來自細菌的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的製作方法

2023-05-17 14:57:41 2

專利名稱：：來自細菌的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的製作方法
技術領域：
：本發明一般地涉及磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶，所述磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶涉及聚酮化合物合酶的活化來合成長鏈多不飽和脂肪酸(例如，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。相關技術的說明在大多數有機體中脂肪酸生物合成的主要產物是16-和18-碳化合物。這些脂肪酸的鏈長度和不飽和度的相對比例在物種之中廣泛地變化。例如，哺乳動物主要產生飽和的和單不飽和脂肪酸，而大多數高等植物生產具有一個、兩個或三個雙鍵的脂肪酸，後兩者包含多不飽和脂肪酸(PUFA)。已經報導了非常長鏈的PUFA,例如二十二碳六烯酸(DHA,22:6)二十碳五烯酸(EPA,20:5)來自幾個物種的海洋細菌,包括Mor/te〃aman7a和5Tze麗we〃a印.(美國專利6,140,486)，以及來自》每'簾侈寸長口ScAz'zoc/z;^n.Mms/.禾口77^aw5toc/^^7'wm(美國專利公開20040235127)。兩種主要的PUFA家族是co-3脂肪酸(也稱為"n-3"脂肪酸)，例子是二十二碳六烯酸，以及co-6脂肪酸(也稱為"n-6"脂肪酸)，例子是花生四烯酸(ARA，20:4)。PUFA是細胞的質膜和脂肪組織的主要成分，在其中它們可以分別以磷脂和甘油三酯存在。PUFA是哺乳動物中適當的發育所必需的，特別是在嬰兒腦部的發育中，以及對於組織形成和修復是必需的。幾種失調響應於PUFA的治療。補充PUFA已經顯示了降低血管成形術後再狹窄的機率。還已經很好地記載了某些膳食的od-3脂肪酸對於心血管疾病和類風溼性關節炎的健康效益(Simopoulos,1997;James"a/.，2000)。進一步的，PUFA已經被暗示用於治療哮喘和銀屑病。證據表明，PUFA可能涉及鈣代謝，表明PUFA可能在骨質疏鬆症的治療或預防以及腎臟或泌尿道結石的治療或預防中是有用的。對於健康效益的大部分證據適用於長鏈co-3脂肪、EPA和DHA，其存在於魚類和魚油中。在這種證據的基礎上，加拿大(ScientificReviewCommittee,1990,NutritionRecommendations,MinisterofNationalHealthandWelfare,Canada,Ottowa)、歐洲(deDeckererwa/.，1998)、英國(TheBritishNutritionFoundation,1992，Unsaturatedfatty-acids-nutritionalandphysiologicalsignificance:ThereportoftheBritishNutritionFoundation'sTaskForce,ChapmanandHall,London)和美國(SimopoulosWa/.,1999)的健康專家和營養學家建議提高這些PUFA的膳食消耗。重要的主要的長鏈PUFA包括DHA和EPA，其主要在不同類型的魚油中存在，以及ARA,其在絲狀真菌例如Mortierella(被孢黴屬)中發現。對於DHA,存在著大規模生產的許多來源，包括多種海洋生物、從冷水海洋魚類獲得的油、以及蛋黃級分。然而，存在著與從天然來源大規模生產PUFA相關的幾個缺點。PUFA的天然來源，例如動物和真菌，傾向於具有高度異質性的油成分。因而從這些來源獲得的油可能需要廣泛的純化來分離出一種或多種期望的PUFA，或來產生富集了一種或多種PUFA的油。PUFA的天然來源還在可用性方面受到不受控制變動的支配。魚類資源可能經歷天然的變異或可能由於過量捕撈而耗盡。此外，即時有著它們的治療效益的壓倒性證據，關於co-3脂肪酸的膳食建議沒有被注意。魚油劑具有令人不快的味道和氣味，這不可能從期望的產物中經濟地分離出來，使得這種產物作為食品添加劑是無法接受的。動物油，特別是魚油，可能積累環境汙染物。食物可以富含魚油，但是，這種富含由於成本以及在世界範圍內魚類資源的衰減是成問題的。這個問題對於全魚的消費和攝食也是障礙。儘管如此，如果提高魚類攝食的健康信息被社會接受，在滿足對魚類的需求方面可能有問題。此外，這種工業的穩定性是成問題的，其嚴重地依賴水產業飼養的野生魚類資源(Naylor^a/.,2000)。其他的自然局限性促成了生產co-3脂肪酸的新方法。天氣和疾病可能引起魚類產量的變動。有機體例如Mortierella的大規模發酵是昂貴的。天然的動物組織含有很低數量的ARA，並且難以被加工。微生物例如Porphyridium(紫球藻屬)和Mortierella難以在工業規模上培養。許多海洋微生物通過聚酮化合物合酶(PKS)機制產生非常長鏈的PUFA，例如DHA和EPA。PKS是由多功能的多肽組成的酶複合物，所述多肽以反覆的方式催化複雜分子從單體底物的合成。PKS是本領域公知的，這種序列的許多實例可以在文獻中找到。在Mon'te〃a中，PKS從丙二醯基-CoA和乙醯-CoA合成DHA。為了活化這種PKS，需要磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(Ppt)通過輔酶A的4'-磷酸泛醯巰基乙胺基部分對保守的絲氨酸殘基的共價附著來催化載體蛋白的翻譯後活化、脂肪酸合成、聚酮化合物合成、以及非核糖體多肽合成，一種包括脂肪酸、聚酮化合物和非核糖體肽的天然產物的生物合成所需的反應。Ppt以及根據它們的載體蛋白特異性被分類。在含有多種需磷酸泛醯巰基乙胺基途徑的有機體中，以及表明了每個途徑尤其自己的Ppt。雖然已經克隆了M廳W"flPKS(美國專利NO.6,140，486(FacciottiWa/.)),沒有發現Ptp。Allen和Bartlett(2002)聲稱，他們未能從A/on7e/Z"克隆Ppt基因。已經嘗試了許多方法在才直物中生產DHA和EPA(WO05103253A1(Singhe"/.),WO04071467A2(KinneyWg/.))。這些方法通常以分步的方式使用脫飽和酶/延伸酶。這種方法具有使用6-8個基因和引起中間體的積累的缺點，中間體的積累是潛在地不希望的結果。使用PKS/Ppt方法，需要的轉基因的數量將更少(4-5個)，不預期中間體的積累。因此，有益的是獲得涉及長鏈PUFA生物合成的遺傳物質，以及在植物系統中，特別是地基的陸地作物植物系統中表達所分離的材料，所述植物系統可以被操作來提供商業數量的一種或多種PUFA的生產。還需要的是提高人類和動物中。-3脂肪酸的攝取。因而，存在著需要來提高大範圍的Q3-強化營養食品和食品添加劑，從而受試者可以選擇適合於他們的一般飲食習慣的飼料、飼料成分、食物、食物成分。特別有益的將是具有提高的DNA或EPA的種子油。當前僅有一種oa-3脂肪酸ALA可以在才直物油中獲得。然而，存在著攝食的AL向更長鏈的co-3脂肪酸例如EPA和DHA的不良轉化。這已經在共同待決美國公開NO.20040039058"抑制性失調的治療和預防"中展現了，通過使用亞麻籽油從社區平均值lg/天提高到14g/天的ALA攝取僅僅少量地提高了血漿磷脂EPA水平。ALA攝取中的14倍增加引起了血漿磷脂EPA中的2倍增力。(Manzioris"，1994)。因而，為此，需要有效的和商業上可用的利用聚酮化合物合成複合物和活化該複合物的Ppt的PUFA生產、編碼Ppt的基因、以及產生它們的重組方法。對於含有更高相對比例的DHA或EPA、含有它們的食物成分和添加劑，也存在著需求。對於生產特定的PUFA的可靠的和經濟的方法，也存在著需求。來自表達細菌PKS複合物的、含油種子作物例如油菜、大豆、玉米、葵花或亞麻的油，在長4連PUFA、DHA或EPA方面是富集的。可以利用這種油來生產富集od-3脂肪酸的食物和食品增補劑，這種食物的消費有效地提高EPA和DHA的組織水平。全部用co-3富集的油生產或製備的食物和食品，例如牛奶、人造黃油和香腸，將產生治療效益。