食品、生物加工乃至醫藥方面的重要應用，早在20世紀80年代，國外就已經開展了對乳酸菌遺傳學的研究。對乳酸菌遺傳系統的研究對於分析乳酸菌的重要工業特性，以及通過遺傳、代謝和蛋白質工程對其進行改造有著非常重要的意義。到90年代中期，此研究已經在不同國家內大範圍的展開。
[0003]最近十多年來，對乳酸菌分子生物學的研究取得了很大進步，並且已經發展了一些基於廣泛接合質粒的適用於乳酸菌的克隆載體、整合載體和表達載體。
[0004]近年來，乳桿菌的分子微生物學研究取得了重大進展，一些具有不同用途的乳酸乳球菌基因表達載體已經構建，用來表達抗原蛋白、細胞因子和生物酶等，推動食品工業快速向前發展。人們通過對乳酸菌質粒的研究，並用其作為一種基因克隆載體極大地推動了乳酸菌遺傳學的發展，在食品工業生產中，也得到了廣泛應用。
[0005]植物乳桿菌作為乳酸菌的一種，此菌與別的乳酸菌的區別在於此菌的活菌數比較高，能大量的產酸，革蘭氏陽性菌，最適生長溫度為30~37°C，兼性厭氧。菌種呈短杆狀，不產芽孢；在MRS培養基中呈暗白色、不透明、圓形、光滑、微小細密的菌落。屬於同型發酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、L-山梨糖、乳糖、纖維二糖、木糖、蜜二糖、果糖、核糖、葡萄糖酸鈉產酸。
[0006]乳酸菌的轉化需要一套穩定的轉化方法。目前乳酸菌的主要轉化方法有原生質體轉化法和電轉化法。前者操作複雜，轉化效率較低，不利於廣泛應用，特別是有工業應用價值的菌株，而後者操作相對簡便，轉化效率相對較高，因而當今主要採用電轉化法。
[0007]本發明利用了電穿孔技術對植物乳桿菌實施了外源基因轉化，找到了合適的轉化參數並優化了參數的組合，轉化程序較現有的其他方法更簡單，提高了轉化效率，此法可用於乳酸菌的遺傳工程以及分子生物學研究。
(三)
【發明內容】
[0008]本發明目的是提供利用電穿孔(electroporati`on)技術對植物乳桿菌進行外源基因遺傳轉化方法，並找到轉化效率較高的轉化參數組合，可用於乳酸菌的遺傳工程以及分子生物學研究等領域，以解決其它的遺傳轉化方法的不足之處。
[0009]本發明達到發明目的所採用的技術方案是:利用菌體最適生長狀態，將所得感受態細胞和適量外源基因(質粒DNA)水溶液混合，利用電穿孔儀對混合液進行電擊處理，電擊後的菌體細胞加入最適濃度的蔗糖溶液恢復培養基，然後控制電擊後的恢復時間，從而實現了一種高效的電轉化的方法使得外源DNA進入植物乳桿菌MA2中。
[0010]所述的植物乳桿菌的電穿孔遺傳轉化方法按如下步驟進行:
[0011]I)將植物乳桿菌用MRS培養基，以顯微鏡檢查計數，調整植物乳桿菌菌濃在108cfu/mL ；
[0012]2)用於轉化的外源質粒pMG36e擴增提取後溶於無菌去離子水0.5ng~5ng/ μ L，每50 μ L感受態細胞加入0.5ng質粒DNA混勻；
[0013]3)冰上預冷的2cm電擊杯中加入步驟2)所得混合液51 μ L，準備電穿孔儀，設定電壓2.49KV，進行電擊；
[0014]4)電擊後電擊杯中加入ImL含蔗糖濃度為O~0.4Μ的MRS液體培養基，冰浴10分鐘，37 V復甦2.5h，8000rpm離心Imin塗布於含紅黴素抗性的MRS培養基平板，37°C培養4d，轉化子出現；所述的MRS培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g,無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g，加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘。
[0015]5)轉化子在含紅黴素抗性的MRS培養基中長出，其紅黴素的濃度為5 μ g/μ L。
[0016]所述的菌體濃度及菌體生長狀態的方法:收集在OD6tltlnm在0.3~0.8之間的菌體製備感受態細胞。
[0017]所述的恢復培養基的製備方法:蔗糖濃度在O~0.4Μ之間。
[0018]所述的電擊後的菌體復甦時間確定方法:1~3h之間其特徵在於所述的菌體復甦時間應在37°C培養箱中進行復甦培養。
[0019]由於轉化子需要抗性篩選，植物乳桿菌野生菌不具有紅黴素抗性，故本發明中所述的外源DNA選為帶有紅黴素抗性基因的質粒pMG36e，與其對應的抗生素為紅黴素。如質粒PEP4351等同樣適用於本發明。其它任何可以轉化乳酸菌的DNA或質粒，也可採用本發明所述的方法進行轉化。
[0020]具體的，所述的方法按如下步驟進行:
[0021]1)將植物乳桿菌用MRS培養基，以顯微鏡檢查計數，調整植物乳桿菌菌濃在108cfu/mL ；
[0022]2)用於轉化的外源質粒pMG36e擴增提取後溶於無菌去離子水0.5ng~5ng/ μ L，每50 μ L感受態細胞加入0.5ng質粒DNA混勻；
[0023]3)冰上預冷的2cm電擊杯中加入步驟2)所得混合液51 μ L，準備電穿孔儀，設定電壓2.49KV，進行電擊；
