一種稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記及其應用的製作方法

2023-05-17 00:59:37

本發明屬於農作物分子育種領域，具體涉及一種稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記及其應用。

背景技術：
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我國是世界上年產稻穀最多的國家，水稻產量的穩定性直接關係到國計民生。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是對水稻生產危害最嚴重的病害之一，被稱為水稻的癌症。目前，發掘和利用廣譜稻瘟病抗性基因來培育抗病的水稻品種是控制稻瘟病的主要措施。傳統的水稻抗病育種依賴於人工接種和植株表型的選擇，費時費力，並且受到病菌菌株和病菌發病條件等的影響，選育效率較低。而利用與目的基因緊密連鎖的分子標記雖然大大提高了育種效率，但應用過程中也存在受到遺傳背景以及遺傳重組的限制，最終輔助選擇失敗。因此，直接對稻瘟病抗性基因進行選擇，是最有效的抗性鑑定方法。其中，利用稻瘟病抗病基因序列，建立與抗病基因完全共分離的特異性標籤，可達到100％選擇的準確性。此外，通過鑑定抗病基因及其等位基因在功能區域的特異性保守序列，進而建立抗病基因及其等位基因在功能區域的特異性標籤，有助於鑑定雜交後代的純雜合基因型，即便擴大選育親本的範圍也同樣適用，大大加速了育種的進程。

目前在水稻第6染色體短臂端的Pi2/9基因簇內，至少有10個稻瘟病抗性基因(Pi2,Piz,Piz-t,Pi40,Pigm,Pi9,Pi25,Pi26,Pi50,Pi2-2)定位其中。其中Pi2是一個廣譜抗性基因，在稻瘟病抗性育種方面具有重要的應用價值(Jiang et al.2012)。Pi2、Pi9以及Piz-t已經被成功克隆，彼此之間在核苷酸水平上的一致性範圍為71.8％～98.6％(Qu et al.2006,Zhou et al.2006)。目前，跟蹤抗稻瘟病基因Pi2的分子標記一般用緊密連鎖的SSR標記如AP22，距離Pi2均有一定的距離，選擇效率無法達到100％，也無法直接用來檢測水稻樣品中是否含有Pi2基因。利用Pi2的基因序列與日本晴等位基因的序列差異，建立了Pi2基因的共顯性分子標記M-Pi2，此標記雖然可以鑑定Pi2，但是無法區分Pi2和Piz-t，並且無法鑑定出純雜合基因型(Gao et al.2010)。基於Pi2基因序列單鹼基差異得到的分子標記，通過PCR擴增得到的產物，經Pst I或Hinf I酶切後，進行聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，可特異地鑑定出Pi2(Hua et al.2015,Tian et al.2016)，但此方法步驟較為繁瑣，在進行產業化分子育種過程中，需耗費較多的時間和費用。

技術實現要素：
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本發明的目的是提供一種能夠適用於Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分離群體的分子標記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規模分子育種的需求，特異性高，可以快速鑑定後代分離群體的純雜合基因型的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記。

本發明的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記，其特徵在於，包括以下引物：

2Pi2-F：5』-GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG-3』，其序列如SEQ ID NO.1所示；

2Pi2-R：5』-AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT-3』，其序列如SEQ ID NO.2所示；

2WT-R：5』-AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC-3』，其序列如SEQ ID NO.3所示或2WT-1R：5』-AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC-3』，其序列如SEQ ID NO.4所示。

即包括2Pi2-F、2Pi2-R和2WT-R；或者2Pi2-F、2Pi2-R和2WT-1R。

本發明的第二個目的是提供一種檢測是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及是純、雜合基因型的方法，其特徵在於，包括以下步驟：

提取待測水稻基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，分別用上述引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物，或者，分別用上述引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-1R進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物，對應下表即可判斷待測水稻基因組中是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及待測水稻的稻瘟病抗性基因Pi2純、雜合基因型；

也就是說提取待測水稻基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，先用2Pi2-F/2Pi2-R進行擴增，如果得到416bp的產物，那麼待測水稻含有稻瘟病抗性基因Pi2；然後以該基因組DNA作為模板，分別用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物，如果沒有PCR擴增產物，那麼該待測水稻就是Pi2純合型；如果擴增得到416bp(對應引物對2Pi2-F/2WT-R)或419bp(對應引物對2Pi2-F/2WT-1R)的擴增產物，那麼該待測水稻就是Pi2雜合型；

用2Pi2-F/2Pi2-R進行擴增，如果不能得到416bp的產物，那麼待測水稻不含有稻瘟病抗性基因Pi2；然後以該基因組DNA作為模板，分別用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物，擴增得到416bp(對應引物對2Pi2-F/2WT-R)或419bp(對應引物對2Pi2-F/2WT-1R)的擴增產物，該待測水稻就是Pi2的等位基因純合型。

優選，所述的PCR，其反應體系為：DNA模板1.0μL、10μM 2Pi2-F 0.5μL、10μM 2Pi2-R或2WT-R 0.5μL、2×Taq PCR Master Mix 5μL，其餘由雙蒸滅菌水補足至10μL，反應條件為：94℃預變性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共運行35個循環；72℃延伸5min。