因而，對於能夠活化PKS、用於具有PUFA富集的油的轉基因作物植物中的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的新核酸，以及從此產生的改進的油，存在著強烈的需求。發明概述在一個方面，本發明提供了編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的多肽的分離的核酸。這些可以用於轉化細胞或修飾植物的脂肪酸組成或植物產生的油。本發明的一個實施方式是選自以下構成的組的分離的多核苷酸序列(a)在5xSSC、50%曱醯胺和42°C的條件下，與SEQIDNO:6或SEQIDNO:8雜交的多核普酸；(b)編碼SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列的多核普酸；和(c)編碼與SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸。在本發明的某些進一步的實施方式中，所述多核苷酸編碼與SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列具有至少80%、85%或90%的序列同一性、包括與這些序列的至少約82%、87%、89%、92%、95%、98%和99%的同一性的多肽。技術人員將認識到，由於這些序列是相關的，給定的序列可能同時地與這些多肽序列的超過一種享有90%或更高的同源性。在進一步的實施方式中，所編碼的多肽具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性。在又一個方面，本發明提供了DNA構建體，其包含與編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的多肽的DNA分子可操作連接的異源啟動子，其中所述DNA分子選自以下構成的組(a)編碼SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列的多核苷酸；(b)在5xSSC、50%曱醯胺和42。C的條件系，與SEQIDNO:6或SEQIDNO:8雜交的多核苷酸；以及(c)編碼與SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸。在其他實施方式中，所述啟動子是在原核細胞或真核細胞中有功能的。在某些實施方式中，在其中啟動子有功能的真核細胞是植物細胞。在進一步的實施方式中，所述啟動子是種子增強的啟動子。在再又一個方面，本發明提供了用本發明提供的DNA構建體轉化的宿主細胞，所述DNA構建體包含與編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的多肽的DNA分子可操作連接的異源啟動子。在另一個實施方式中，所述宿主細胞進一步包括與DNA分子可操作連接的異源啟動子，所述DNA分子編碼包含磷酸泛醯巰基乙胺附著位點的聚酮化合物(polyketide)合成酶多肽。在進一步的實施方式中，所述編碼包含磷酸泛醯巰基乙胺附著位點的聚酮化合物合酶多肽的DNA分子來自於Mon'fe〃aman7za。在又一個實施方式中，所述DNA分子編碼與SEQIDNO:19具有至少70%的序列同一性的聚酮化合物合酶多肽，或在此以下描述的任何已知的聚酮化合物合酶。所述宿主細胞可以是植物、真菌或細菌細胞。在再又一個方面，本發明提供了由用在此提供的DNA構建體轉化的宿主細胞組成的植物和它的子代，所述DNA構建體包含與編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的多肽的DNA分子可操作連接的異源因型的植物包含改變的脂肪酸新陳代謝。在一個實施方式中，所述植物選擇由油菜(canola)、Sra肌'cac謂/&s^7、、含油種子油菜(oilseedrape)、油菜籽(rapeseed)、大豆、海甘藍、芥菜、蓖麻、花生、芝麻、棉籽、亞麻籽、紅花、油棕、亞麻、葵花、玉米、稻米、大麥、粟、黑麥、小麥、燕麥、苜蓿和高粱構成的組。本發明還提供了從所述植物產生的種子、油和粗粉，其被定義為包含可檢測的本發明提供的DNA分子或多肽。另外，本發明提供了動物飼料和人類食品成份。在再又一個方面，本發明提供了製造含有二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸的植物油的方法，包括步驟(a)生長包含本發明的宿主細胞、進一步包含聚酮化合物合酶的植物；(b)產生種子；(c)以及加工所述種子來獲得油。附圖的簡要說明以下附圖形成了本說明書的部分，被包括在內以進一步說明本發明的某些方面。通過參考一個或多個這些附圖並結合在此呈現的特定實施方式的詳細說明，可以更好地理解本發明。附圖1顯示了載體pMON68081的圖。附圖2顯示了載體pMON68080的圖。附圖3顯示了載體pMON94547的圖。附圖4顯示了載體pMON94544的圖。附圖5顯示了載體pMON94534的圖。附圖6顯示了載體pMON68084的圖。附圖7顯示了載體pMON68085的圖。附圖8顯示了載體pMON97063的圖。附圖9顯示了載體pMON94563的圖。附圖10顯示了載體pMON97066的圖。附圖11顯示了載體pMON96401的圖。附圖12顯示了載體pMON78528的圖。發明的詳細說明本發明通過提供用於創建具有改善的DHA和/或EPA含量的植物的方法和組合物克服了先有技術的局限性。有機體例如植物的脂肪酸含量的修飾呈現了許多益處，包括改善的營養和健康效益。脂肪酸含量的修飾可以用於實現在植物、植物部分和植物產物，包括植物種子油，以及細菌和真菌中有益水平的DHA和/或EPA。例如，當在植物的種子組織中產生DHA時，油可以從種子分離，一般地產生含油的DHA,其隨後可以用於提供食品和其他產物中有益的特徵。本發明的各個方面包括用於修飾細胞的PUFA含量的方法和組合物，例如，修飾植物細胞的PUFA含量。與本發明相關的組合物包括新的分離的多核苷酸序列、DNA構建體以及由本發明的多核苷酸轉化的植物和/或植物部分。宿主細胞可以被操作以表達編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶多肽的多核苷酸，所述多肽催化另一個多肽的磷酸泛醯巰基乙胺附著位點的泛醯巰基乙胺化。提供了以下定義作為對理解本發明的幫助。用語"DNA序列"、"核酸序列"、"核酸分子"和"核酸片段"是指包含核苷酸的有序排列的物理結構。DNA片段、序列或核苷酸序列可以含有在大核苷酸分子、載體等等之內。此外，在這些序列中核酸的有序排列可以以序列表、附圖、表格、電子媒體等等的形式描繪。用語"編碼序列"、"編碼區"、"結構序列"和"結構核酸序列"是指其中核苷酸以各自形成密碼子的一系列三聯體排列的DNA序列、核酸序列、核酸分子的全部或片段。每個密碼子編碼特定的胺基酸。因而，編碼序列、編碼區、結構序列和結構核酸序列編碼形成蛋白、多肽或肽序列的一系列胺基酸。編碼序列、編碼區、結構序列和結構核酸序列可以含有在大的核酸分子、載體等等之內。此外，在這些序列中核苷酸的有序排列可以以序列表、附圖、表格、電子媒體等等的形式描繪。術語"cDNA"是指互補於並來自mRNA的雙鏈DNA。"表達"是指一種過程，基因的編碼信息通過它被轉變為在細胞中存在並運作的結構。表達的基因包括被轉錄成RNA、然後被翻譯成蛋白質的那些，以及被轉錄成RNA但不翻譯成蛋白質的那些(例如，轉運RNA和核^唐體RNA)。如在此使用的，"基因"是指表達特定蛋白質的核酸片段，包括在編碼序列之前(5'非編碼序列)和之後(3'非編碼序列)的調節序列。"天然基因"是指在自然中存在具有其自身的調節序列的基因。"嵌合基因"是指任何基因，其不是天然基因，包含在自然中不在一起存在的調節和編碼序列。因而，嵌合基因可以包含來自不同來源的調節序列和編碼序列，或來自相同來源但以不同於自然中存在的方式排列的調節序列和編碼序列。"內源基因"是指在有機體的基因組中在其自然位置的天然基因。"外源基因"或"轉基因"是指通過轉化過程導入到基因組中的基因。轉基因包括通過轉化過程導入的基因組DNA(例如，與其活性啟動子連接的基因組DNA)。"異源，，是指來自不同來源的兩種或多種核酸或蛋白序列之間的關係。例如，如果這樣的組合不是自然中通常存在的，啟動子對於編碼序列是異源的。此外，如果在特定的細胞或有機體中不會天然發生，特定的核酸序列對於它所插入的細胞或有機體可以是"異源的"。"序列同源性"是指在兩個或更多核酸或胺基酸序列之間就位置同一性的百分比而言的相似性水平。