[0024]4)電擊後電擊杯中加入ImL含蔗糖濃度為O~0.4Μ的MRS液體培養基，冰浴10分鐘，37 V復甦2.5h，8000rpm離心Imin塗布於含紅黴素抗性的MRS培養基平板，37°C培養4d，轉化子出現；所述的MRS培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g,無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g，加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘。
[0025]5)轉化子在含紅黴素抗性的MRS培養基中長出，其紅黴素的濃度為5 μ g/ μ L。
[0026]本發明的有益效果體現在:可以用於植物乳桿菌的分子生物學研究，如研究該菌降膽固醇的分子機制以及產酸耐膽鹽的分子學機制；可以用來對植物乳桿菌實施基因工程從而進行遺傳改良，提高降膽固醇的能力。(四)【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此:
[0028]實施例1:利用電穿孔法對植物乳桿菌進行外源抗紅黴素基因的遺傳轉化
[0029]利用
【發明內容】
中所述的方法，將含紅黴素抗性基因的外源質粒pMG36e導入植物乳桿菌，通過紅黴素篩選獲得穩定轉化的工程菌，得到較高的轉化效率。具體方法如下:[0030]1.植物乳桿菌感受態細胞的製備:
[0031]I)在MRS培養基平板上進行植物乳桿菌菌種活化，培養溫度為37°C。MRS固體培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g，2%的瓊脂粉，加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121 °C下滅菌，20分鐘。
[0032]2)挑取平板上的單菌落接入MRS液體培養基活化，培養溫度為37°C。MRS液體培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g,加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘。
[0033]3)將菌種接種於MRS液體培養基中，厭氧培養至OD6tltlnm為0.3 ;
[0034]4)將菌液放入離心管中，4°C，4000rmp離心15-20分鐘，棄上清，得菌體；
[0035]5)用1/10體積冰冷的洗滌液洗滌細胞，4°C，4000rmp離心15-20分鐘，棄上清；
[0036]6)將上述離心管在冰上放置5min ；
[0037]7)用1/10體積冰冷的洗滌液洗滌細胞，4°C，4000rmp離心15-20分鐘，棄上清；
[0038]8)用1/100體積冰冷的洗滌液重懸菌液；
[0039]9)將上述得到的感受態細胞以50 μ L/支的體積分裝，用封口膠封口，冰上放置IOmin, _80°C保存(每次使用前於冰上溶化)。
[0040]2.電穿孔法對原生質體進行外源DNA轉化:
[0041]1)DNA製備。用於轉化的外源質粒pMG36e擴增提取後溶於無菌去離子水，濃度為
0.5ng/ μ L,用於轉化。
[0042]2)每50 μ L感受態細胞加入0.5ng質粒DNA混勻，將混合液加入冰上預冷的2cm電擊杯中，準備電穿孔儀，設定電壓2.49KV，進行電擊；
[0043]3)電擊後電擊杯中加入ImL含蔗糖濃度為0.4M的MRS液體培養基，冰浴10分鐘，37 V復甦Ih，8000rpm離心Imin塗布於含紅黴素抗性的MRS培養基平板，37°C培養4d，轉化子出現；所述的MRS培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫
1.0g，加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘。
[0044]4)轉化子在含紅黴素抗性的MRS培養基中長出，其紅黴素的濃度為5 μ g/ μ L。
[0045]結果:
[0046]轉化效率相對於之前有較大的提高。
[0047]實施例2:利用電穿孔法對植物乳桿菌進行外源抗紅黴素基因的遺傳轉化
[0048]利用
【發明內容】
中所述的方法，將含紅黴素抗性基因的外源質粒pMG36e導入植物乳桿菌，通過紅黴素篩選獲得穩定轉化的工程菌，得到較高的轉化效率。具體方法如下:
[0049]1.植物乳桿菌感受態細胞的製備:
[0050]I)在MRS培養基平板上進行植物乳桿菌菌種活化，培養溫度為37°C。MRS固體培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g，2%的瓊脂粉，加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121 °C下滅菌，20分鐘。