本發明的第三個目的是提供上述稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記在判斷待測水稻基因組中是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及待測水稻的稻瘟病抗性基因Pi2純、雜合基因型中的應用。

本發明具有如下明顯的有益效果：

(1)本發明簡便快速、成本低廉，適用於Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分離群體的分子標記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規模分子育種的需求。

(2)本發明提供的分子標記特異性高：通過比對Pi2及其等位基因在多個品種中功能LRR區域的保守性和特異性，同時結合已報導的Pi2與Pi9、Piz-t以及其餘21個品種在該LRR區域的保守性和特異性(Tian et al.2016)，開發的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R(或者2Pi2-F/2WT-1R)引物對可以特異性的擴增Pi2和其等位基因。

(3)本發明提供的分子標記可以快速鑑定後代分離群體的純雜合基因型，對於加速育種進程有著重要的作用。

(4)本發明是在Pi2基因內部的功能LRR區域序列，並且是測定了多個品種後開發的分子標記，因此，即便擴大親本選育範圍，此方法仍然適用。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中對多個水稻品種的Pi2及其等位基因在LRR區域的序列對比圖；其中，左邊為對應的水稻品種名稱，右邊為測序序列；虛線框內(下橫線所對應部分)表示Pi2基因與所測序品種在LRR區域特異性的保守序列。

圖2為本發明實施例1中BL122-Pi2雜合體在該區域序列的測序峰圖；其中，箭頭表示在該位點核苷酸的測序結果為雙峰。

圖3為本發明實施例1中例舉的已經公開發表的Pi2與Pi9、Piz-t以及其餘21個品種在Pi2的LRR區域的核苷酸序列對比圖(Tian et al.2016)；虛線框內(下橫線所對應部分)表示Pi2基因與所測序品種在LRR區域特異性的保守序列。

圖4為本發明實施例2中利用分子標記2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R鑑定11個水稻品種Pi2基因型的電泳圖；其中，1～11對應的水稻品種分別為：廣青佔、豐澳佔、泰小佔、奇國佔、金科佔、IR24、增城絲苗、金農絲苗、明恢70、BL122-Pi2雜合和BL122-Pi2純合。

圖5為本發明實施例3中利用SSR標記AP22、分子標記2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R檢測Pi2在4個親本之間的多態性的電泳圖；

圖6為本發明實施例3中利用分子標記2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R檢測(BL122/植B)/(CBB23/植B)以及(BL122/祥B)/(CBB23/祥B)雜交後代的電泳圖；1～33分別對應於雜交後代各單株，其中K代表抗病單株，G代表感病單株。

圖7是本發明實施例4中2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R引物對的靈敏度實驗結果的電泳圖。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但本發明的實施方式不限於此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例1水稻Pi2基因功能性標記2Pi2-F和2Pi2-R、2WT-R/2WT-1R的引物設計及擴增片段分析

1、引物設計

通過水稻資料庫(http://www.gramene.org/)及常規PCR法擴增並測序獲得多個水稻品種的Pi2及其等位基因在抗稻瘟病的功能LRR(Leucine-Rich Repeats)區域特異性的保守序列，如圖1所示的虛線框內；圖2為BL122-Pi2雜合體在該區域序列的測序峰圖，可知Pi2與其等位基因在此區域保守差異的核苷酸的測序結果都為雙峰；圖3為已經公開發表的Pi2與Pi9、Piz-t以及其餘21個品種在該區域的核苷酸序列對比(Tian et al.2016)。綜合可知，Pi2在該區域的保守序列為：AGGAATCTCAGATGG中；Pi2等位基因在該區域的保守序列為：GTTATTATCAGATAT或者GTTATTCTCAGGTATTAT。

由此而設計引物序列(5』-3』)如下：

2Pi2-F：5』-GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG-3』；

2Pi2-R：5』-AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT-3』；

2WT-R：5』-AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC-3』；

2WT-1R：5』-AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC-3』。

(引物序列中帶下劃線的為Pi2及其等位基因的特異鹼基)，將這四條引物命名為：稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記。

2、擴增片段分析

利用2Pi2-F/2Pi2-R引物對即可檢測待測樣品是否含有Pi2基因，進一步利用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R即可檢測待測樣品的純雜合，具體分析結果見表1。

表1

實施例2利用水稻Pi2基因功能性標記對9個水稻資源的Pi2進行鑑定

1、水稻基因組DNA的提取

以11個水稻品種為材料：廣青佔、豐澳佔、泰小佔、奇國佔、金科佔、IR24、增城絲苗、金農絲苗、明恢70、BL122-Pi2雜合和BL122-Pi2純合，依次編號為1～11。採用CTAB法提取水稻基因組DNA，具體步驟如下：(1)將少量水稻新鮮葉片放入預冷的離心管中，加入液氮打磨成粉狀；(2)加入600μL的65℃預熱CTAB裂解緩衝液，渦旋混勻後於65℃水浴鍋中加熱45min；(3)加入600μL的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)混合液，翻轉混勻，8,000rpm離心10min；(4)將上清轉入新的離心管中，加等0.6倍體積的異丙醇，翻轉混勻，靜置30min，8,000rpm，離心10min；(5)棄上清，加入1mL的70％的乙醇洗滌，倒掉上清液，通風乾燥20min後加入40μL雙蒸滅菌水(ddH2O)，37℃放置1h溶解DNA；隨後保存於-20℃。