術語同源性還用於指出在不同的核酸或蛋白之間的相似功能性質的概念。"雜交"是指當核酸鏈具有充分的序列互補性時核酸的第一鏈與第二鏈經由氫鍵鹼基配對結合的能力。如在此使用的，如果核酸分子顯示出完全的互補性，則稱核酸分子是另一個核酸分子的"互補物"。如此處使用的，當一個分子的每一個核苷酸與另一個分子的核苷酸互補時，稱為分子顯示出"完全的互補性"。因而，當它們的相互雜交具有足夠的穩定性以允許它們在合適的條件下保持相互的退火時，稱兩條核酸鏈具有充分的互補性。如在此使用的，術語"同源性"是指就核苷酸位置同一性百分比，即，序列相似性或同一性方面在多核苷酸序列之間的相似性水平或同一性百分比。如在此使用的，術語同源性還指在不同的多核苷酸分子之間的相似功能性質的概念。當在某些條件下它們特異性地雜交形成雙鏈體分子，多核苷酸分子是同源的。在這些條件下，稱為嚴格條件，一種多核苷酸分子可以用作探針或引物來鑑定享有同源性的其他多核苷酸分子。用語"嚴格條件"是對於通過特異性雜交操作，例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdeditionVolumes1，2,and3.J.F.Sambrook,D.W.Russell，andN.Irwin，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2000(SambrookWa/.)中所討論的，核酸探針與目標核酸(即，與感興趣的特定核酸序列)的雜交來功能上定義的。因而，本發明提供的核苷酸序列可以利用它們的能力來與多核普酸分子片段的互補延伸選擇性地形成雙鏈分子。取決於預想的應用，人們將希望採用變動選擇性的應用，人們一般希望採用相對I嚴格條件來形成雜交物，例如，人們將選擇相對低的鹽度和/或高溫度條件，例如在約50。C到約70。C下約0.02M到約0.15MNaCl所提供的。例如，高嚴格條件是以高嚴格洗滌緩衝液(0.2xSSC，0.1%SDS,65°C)洗滌雜交過濾器至少兩次。另外，曱醯胺可以用於提高嚴格度。因而高嚴格條件還包括5xSSC、50%曱醯胺和42°〇。通過雜交的多核苷酸分子^r測是本領域技術人員公知的，美國專利NO,4,965，188和5,176,995的教導是雜交分析方法的範例。用語"分離的"意指已經從其自然環境移除，不考慮它的最終分布。例如，"分離"自稻米的核酸序列，例如通過^Uf舀米細月包克隆，當^皮插入到玉米細胞的基因組時保持了"分離的"。用語"可操作連接"是指兩種或多種核酸區域或核酸序列的空間排列，從而它們發揮它們相互的合適效果。例如，啟動子區域可以相對於核酸序列放置，從而所述核酸序列的轉錄被所述啟動子區域指導。啟動子區域和核酸序列是"可操作連接的"。術語"磷酸泛醯巰基乙氨基轉移酶或PPT"是指一種通過輔酶A的4'-磷酸泛醯巰基乙胺部分與保守的絲氨酸殘基的共價附著，來催化載體蛋白例如聚酮化合物合酶的多肽的翻譯後活化的酶。術語"聚酮化合物合酶"是指由多功能多肽組成的酶複合物，所述多功能多肽以反覆方式催化複雜分子從單體底物的合成。在Mon'te〃awanVza中，PKS複合物從丙二醯基-CoA和乙醯-CoA合成DHA。例如，在M.man'"a中，PKS含有由開放閱讀框Orf5、Orf6、Orf7和Orf8編碼的4個多肽(MetzWa/.，2001),在美國專利6，140,486中分別被稱為Orf6、Orf7、Orf8和Orf9。為了活化這種複合物，磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶需要泛醯巰基乙胺基化由Orf5編碼的多肽。幼enwze〃"sp.SCRC2738的PKS複合物合成EPA(Metz"a/.,2001)。"上遊，，和"下遊，，是對於核苷酸序列的位置以及編碼序列的轉錄或翻譯方向所使用的位置術語，其通常在5'到3'方向上進行。術語"啟動子"或"啟動子區域"是指核酸序列，通常存在於編碼序列的上遊(5'),其能夠指導核酸序列成為RNA分子的轉錄。啟動子或啟動子區域一般提供了RNA聚合酶的識別位點以及適當的轉錄起始所必需的其他因素。如在此期待的，啟動子或啟動子區域包括通過插入或刪除調節區、使啟動子經歷隨機或定點誘變等等所衍生的啟動子變體。啟動子的活性或強度可以通過就它產生的RNA悽t量、或在細力包或組織中積累的蛋白質數量，相對於類似測量的第二啟動子來定量。用語"3'非編碼序列，，是指位於編碼序列的下遊的核苷酸序列，包括多聚腺苷酸識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調節信號其他序列。這些通常被成為3'非翻譯區域或3'-UTR。多腺苷酸化信號通常以影響多聚腺苷酸段向mRNA前體的3'末端的添加為特徵。不同的3'非編碼序列的作用由Ingelbrecht等(1989)例證。"翻譯前導區序列，，或"5'非翻譯區"或"5'UTR"都是指位於基因的啟動子序列和編碼序列之間的核苷酸序列。5'-UTR存在於完整加工的翻譯起始序列的mRNA上遊。5'-UTR可以影響向mRNA的主要轉錄產物的加工、mRNA穩定性或翻譯效力。已經描述了翻譯前導序列的實例(TurnerandFoster,1995)。"RNA轉錄產物"是指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄產生的產物。當RNA轉錄產物是DNA序列的理想互補拷貝時，它被稱為原始轉錄產物。來自原始轉錄產物的轉錄後加工的RNA序列被稱為成熟RNA。"信使RNA，，(mRNA)是指沒有內含子並且可以被細胞翻譯成多肽的RNA。"DNA構建體"是指相互可操作連接來裝配成重組DNA分子的異源遺傳元件，可以包含提供宿主細胞中DNA多核苷酸分子的表達的元件以及提供所述構建體的維持的元件。植物表達盒包含遺傳元件的可操作的連接，當被轉移到植物細胞中時提供期望的基因產物的表達。"重組載體"是指任何試劑，通過它或在它之中，目標核酸被擴增、表達或保存，例如質粒、粘粒、病毒、自主複製序列、噬菌體或線性單鏈的、環形單鏈的、線性雙鏈的、或環形雙鏈的DNA或RNA核苷酸序列。重組載體可以被合成，或來自於任何來源，並能夠基因組整合或自主複製。"調節序列"是指位於編碼序列或內含子的上遊(5')、之中或下遊(3')的核苷酸序列，它的存在或缺乏影響所述編碼序列的轉錄和表達。"基本上同源的"是指在序列上至少約90%相同的兩個序列，如通過例如DNAStar(Madison,WI)中的CLUSTALW算法所測量的。"基本上純的"是指從在其天然狀態通常與其相關的基本上所有其他分子在分離的分子。更優選的，基本上純的分子是在制品中存在的優勢種。基本上純的分子可以是大於約60%地沒有、優選的約75%地沒有、更優選的約90%地沒有、以及最優選的約95%地沒有天然混合物中存在的其他分子(不包括溶劑)。用語"基本上純的，，不意圖涵蓋以它們的天然狀態存在的分子。優選的，本發明的核酸分子和多肽是基本上純的。術語"轉化，，是指核酸導入接受者宿主中。術語"宿主"是指細菌細胞、真菌、動物或動物細胞、植物或種子、或任何4直物部分或組織，包括植物細胞、原生質體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、幼苗、胚芽和花粉。如在此使用的，"轉基因植物"是具有被穩定導入其基因組，例如核或質體基因組中的外源核酸的植物。術語"同基因，，作為具有或缺乏轉基因的植物或植物系之間的比較性術語，是指除了所討論的轉基因之外植物或林系具有相同或相似的遺傳背景。例如，代表來自親本F2群體的表型相似或相同選集的所謂的姐妹系被認為是"同基因的"。當使用未轉化的親本作為回交親本、使穩定的轉化植物的子代與未轉化的親本林系雜交或回交，同時針對型(通過分子標記物分析的基因型，或通過田間觀察的表型，或兩種)和轉基因來選擇時，產生的轉基因林系被認為是與其未轉化的親本系是高度"同基因的"。術語"種子"、"籽粒"和"穀粒"被理解為在含義上是等價。術語籽粒通常用於描述玉米或稻米植物的種子。在所有植物中，種子是由種皮、胚芽、糊粉和胚乳組成的成熟的胚珠。編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的核酸在一個實施方式中，本發明提供了來自MorZ&〃aman'wa的編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的新的核酸。