[0051 ] 2)挑取平板上的單菌落接入MRS液體培養基活化，培養溫度為37°C。MRS液體培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g,加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘。
[0052]3)將菌種接種於MRS液體培養基中，厭氧培養至OD6tltlnm為0.8 ;
[0053]4)將菌液放入離心管中，4°C，4000rmp離心15-20分鐘，棄上清，得菌體；
[0054]5)用1/10體積冰冷的洗滌液洗滌細胞，4°C，4000rmp離心15-20分鐘，棄上清；
[0055]6)將上述離心管在冰上放置5min ；
[0056]7)用1/10體積冰冷的洗滌液洗滌細胞，4°C，4000rmp離心15-20分鐘，棄上清；
[0057]8)用1/100體積冰冷的洗滌液重懸菌液；
[0058]9)將上述得到的感受態細胞以50 μ L/支的體積分裝，用封口膠封口，冰上放置IOmin, _80°C保存(每次使用前於冰上溶化)。
[0059]2.電穿孔法對原生質體進行`外源DNA轉化:
[0060]1)DNA製備。用於轉化的外源質粒pMG36e擴增提取後溶於無菌去離子水，濃度為5ng/ μ L,用於轉化。
[0061 ] 2)每50 μ L感受態細胞加入0.5ng質粒DNA混勻，將混合液加入冰上預冷的2cm電擊杯中，準備電穿孔儀，設定電壓2.49KV，進行電擊；
[0062]3)電擊後電擊杯中加入ImL含蔗糖濃度為0.1M的MRS液體培養基，冰浴10分鐘，37V復甦3h，8000rpm離心Imin塗布於含紅黴素抗性的MRS培養基平板，37°C培養4d，轉化子出現；所述的MRS培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫
1.0g,加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘。
[0063]4)轉化子在含紅黴素抗性的MRS培養基中長出，其紅黴素的濃度為5 μ g/ μ L。
[0064]結果:
[0065]轉化效率相對於之前有較大的提高。
[0066]實施例3:利用電穿孔法對植物乳桿菌進行外源抗紅黴素基因的遺傳轉化
[0067]利用
【發明內容】
中所述的方法，將含紅黴素抗性基因的外源質粒pMG36e導入植物乳桿菌，通過紅黴素篩選獲得穩定轉化的工程菌，得到較高的轉化效率。具體方法如下:
[0068]1.植物乳桿菌感受態細胞的製備:
[0069]I)在MRS培養基平板上進行植物乳桿菌菌種活化，培養溫度為37°C。MRS固體培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀
2.0g,乙酸鈉5.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g，2%的瓊脂粉，加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121 °C下滅菌，20分鐘。[0070]2)挑取平板上的單菌落接入MRS液體培養基活化，培養溫度為37°C。MRS液體培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀
2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g,加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘。
[0071]3)將菌種接種於MRS液體培養基中，厭氧培養至OD6tltlnm為0.5 ;
[0072]4)將菌液放入離心管中，4°C，4000rmp離心15_20分鐘，棄上清，得菌體；
[0073]5)用1/10體積冰冷的洗滌液洗滌細胞，4°C，4000rmp離心15_20分鐘，棄上清；
[0074]6)將上述離心管在冰上放置5min ；
[0075]7)用1/10體積冰冷的洗滌液洗滌細胞，4°C，4000rmp離心15_20分鐘，棄上清；
[0076]8)用1/100體積冰冷的洗滌液重懸菌液；
[0077]9)將上述得到的感受態細胞以50 μ L/支的體積分裝，用封口膠封口，冰上放置IOmin, _80°C保存(每次使用前於冰上溶化)。
[0078]2.電穿孔法對原生質體進行外源DNA轉化:
[0079]1)DNA製備。用於轉化的外源質粒pMG36e擴增提取後溶於無菌去離子水，濃度為
0.5ng/ μ L,用於轉化。
[0080]2)每50 μ L感受態細胞加入0.5ng質粒DNA混勻，將混合液加入冰上預冷的2cm電擊杯中，準備電穿孔儀，設定電壓2.49KV，進行電擊；