2、稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記擴增鑑定11個水稻品種Pi2的基因型

利用稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記對11個水稻品種的DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為：DNA模板1.0μL、引物(10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2Pi2-R 0.5μL；或者10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2WT-R 0.5μL)、2×Taq PCR Master Mix 5μL，其餘由雙蒸滅菌水(ddH2O)補足至10μL。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共運行35個循環；72℃延伸5min。擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3、11個水稻品種Pi2的基因型分析

如圖4所示，1～9的水稻品種都只用2Pi2-F/2WT-R標記擴增出條帶，說明都不含有稻瘟病抗性基因Pi2(以下簡稱Pi2)，且都為Pi2等位基因的純合體；10為Pi2的雜合體，用2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R都擴增得到條帶；11為Pi2的純合體，只用2Pi2-F/2Pi2-R標記擴增出條帶。這與11個水稻品種的實際情況相符合。

實施例3雜交組合病圃鑑定與Pi2的特異性分子標記檢測的相關性分析

1、實驗材料及來源

以BL122(Pi2供體)同植B和祥B分別雜交，記為雜交組合①和②；以CBB23同植B和祥B分別雜交，記為雜交組合③和①和③(②和)的雜交後代在F3代雜交，雜交種自交2代後，在F3代進行稻瘟病抗性鑑定。

2、稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記在4個親本之間的多態性

利用已報導的SSR引物AP22和本發明中的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記對4個親本進行鑑定，每個親本的PCR反應體系為：DNA模板1.0μL、引物(10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2Pi2-R 0.5μL；或者10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2WT-R 0.5μL；或者SSR引物AP22的正、反向引物10μM各0.5μL)、2×Taq PCR Master Mix 5μL，其餘由雙蒸滅菌水(ddH2O)補足至10μL。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共運行35個循環；72℃延伸5min。擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

結果如圖5所示，AP22雖然可以鑑定出Pi2雜合的基因型，但是很難區分Pi2純合基因型與3個親本之間的多態性，並且PCR產物片段較小，需用聚丙烯醯氨凝膠電泳檢測；而利用2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R可以快速鑑定出4個親本的基因型。其中，植B、祥B、CBB23都為Pi2的等位基因的純合體，同時可以區分出BL122-Pi2雜合和BL122-Pi2純合，並且PCR產物較大，利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測即可。

3、病圃抗性鑑定及分子標記檢測

將F2代雜交種和4個親本種植於廣東省河源市龍川縣病圃基地，選取不同群體33份單株做為研究材料，對材料葉瘟和穗瘟進行感抗病鑑定。結果表明，親本BL122表現為抗，植B、祥B和CBB23表現為中感；在用於研究的33份單株材料裡，抗病單株共25個，感病單株8個。對這33份材料進行Pi2檢測，發現抗病的25個單株都含有稻瘟病抗性基因Pi2，感病的8個單株都不含有Pi2，如圖6。

以上結果表明，稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記檢測與稻瘟病病圃鑑定結果完全一致，表明提供的分子標記可以有效地鑑定待測材料是否攜帶Pi2抗稻瘟病基因，從而準確應用於分子育種。

實施例4：2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R引物對的靈敏度實驗

以BL122-Pi2雜合的基因組DNA作為DNA模板進行PCR反應，反應體系為：DNA模板1.0μL、引物(10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2Pi2-R 0.5μL；或10μM 2Pi2-F 0.5μL和2WT-R 0.5μL)、2×Taq PCR Master Mix 5μL，其餘由雙蒸滅菌水補足至10μL，反應條件為：94℃預變性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共運行35個循環；72℃延伸5min。

結果如圖7所示，1～12對應的DNA模板濃度分別為：500ng/μL，200ng/μL，100ng/μL，50ng/μL，20ng/μL，10ng/μL，5.0ng/μL，2.0ng/μL，1.0ng/μL，0.5ng/μL，0.2ng/μL，0.1ng/μL；可知，在含有模板量1.0ng的上述PCR反應中，2對引物都已經可以很好地擴增到目的條帶。

序列表

中國科學院華南植物園

一種稻瘟病抗性基因 Pi2 的功能性分子標記及其應用

4

1

25

DNA

人工序列

1

GACAGTTTCA TTATGACAAC TTTAG 25

2

25

DNA

人工序列

2

AAGTGTTCCA CCATCTGAGA TTCCT 25

3

25

DNA

人工序列

3

AAGTGTTCCA ATATCTGATA ATAAC 25

4

28

DNA

人工序列

4

AAGTGTTCCA ATAATACCTG AGAATAAC 28