在某些實施方式中，所述核酸包含SEQIDNO:2、4、6或8。本發明還提供了使用這種核酸，包括SEQIDNO:2、4、6和8的方法。在一個實施方式中，這些核酸分子在本發明的上下文中被用於改變植物種子中的油的組成。這些核酸分子可以-使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為才莫板和合適的寡核苷酸引物根據標準PCRTM擴增技術來擴增。做為選擇，它們可以使用標準的合成技術，例如自動化的DNA合成儀來合成。編碼期望的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的多核苷酸可以以多種方式來鑑定。舉例來說，期望的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的來源，例如來自Moritella的庫，用可檢測的酶學或化學合成的探針來篩選，所述探針可以從DNA、RNA或非天然發生的核苷酸、或其混合物產生。探針可以從已知的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的多核普酸酶學地合成，用於正常的或降低嚴格度的雜交方法。寡核苷酸探針也可以用於篩選來源，並且可以基於已知的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的序列，包括在已知的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶之中保守的序列，或基於從期望的純化蛋白質獲得的肽序列。基於胺基酸序列的寡核苷酸探針可以是簡併的，以包括遺傳密碼的簡併性，或者可以偏向於支持來源有機體的偏愛密碼子。寡核苷酸也可以被用作引物，用於從已知的或懷疑的來源反轉錄的mRNA的PCR;PCR產物可以是全長cDNA,或可以用於產生探針來獲得期望的全長cDNA。做為選擇，期望的蛋白質可以被完全地測序，並進行編碼多肽的DNA的完全合成。一旦分離出期望的基因組或cDNA,它可以通過已知的方法來測序。本領域公認的是，這些方法常遭遇錯誤，從而同一區域的多次測序是常規的，並仍然預期導致在產生的推斷序列中可測量的錯誤率，特別是在具有重複結構域、廣泛的二級結構、或稀有的鹼基組成的區域，例如具有高GC鹼基含量的區域中。當出現矛盾時，可以進行重新測序，並可以採用特殊的方法。特殊的方法可以包括改變測序條件，通過使用不同溫度；不同的酶；改變寡核苷酸形成高級結構的能力的蛋白質；改變的核苷酸例如ITP或曱基化的dGTP;不同的凝膠組成，例如，添加曱醯胺；不同的引物或遠離問題區域的引物；不同的模板例如單鏈DNA。還可以採用mRNA的測序。如果希望，編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的核酸的序列可以被修改而不改變表達的蛋白質的最終胺基酸序列，使得所述序列在植物宿主中更易於表達。編碼序列可以是人工的DNA。如在此使用的人工DNA是指非天然發生的DNA多核苦酸分子。人工DNA分子可以通過各種方法來設計，例如，基於取代第一多核苷酸的密碼子來產生等效物的本領域中已知的方法，乃至改進的、第二代人工多核苷酸，其中這種新的人工多核苷酸對於轉基因植物中增強的表達是有用的。設計方面通常採用密碼子利用率表，該表格通過編選分離自植物、植物型、科或屬的編碼序列集合中密碼子出現頻率來產生。其他設計方案包括降低多腺普酸化信號、內含子剪接位點、或序列的長的AT或GC延伸的出現(美國專利5,500,365)。全長編碼序列或其片段可以使用本領域技術人員已知的方法從人工DNA產生。維持了此處期待的功能、在此公開的核苷酸序列或調節元件的修飾處在本發明的範圍之內。這種修飾包括插入、替換和刪除，特別是反映了遺傳密碼的簡併性的替換。本發明從Mon'化〃a分離了產生具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的多肽的分離的DNA序列。編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的序列可以在轉基因植物、微生物或動物中表達來有效活化聚酮化合物合酶。也可以使用與在此提供的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶多核苷酸基本上相同的、或編碼與磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶多肽基本上相同的多肽的其他多核苷酸。"基本上相同的"是指胺基酸序列或核酸序列在優選性提高的順序上展現了與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7中的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶多肽序列或編碼這些多肽的序列至少75%、80%、85%、90%、95%、98或99%的同一性。使用序列分析軟體進行多肽或多核苷酸比較，例如，GCGWisconsin程序包的SequenceAnalysis軟體包(Acc勿s，SanDiego,CA)和MEGAlign(DNAStar，Inc.,1228S.ParkSt.,Madison,Wis.53715)。這種軟體通過指定相似性或同一性的程度來匹配相似的序列。DNA構建體本發明提供了DNA構建體，其包含與在此描述的核酸可操作連接的異源啟動子。啟動子的選擇，例如，可被描述為強表達、弱表達、可誘導表達、組織增強表達(即，在組織中特異地或優先地表達)、器官增強表達(即，在器官中特異地或優先地表達)和發育增強表達(即，在發育的特定階段特異地或優先地表達)的啟動子，在本領域技術人員的能力範圍內。類似地，如上所述的核酸分子與啟動子的組合也在本領域技術人員能力範圍內(參見,例如SambrookWa/.，1989)。本發明使用的啟動子一般包括，但不限於，在細菌、噬菌體、真菌或植物細胞中起作用的啟動子。用於細菌表達的有用啟動子有lacZ、Sp6、T7、T5或五.co/ZglgC啟動子。用於真菌的有用的啟動子包括5^ccAaramyce51cereWw'aeGall(West,Wa/.(1984))、ASaccAaramjyc&s1/蘭6enmtl(Maundrell，K.(1990))、A^ewmyporacraw"ccg-l(FreitagMandSelkerEU(2005))和屍/c/n'am"/mwo/z.caAUG1(Invitrogen)。用於植物細胞的有用的啟動子包括Y玉米蛋白Z27啟動子(參見，例如Lopes"a/.(1995))、L3oleosin啟動子(美國專利No.6,433,252)、大麥PER1啟動子(Stacey1996)、CaMV35S啟動子(Odell"a/.1985)、CaMV19S(Lawton"a/.，1987)、nos(Ebert"a/.,1987)、Adh(WalkerWa/.，1987)、蔗糖合酶(Yang"a/.,1990)、肌動蛋白(Wang"a/.,1992)、cab(SullivanWa/.,1989)、PEPCase啟動子(Hudspethe"/.,1989),或與R基因複合體相關的那些(Chandler"a/.，1989)。玄參花葉病毒(FMV)啟動子(Richins"a/.，1987)、arcelin、番茄E8、patatin、遍在蛋白、mannopine合成酶(mas)和微管蛋白啟動子是有用啟動子的其他實例。存在著各種各樣的植物啟動子序列，其可以用於驅動轉基因植物中編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的多核普酸的組織特異性表達。實際上，在本發明的特定的實施方式中，使用的啟動子是種子特異性啟動子。這些啟動子的實例包括來自這些基因例如napin(Kridl"a/.，1991)、菜豆蛋白(Bustos，1989)、大豆胰蛋白酶抑制物(Riggs,Wa/.，1989)、ACP(Baerson"1993)、石更脂醯基-ACP脫々包和酶(Slocombe"a/.,1994)、大豆卩-伴球蛋白的a'亞單位(P-Gm7Salpha',參見例如，Chen"a/.,1986)、Wc/a/a6aUSP(P-Vf.Usp,參見例如，美國專利申請10/429,516,SEQIDNO:1、2和3)、球蛋白啟動子(參見例如BelangerandKriz,(1991)，大豆卩-伴球蛋白的a亞單位(7Sa)(美國專利申請10/235,618,通過引用合併)和Zea畫"L3oleosin啟動子(P-Zm丄3，參見，例如，Honge"/.