[0081]3)電擊後電擊杯中加入ImL含蔗糖濃度為0.1M的MRS液體培養基，冰浴10分鐘，37 V復甦2.5h，8000rpm離心Imin塗布於含紅黴素抗性的MRS培養基平板，37°C培養4d，轉化子出現；所述的MRS培養基終濃度為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g，加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘。
[0082]4)轉化子在含紅黴素抗性的MRS培養基中長出，其紅黴素的濃度為5 μ g/ μ L。
[0083]結果:
[0084]轉化效率在105cfu/ug質粒DNA以上，相對於之前轉化效率有較大的提高。
【權利要求】
1.一種植物乳桿菌的電穿孔遺傳轉化方法，其特徵在於所述的方法按如下步驟進行: 1)將植物乳桿菌用MRS培養基，以顯微鏡檢查計數，調整植物乳桿菌菌濃在IO8Cfu/mL ； 2)用於轉化的外源DNA即質粒DNA溶於無菌去離子水至濃度為0.5ng/ μ L，每50 μ L感受態細胞加入0.5ng質粒DNA混勻； 3)在預冷的電擊杯中加入步驟2)所得混合液，用電穿孔儀進行電擊； 4)電擊後電擊杯中加入含蔗糖濃度為O~0.4M的MRS液體培養基，冰浴10分鐘，37°C復甦2.5h，8000rpm離心Imin塗布於含紅黴素抗性的MRS培養基平板，37°C培養4d，轉化子出現。所述的MRS培養基終濃度為:蛋白腖l0.0g，牛肉膏10.(^，酵母膏5.(^，無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫.l.0g，加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘。 5)轉化子在含紅黴素抗性的MRS培養基中長出，其紅黴素的濃度為5μ g/ μ L。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的菌體濃度及菌體生長狀態在OD6tltlnm在.0.3~0.8之間。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的恢復培養基的蔗糖濃度在O~0.4Μ之間。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的電擊後的菌體復甦時間在I~3h之間。
5.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的菌體生長狀態確定方法:利用紫外分光光度計OD6tltol時的測定值，對菌株進行感受態細胞製備，然後進行電轉化，平板壓力篩選觀察試驗結果，以獲得轉化子。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的恢復培養基為添加蔗糖濃度為O~.0.4M之間的MRS培養基，其中MRS培養基的配製方法為:蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g,無水葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,檸檬酸銨2.0g,吐溫1.0g,加入1000mL蒸餾水，調pH為6.2~6.4，121°C下滅菌，20分鐘加入終濃度O~0.4M蔗糖。
7.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的菌體復甦時間應在37°C培養箱中進行復甦培養。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的外源DNA為帶有紅黴素抗性基因的質粒pMG36e,所述的抗生素為紅黴素。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的方法按如下步驟進行: .1)將植物乳桿菌用MRS培養基，以顯微鏡檢查計數，調整植物乳桿菌菌濃在IO8Cfu/mL ； .2)用於轉化的外源質粒pMG36e擴增提取後溶於無菌去離子水0.5ng~5ng/ μ L,每.50 μ L感受態細胞加入0.5ng質粒DNA混勻； .3)冰上預冷的2cm電擊杯中加入步驟2)所得混合液51yL，準備電穿孔儀，設定電壓.2.49KV，進行電擊； 4)電擊後電擊杯中加入ImL含蔗糖濃度為O~0.4M的MRS液體培養基，冰浴10分鐘，.37 V復甦2.5h，8000rpm離心Imin塗布於含紅黴素抗性的MRS培養基平板，37°C培養4d，轉化子出現。5)轉化子在含紅黴素抗性的MRS培養基`中長出，其紅黴素的濃度為5 μ g/μ L。
【文檔編號】C12R1/25GK103820484SQ201210461844
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年11月16日 優先權日:2012年11月16日
【發明者】白小佳, 張新利, 王豔萍, 王金菊 申請人:天津科技大學