，1997)。在玉米中表達的啟動子包括來自編碼玉米蛋白(zeins)的基因的啟動子，玉米蛋白是在玉米胚乳中發現的一組儲存蛋白質。玉米蛋白基因的基因組克隆已經被分離(Pedersen"a/.,1982;RussellWa/.,1997),可以使用來自這些克隆包括15kD、16kD、19kD、22kD和27kD基因的啟動子。已知在玉米中和在其他植物中起作用的其他種子表達增強啟動子包括以下基因的啟動子WaxyU效粒結合的澱粉合酶)、Brittle和Shrunken2(ADP葡萄糖焦磷酸化酶)、Shrunken1(蔗糖合酶)、分支酶I和II、澱粉合成酶、脫支酶、oleosins、谷蛋白和Betll(基礎胚乳轉移層)。本領域技術人員已知的在本發明的實踐中有用的其他啟動子也是本發明預期的。此外，轉錄增強子或增強子的複製物可以用於提高來自特定啟動子的表達。這些增強子的實例包括，但不限於，Adhintronl(Callis"a/.,1987)、稻米肌動蛋白內含子(McElroyW,1991;美國專利No，5，641，876)、蔗#唐合酶內含子(Vasil""/.,1989)、玉米HSP70內含子(也稱為Zm.DnaK)(美國專利5,424,412,Brown"fl/.)、TMVQ元件(GallieWfl/.,1999)、CaMV35S增強子(美國專利5,359,142&5,196,525,McPhersonW)或章魚石鹹合成酶增強子(美國專利5,290,924,LastWa/.)。由於轉錄起始位點和編碼序列的起點之間的DNA序列，即，非翻譯前導序列可以影響基因表達，人們也可以希望採用特定的前導序列。可以採用本領域技術人員可獲得的任何前導序列。優選的前導序列指導連接的基因的最佳表達水平，例如，通過提高或維持mRNA穩定性和/或通過防止不適當的翻譯起始(Joshi,1987)。這種序列的選擇處於本領域技術人員的處理能力之內。本發明的DNA構建體可以包括靠近所述盒的3'末端的序列，其充當信號來終止異源核酸的轉錄，並指導產生的mRNA的多聚腺苷酸化。這些通常被成為3'非翻譯區域或3'-UTR。可以作為轉錄終止信號的某些3'元件可以包括來自Agrobacteriumtumefaciens的胭脂石鹹合成酶基因(nos)的那些(Bevan^a/.,1983)、napin3'非翁3譯區(Kridl"a/.,1991)、球蛋白3'非翻譯區(BelangerandKriz,1991)、來自大豆的Adrl2基因的3，非翻譯區(發育素下調的)(Wang"a/.，PCT公開WO200250295)或來自zein基因，例如Z27的一種(Lopes"a/.,1995)。本領域已知的其他3'調節元件也可以用於本發明的載體中。在此描述的核酸分子可以被克隆到任何適合的載體中，並可以用於轉化或轉染任何適合的宿主。載體的選擇和構建它們的方法是本領域熟知的，在技術文獻中一般地描述了(一般參見，"RecombinantDNAPartD"(1987))。所述載體將優選地包含調節序列，例如轉錄和翻i爭起始密碼子以及終止密碼子，其特異於載體將要導入其中的宿主類型，視情況地並考慮該載體是DNA還是RNA可以製備環形或線形的載體構建體，含有連接到在原核或真核宿主細胞中有功能的複製系統的如上所述的完整核酸序列或其部分。複製系統可以來源於ColEl,2mp質粒、X噬菌體、fl絲狀噬菌體、jgro^acfen'wm4勿種(例^口，Afw/we/ac/ews牙口Ar/H'zog^wes)等等。除了複製系統和插入的核酸序列之外，所述載體可以包括容許選擇轉化或轉染的宿主的一種或多種標記基因。標記基因包括抗生抗性，例如，對抗生素、重金屬、除草劑等等的抗性，在營養缺陷宿主中的補足來提供原養，等等。本發明提供了包含在此描述的核酸分子、任選的以載體形式的核酸分子的宿主細胞。適合的宿主包括植物、細菌和真菌細胞，包括Sacc/mram;;c&scereWWae和臉wms/oracms510。五.co"宿主包括TB-1、TG畫2、DH5a、XL畫BlueMRF，(Stratagene，Austin,TX)、SA2821、Y1090和TG02。才直物細月包包^^f旦不限於，大豆、Brassicacampestris、油菜、含油種子油菜(oilseedrape)、油菜籽(rapeseed)、海甘藍、芥菜、蓖麻、花生、芝麻、棉籽、亞麻籽、紅花、油棕、亞麻、葵花、苜蓿、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、粟、高粱和稻米構成的組。在宿主細胞中的表達可以以短暫的或穩定的方式實現。短暫的表達可以從導入的構建體發生，其含有在宿主細胞中起作用的表達信號，但是所述構建體不能複製並且很少在宿主細胞中整合，或者所述宿主細胞不能增殖。短暫表達也可以伴隨著誘導與感興趣的基因可操作連接的可調節啟動子的活性，從而這種誘導系統經常展現很地的基礎表達水平。通過導入可以整合到宿主基因組中、或可以在宿主細胞中自主複製的構建體，可以實現穩定的表達。通過使用位於所述表達構建體上、或用表達構建體轉染的可選擇標記，隨後選擇表達所述標記的細胞，可以選擇感興趣基因的穩定表達。當穩定的表達來自整合時，構建體的整合可以在宿主基因組內隨機地發生，或可以通過使用含有與宿主基因組同源的區域的構建體，其足以將重組物靶向宿主基因座。當構建體被耙向內源基因座時，全部或某些轉錄和翻譯調節區域可以由內源基因座提供。宿主細胞中的表達可以涉及本領域:技術人員已知的發酵技術。發酵的宿主細月包可以是原4亥生物，例in五化/^n'c/H》co/z',或真4亥生物，例3口酵母5Vzcc/m廠om;;c&s1cerevz'Wae、或絲習犬真菌7Vewrcwpo廠acrtwsa。通過發酵生產PUFA的實例包括MoWwe〃a(美國專利6,319,698)和77irawWracA;^7'a/es(美國專利6,451,567)。期待的是通過使用游離的或整合的表達載體，超過一個基因可以被導入並在宿主細胞中增殖。當兩種或更多基因從獨立的複製載體中表達時，希望的是每個載體具有不同的複製方式。每個導入的構建體，無論是整合的或不是，將具有不同的的選擇方式，並且應當沒有與另一個構建體的同源性，以維持穩定表達並防止構建體之間元件的重新分配。導入的構建體的調節區域、選擇方式和增殖方法的明智選擇可以實驗上地確定，從而所有導入的多核苷酸以必需的水平表達來提供期望的產物的合成。多肽本發明提供了由在此描述的核酸分子編碼的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶。聚酮化合物合酶是由多功能的多肽組成的酶複合物，所述多肽以反覆的方式催化複雜分子從單體底物的合成。在肘0〃>//(3man'""中，PKS複合物從丙二醯基-CoA和乙醯-CoA合成DHA。為了活化這種複合物，需要磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶。所述多肽優選的包含氨基末端和羧基末端。所述多肽可以包含D-胺基酸、L-胺基酸，或D-與L-胺基酸的混合物。對天然胺基酸序列產生變體多肽的改變可以通過本領域普通技術人員已知的各種方法來製備。例如，通過在合成時改變核酸分子的序列可以方便地將胺基酸替換引入所述多肽中。通過將包含修飾的序列的合成寡核苷酸連接到表達載體中，也可以引入位點特異性突變。作為選擇，可以使用寡核苷酸指導的、位點特異性誘變步驟，例如在Walder"(1986);Bauer"a/.(1985);和美國專利4,518,584和4,737,462.中公開的。在本領域普通技術人員能力範圍內的是選擇合成的和天然發生的胺基酸，其作為對任何特定的天然發生胺基酸的保守性或中性替換。普通技術人員理想地將考慮進行任何特定胺基酸替換的環境，還考慮側鏈的疏水性或極性、側鏈的一般大小、在生理條件下具有酸性或鹼性的側鏈的pK值。例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸通常適合相互替換，更通常地是精氨酸和組氨酸。本領域已知的是，這是因為所有三個胺基酸都具有鹼性側鏈，而賴氨酸和精氨酸的側鏈的pK值相互之間比組氨酸(約6)更接近(約10和12)。類似地，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸通過適當地相互取代，條件是甘氨酸通常不適合替代該組的其他成員。這是因為當摻入到多肽中時這些胺基酸的每一個都是相對疏水性的，但是甘氨酸缺乏a碳容許了旋轉的phi和psi角(在a碳周圍)有這樣大的構象自由度，從而甘氨酸殘基可能觸發在其他胺基酸相互替換時通常不發生的構象或二級結構中的改變。通常適合相互替換的其他胺基酸組包括但不限於，由穀氨酸和天冬氨酸構成的組；由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸構成的組；以及由絲氨酸、蘇氨酸和任選的酪氨酸構成的組。另外，普通技術人員可以容易地分類合成胺基酸和天然發生的胺基酸。如果期望，所述多肽可以被修飾，例如，通過糖基化、醯胺化、羧化作用或磷酸化，或通過加酸鹽、醯胺、酉旨、特別是C-末端酯以及本發明的多肽的N-醯基衍生物的生成。通過根據本領域已知的方法與其他部分形成共價或非共價複合物，所述多肽還可以被修飾來產生蛋白衍生物。共價結合的複合物可以通過將化學部分連接到多肽包含的胺基酸的側鏈的功能基團上，或連接到N-或C-末端來製備。理想地，這種修飾和結合不會有害地影響多肽(和其變體)的活性。雖然這種修飾和結合可能具有更大或更小的活性，所述活性期望地不是消極的，並且是未改變的多肽的特徵。所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以通過多種常規技術的任何一種來製備。所述多肽可以是從天然發生的來源或從重組來源分離的或基本上純化的。例如，對於重組蛋白來說，編碼期望的蛋白質的DNA片段可以使用公知的分子遺傳技術(參見，例如，ManiatisWa/.，1989)和在此處的"實施例，，中引用的其他參考文獻)亞克隆到合適的載體中。片段可以被轉錄，蛋白隨後在體外翻譯。也可以採用商業上可獲4f的^式劑盒(例3口，由Clontech,MountainView，CA;AmershamLifeSciences,Inc.,ArlingtonHeights,IL;Invitrogen,Carlsbad,CA等等生產的)。任選的可以在核酸的操作中採用聚合酶鏈式反應。多肽也可以根據本領域已知的方法使用自動化肽合成儀來合成。作為選擇，所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以使用本領域普通技術人員公知的標準肽合成^支術(例如，如Bodanszky(1984)中概述的)來合成。特別地，所述多肽可以使用固相合成的步驟來合成(參見，例如，Merrifield,1963;BaranyWa/.，1987;和美國專利5,424,398)。如果期望，這可以使用自動化肽合成儀來進行。t-丁氧基羧基(t-BOC)或9-芴甲氧羰基(Fmoc)胺基酸保護基團的去除以及蛋白從樹脂上的分離可以伴隨著例如在降低的溫度下的酸處理。含多肽的混合物任何可以被提取，例如，使用二乙醚，來除去非肽有機化合物，合成的蛋白質可以從樹脂粉未中提取(例如，使用約25%w/v乙酸)。在多肽的合成之後，任選地可以進行進一步的純化(例如，使用HPLC)來消除任何不完整的蛋白質、多肽、肽或游離胺基酸。胺基酸和/或HPLC分析可以對合成的多肽進行來驗證其身份。對於根據本發明的其他應用，優選的是產生所述多肽來作為更大的融合蛋白的部分，通過化學結合，或通過本領域已知的遺傳學方法。就此來說，本發明還提供了包含所述多肽(或其片段)或其變體以及具有任何期望的性質或效應物功能的一種或多種其他多肽/蛋白的融合蛋白。對於特定蛋白質的生產和鑑定的分析是基於各種物理-化學的、結構的、功能的，或蛋白質的其他性質。獨特的物理-化學或結構性質容許通過電泳步驟，例如天然或變性凝膠電泳或等電聚焦，或者通過層析技術，例如離子交換或凝膠排阻層析來分離和鑑定。單獨蛋白質的獨特結構提供了使用特異性抗體來以例如ELISA分析的形式檢測它們存在的才幾會。方法的組合可以用於實現更高的特異性，例如Western印跡，其中抗體被用於定位已經通過電泳技術分離的單獨基因產物。其他技術可以用於確切地確認目標產物的身份，例如通過純化後的胺基酸測序來評估。雖然這些是最常見的，也可以使用其他步驟。分析過程可以通過蛋白質的功能來鑑定蛋白質的表達，特別是當表達的蛋白質是能夠催化涉及特定底物和產物的化學反應的酶時。例如，在植物提取物中，這些反應可以通過物理和/或化學過程通過提供和測定反應的底物損失和產物生成來測量。在很多情況下，基因產物的表達通過評估其表達的表型結果來確定。這種評估可以僅僅是視覺觀察，或可以包括分析。這種分析可以採取許多形式，例如，分析植物的化學成分、形態學或生理性質方面的改變。通過表達編碼酶或儲存蛋白質的基因、或通過改變澱粉數量的酶、或通過改變油組成的酶，可以改變化學組成，所述儲存蛋白質改變胺基酸組成並且這種改變可以通過胺基酸分析來檢測，所述澱粉數量可以通過近紅外反射光譜來分析，所述油組成可以通過氣相色語法來檢測。形態改變可以包括更大的身材或更厚的莖杆。本發明的核酸分子、DNA構建體和多肽可以用於農業方法和各種篩選分析中。例如，核酸分子可以用於在宿主細胞中經由載體表達磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶，用於檢測生物樣品中編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的mRNA轉錄產物，用於經由Southern印跡來4全測編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的基因中的遺傳改變，用於抑制磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶，或用於增量調節磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶。所述多肽可以用於在植物中補償磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的缺失，或補償具有降低的活性或無活性的突變磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的存在，或用於在植物中處理磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的過多的底物水平，不管是直接還是間接的。做為選擇，所述多肽可以用於根據調節它們活性的能力來篩選試劑。抗體可以用於檢測和分離相應的多肽，以及降低這種多肽在體內的可用性。植物轉化在本發明的優選的實施方式中，產生表達期望的蛋白質的轉基因植物。向植物細胞中導入編碼期望的蛋白質的期望的多核苷酸序列的各種方法是本領域已知的，包括(l)物理方法，例如顯微注射、電穿孔和微粒介導的遞送(biolistics或基因槍技術)；(2)病毒介導的遞送；和(3)土壤桿菌介導的轉化。植物細胞轉化的最常用的方法是土壤桿菌介導的DNA轉移過程，以及biolistics或微注射微粒轟擊介導的過程。一般地，核轉化是期望的，但當專門地轉化質體，例如葉綠體或澱粉體是期望的時，可以利用期望的多核苷酸的微粒介導的遞送來轉化植物質體。土壤桿菌介導的轉化通過使用屬於土壤桿菌屬的遺傳工程化的土^泉糹田菌來實現。帶有Ti或Ri質粒的fwme/a"'ews和爿gra^c化n'wmr/n'zogew^的許多野生型和解除的菌才朱可以用於才直物的基因轉移。經由稱為"T-DNA"的特定DNA的轉移來進行向許多植物品種中的基因轉移，所述特定DNA可以被遺傳工程化來攜帶任何期望的DNA片段，如在例如Bidney等的美國專利6,265,638中進一步詳細描述的，通過引用將其公開內容合併在此。土壤桿菌介導的植物的遺傳轉化涉及幾個步驟。第一步，其中強毒土壤桿菌和植物細胞首先相互接觸，一般稱為"接種"。接種優選地伴隨著某些對一些植物細胞的損傷方法，其是否植物細胞成分，例如coumaryl醇類、sinapinate(其被還原為乙醯丁香酮)、芥子醇和松柏醇，其活化土壤桿菌中的致病因子。在接種之後，允許土壤桿菌和植物細胞/組織在適合生長和T-DNA轉移的條件下一起生長几小時到幾天或更久的一段時間。這個步驟稱為"共培養"。在共培養和T-DNA遞送之後，用殺細菌或抑細菌試劑處理植物細胞來殺死保持與外植體接觸的和/或在含有外植體的器皿中的土壤桿菌。如果在缺乏任何選擇性試劑的情況下進行這個步驟，以促進轉基因植物細胞相對於非轉基因植物細胞的優勢生長，則這一般稱為"延遲"步驟。如果在存在偏愛轉基因植物細胞的選擇壓力的情況下進行這個步驟，則它被稱為"選擇"步驟。當使用"延遲"時，一般跟隨著一個或多個"選擇"步驟。對於微粒轟擊(美國專利No.5，550,318(Adams"a/.);美國專利No.5,538,880(Lundquistet.al.)、美國專利No.5，610，042(Chang"a/.);和PCT公開WO95/06128(AdamsWa/.);通過完全引用將它們每一個特別地合併在此)，用核酸包被微粒子，並通過推力遞送到細胞中。示範性的顆粒包括由鴒、鉬和優選的金組成的那些。通過加速將DNA遞送到植物細胞中的方法的說明性實施方式是Biolistics顆粒遞送系統(BioRad,Hercules,CA)，其可以用於將包祐:有DNA或細胞的顆粒通過篩子，例如不鏽鋼篩或Nytex篩推進到用懸浮液中培養的單子葉植物細胞覆蓋的過濾器表面上。微粒轟擊技術是廣泛可用的，可以用於轉化實際上任何植物物種。已經通過微粒轟擊轉化的物種的實例包括單子葉植物物種，例如玉米(國際公開NO.WO95/06128(AdamsWa/.))、大麥、小麥(美國專利NO.5,563,055(TownsendWa/.)，通過完全引用合併在此)、稻米、燕麥、黑麥、甘蔗和高粱；以及許多雙子葉植物，包括菸草、大豆(美國專利NO.5,322,783(Tomes通過完全引用合併在此)、葵花、花生、棉花、番茄和一4殳的豆莢(美國專利No.5,563,055(TownsendWa/.)，通過完全引用合併在此)。為了對轉化的植物細胞進行選擇或記分而不考慮轉化方法，被導入細胞中的DNA含有基因，其在可再生的植物組織中起作用來產生為植物組織賦予對其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可選擇、可篩選或可記分標記物的目標基因將包括但不限於P-葡糖醛酸酶(GUS)、綠色螢光蛋白(GFP)、螢光素酶(LUX)、抗生素或除草劑耐受性基因。抗生素抗性基因的實例包括青黴素、卡那黴素(和新黴素、G418、博來黴素)；氨曱蝶呤(和三曱氧苄二氨嘧啶)；氯黴素；卡那黴素和四環素。編碼涉及除草劑耐受性的蛋白質的多核苷酸分子是本領域已知的，包括但不限於關於草甘膦耐受性的美國專利No.5，627,061(Barry，"a/.,)、美國專利No5,633,435(Barry,"a/.，)和美國專利No6,040,497(Spencer，Wa/.，)中描述的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多核普酸分子和美國專利No.5,094,945(Comai)中描述的aroA;關於溴苯腈耐受性的美國專利No.4，810,648(Duerrschnabd，w/.,)中描述的編碼溴苯腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；關於達草滅耐受性的在Misawa，Wa/.,(1993)和Misawa，Wa/.，(1994)中描述的編碼八氫番茄紅素脫飽和酶(Ccrtl)的多核苷酸分子；Sathasiivana/.(1990)中描述的針對磺醯脲除草劑的抗性的編碼乙醯羥基酸合酶(AHAS，akaALS)的多核苷酸分子；以及Wohlleben,"g/.，(1988)中描述的戶W基因和DeBlock,Wa/.,(1987)中描述的bar基因，其各自提供了glufosinate和bialaphos耐受性。來自各種轉化的外植體的植物的再生、發育和培養是本領域中充分記載了的。這種再生和生長過程一般包括選擇轉化的細胞和培養那些個體化的細胞的步驟，從一般的胚胎發育階段到生根的植物苗階段。類似地再生轉基因胚芽和種子。然後將產生的轉基因的生根的芽種植到合適的植物生長培養基，例如土壤中。在對選擇性試劑的暴露下倖存的細胞，或在篩選分析中記分為陽性的細胞，可以在支持植物再生的培養基中培養。在轉移到溫室或生長箱發育成熟之前，將發育的植物苗轉移到少土的植物生長混合物中，並鍛鍊得耐寒。本發明可以使用任何可轉化的細胞或組織。在此使用的可轉化是指細胞或組織能夠進一步增殖來產生植物。本領域技術人員認識至'J,許多才直物細胞或組織是可轉化的，其中在外源DNA的插入和合適的培養條件之後，植物細胞或組織可以形成分化的植物。適合於這些目的的組織可以包括但不限於不成熟的胚芽、鱗片組織、懸浮細胞培養物、不成熟的花序、芽分生組織、結節外植體、愈傷組織、胚軸組織、籽葉、根和葉。以上引述的TomesWfl/.'783專利描述了一種方法，用細胞分裂素處理、隨後孵育一段時期，足以允許子葉節組織中的未分化細胞分化成分生組織細胞，並允許細胞進入發育的Gl和分裂期之間的階段，聲稱其改善了轉化的敏感性。可以使用任何適合的植物培養基。適合的培養基包括但不限於，基於MS的培養基(MurashigeandSkoog,1962)或基於N6的培養基(ChuWa/.，1975)，補充有植物生長調節劑，包括但不限於發育素、細胞分裂素、ABA和赤黴素。本領域技術人員熟悉組織培養基的變化，當適當地補充時，其支持了植物組織生長和發育，並適合於植物轉化和再生。這些組織培養基可以作為商業產品購買，或常規地製備或修改。本領域技術人員知道，用於轉化和再生的培養基和培養基添加劑例如營養物和生長調節劑，以及其他培養條件，例如孵育期間的光強度、pH值和孵育溫度，可以根據特定的目標品種來優化。在DNA構建體被穩定地摻入到轉基因植物中並被確認是可操作的之後，它可以通過有性雜交導入到相同其他植物或另一種有性相容的物種中。取決於要雜交的物種，可以使用許多標準育種技術的任一種。的植物，還包括這些植物的子代。如在此使用的，術語"子代"表示根據本發明製備的親本植物的任何世代的後代，其中所述子代包括根據本發明製備的選定DNA構建體。如在此公開的，"雜交"植物來提供相對於起始植物系具有一個或多個添加的轉基因或等位基因的植物系，被定義為通過雜交起始系與包含本發明的轉基因或等位基因的供體植物系引起特定的序列被導入植物系的技術。為了實現這一點，例如，人們可以進行以下的步驟(a)第一(起始系)和第二(包含期望的轉基因或等位基因的供體植物系)親本植物的植物種子；(b)將所述第一和第二親本植物的種子生長成帶有花朵的植物；(c)用來自第二親本植物的花粉傳粉到第一親本植物的花；以及(d)收穫帶有受精的花朵的親本植物上產生的種子。回交在此被定義為包括以下步驟的過程(a)將含有期望的基因、DNA序列或元件的第一基因型的植物與缺乏所述期望的基因、DNA序列或元件的第二基因型的植物雜交；(b)選擇含有所述期望的基因、DNA序列或元件的一個或多個子代植物；(c)將所述子代植物與第二基因型的植物雜交；和(d)重複步驟(b)和(c)以將期望的DNA序列從第一基因型的植物轉移到第二基因型的植物。DNA結果。DNA序列已經基因插入其中的植物基因型可以稱為回交轉化的基因型、系、自交體或雜交體。類似地，缺乏期望的DNA序列的植物基因型可以稱為未轉化的基因型、系、自交體或雜交體。種子、粗粉、油和包含種子、粗粉和油的產品本發明還提供了超過約1000、更優選的約20,000、再更優選的約40,000個種子的容器，其中超過約10%、更優選的約25%、更優選的約50%、再更優選的約75%,或更優選的約90%的種子是來自本發明的植物的種子。本發明還提供了超過約10kg、更優選的約25kg、再更優選的約50kg種子的容器，其中超過約10%、更優選的約25%、更優選的約50%、再更優選的約75%,或更優選的約90%的種子是來自本發明的植物的種子。本發明的任何才直物或其部分可以被收穫，以及任選的一皮加工來產生飼料、粗粉或油產品。為這個目的的特別優選的植物部分是收穫的穀粒，但可以收穫其他植物部分並用於乾草或青貯料。產生飼料、粗粉和油產品的方法是本領域已知的。參見，例如，美國專利4,957,748;5,100,679;5，219，596;5,936,069;6,005,076;6,146,669;和6,156,227。本發明的穀粒或相4分可以與其他穀粒或粗4分混合。方法
技術領域：
：本發明提供了提供具有提高的DHA或EPA含量的轉基因植物的方法。這種方法可以包括，例如，將編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶和PKS複合物的DNA導入植物細胞中，並從所述轉基因的細胞再生具有提高的DHA或EPA含量的植物。更具體地，本發明提供了生產含有DHA或EPA的植物油的方法，包括步驟(a)生長包含用DNA構建體轉化的宿主細胞的植物，所述DNA構建體包含與編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的多肽的DNA分子可操作連接的異源啟動子，其中所述DNA分子選自以下構成的組在5xSSC、50%曱醯胺和42。C的條件下，與SEQIDNO:6或SEQIDNO:8雜交的多核普酸，或其互補物；編碼SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列的多核苷酸；編碼與SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸；編碼SEQIDNO:l的多肽的多核苷酸；以及編碼SEQIDNO:3的多肽的多核苷酸，其中所述宿主細胞進一步包含聚酮化合物合酶；(b)產生種子；和(c)加工所述種子來獲得油。本發明進一步提供了提供轉基因植物的方法，所述轉基因植物可以含有提高的DHA或EPA水平，其中所述提高的水平大於在非轉化的植物中存在的水平。對於飲食補充，純化的PUFA、轉化的植物或植物部分、或其衍生物，可以摻入烹調油、脂肪或配製的人造黃油中，從而在正常使用中接受者將接受期望的數量。PUFA也可以摻入嬰兒配製食品、營養增補劑或其他食物產品，可以用作抗炎試劑或膽固醇降低試劑。如在此使用的，"可食用組合物，，被定義為可以被哺乳動物攝食的組合物，例如食品、營養物質和藥物組合物。如在此使用的，"食品"是指可以用作或被製備用作哺乳動物的食物的物質，包括可以在食物(例如油炸用油)或食物添加劑的製備中使用的物質。例如，食品包括用於人類消費的動物，或由此而來的任何產品，例如，雞蛋。典型的食品包括但不限於飲料(例如，軟飲料、充碳酸氣的飲料、準備混合的飲料)、泡製的食物(例如，水果和蔬菜)、調味汁、調味料、色拉油、果汁、糖漿、餐後甜點例如，布丁、凍、結冰的和填滿的、烘焙食品和冷凍甜食，例如冰淇淋和水糕)、軟冷凍食品(例如，軟冷凍奶油、軟冷凍冰洪淋和酸奶，軟冷凍奶油，例如乳制的和非乳制的人造稠黃油)，油和乳化的產品(例如，起酥油、人造黃油、蛋黃醬、黃油、烹調油和色拉油)和半乾食品(例如，米飯和狗糧)。添加劑或補充劑被攝食。這些可以與營養物質例如各種維生素和礦物質一起配製，並摻入基本上液體的組合物，例如營養飲料、豆漿和湯中，基本上固體的組合物；以及明膠，或用於形成粉末來包括入各種食物。在這種功能或健康食物中有效成分的含量可以類似於典型的藥物試劑中含有的。純化的PUFA、轉化的植物或植物部分也可以摻入到動物，特別是家畜的祠料中。這樣，動物自己可以受益於富含PUFA的膳食，而來自這種家畜的食物產品的人類消費者也可以收益。對於藥物用途(人類或獸醫)，所述組合物一般可以口服地施用，但是可以通過任何途徑來使用，通過所述途徑它們可以被成功地吸收，例如胃腸外的(即，皮下的、肌內注射的或靜脈內的)、直腸的、陰道的或體表的，例如，皮膚軟膏劑或洗液。本發明的PUFA、轉化的植物或植物部分可以單獨施用，或與藥學上可接受的載體或賦形劑組合地施用。當可用時，膠嚢是優選的口服施用形式。如以上闡述的膳食添加劑也可以提供口服的施用途徑。本發明的不飽和酸可以以共軛的形式，例如，鹽、酯、醯胺或脂肪酸的前藥來施用。任何藥學上可接受鹽被本發明包括，特別優選的是鈉、鉀或鋰鹽。還包括的是N-烷基多羥基胺鹽，例如N-曱基葡糖胺，在PCT公開WO96/33155中找到。優選的酯是乙酯。對於固體鹽，PUFA也可以以片劑形式施用。對於靜脈內施用，PUFA或其書於生物可以摻入到商用配方，例如Intralipids中。實施例包括以下實例來說明本發明的實施方式。本領域的技術人員應當理解，在根據本發明人公開的當前技術的實施例中所公開的技術在本發明的實踐中良好地運作。然而，本領域的技術人員根據當前公開的內容應當理解，可以在公開的特定的方案中進行許多變化，在不離開本發明的概念、精神和範圍的情況下仍獲得相象的或類似的結果。更具體地，顯而易見的是，可以用化學上和生理學上都相關的某些試劑替換在此描述的試劑，而達到相同的或相似的結果。對於本領域的技術人員顯而易見的所有這種相似的替換和修改都認為處在由附隨的權利要求所定義的本發明的精神、範圍和概念之內。實施例1磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶序列的克隆克隆了三種細菌磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶。來自Wewa"e〃aSCRC-2738的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(Ppt)的胺基酸序列(SEQIDNO:17)被用於檢索公眾資料庫的在EPA或DHA生物合成中起作用的新的；/^。這種檢索產生了來自57ew"we〃flowe/t/e"w^MR-1(SEQIDNO:1)(So-///)和Co/廳脂"c/^，/麼"(SEQIDNO:3)(Cp-///)的推定的來自S/^mme〃ao"e^e"w、PCRMR-l(SEQIDNO:2)和Co/we〃z'a;"c/^eo;Arae"(SEQIDNO:4)的；;^的核酸序列4吏用以下的引物配對使用ExpandHighFidelityPCR系統(Roche,AppliedScience,Indianapolis,IN)來克隆Shewnew5':tcgagctcgcatatgaagattgagcttttttttatacc(SEQIDNO:9)Shew3':tcttaattaattagtcagccaaactagccgo(SEQIDNO:10)Colwenew5':tcgagctcgcatatgacttctttttctcaatctg(SEQIDNO:11)Colwe3':tcttaattaattagatttcctgataaccaagtag(SEQIDNO:12).使用對於57^K^ze〃a和Co/we肌ap//分別設置在55。C和52。C的熔解溫度擴增基因25個循環。PCR產物用7V&I和消化，並連接到AWd和消化的NovagenpACYC-Duet-l(EMDBiosciences,Darmstadt,Germany)，分別引起pMON68081(附圖1)和pMON68080(附圖2)的形成。為了克隆A/oW&〃aman>m石奔酸泛醯3危基乙胺基轉移酶(Mm-)，比對S/^HYme〃aSCRC-2738;/^(SEQIDNO:18)、C./"c/^eo^raea戶^和S.owaV/e"w、MR-1的核苷酸序列來鑑定這些序列的最保守的區域。So卞;^(SEQIDNO:2的bps425-635)和Q7-//7/(SEQIDNO:4的bps389-596)中的保守核苷酸序列的區域通過這種比對來鑑定出，選擇這個區域中的序列來產生探針，利用來自C./"c/^eo^Araea和ow^We"w\yMR-1的基因組DNA作為模板DNA和以下的引物ShewandlaFltaggtgtcgatattgagcggg(SEQIDNO:13)ShewnellaRltoaaa能caaaggattttaae(SEQIDNO:14)ColwelliaFltcggttgtgatgttgaaaatac(SEQIDNO:15)ColwelliaRlttaaaactaaaatcagcgagt(SEQIDNO:16).根據廠家的方案使用PCRDIG探針合成試劑盒(Roche)產生毛地黃毒苷標記的探針，用於94。C、55。C和65。C各30秒的30個循環，之後在65。C孵育7分鐘，和隨後在4。C孵育。毛地黃毒苷標記的探針用於Southern雜交來探測M.總基因組DNA中的同源序列，cwe^eww;MR-1和C.;^c/^eo^raea作為陽性對照。根據廠家的方案使用DIGEasyHyb(Roche)在30。C進行雜交。使用0.5xSSC、0.1%SDS在室溫下洗滌濾過器兩次。使用抗毛地黃毒苷-AP、Fab片段和DigWash和BlockBufferSet(Roche)根據廠家方案顯現Dig標記的探針。使用Co/we肌a探針獲得了來自Mman'加DNA的最強信號。在某些情況下，這些信號與使用幼enw2e〃G探針從M.manTmDNA獲得的弱信號重合。根據Southern雜交實驗，選擇M.wan'waDNA的和屍Wl消化來克隆雜交片段。使用Sg/II或屍WI消化總基因組DNA,在瓊脂糖凝膠上大小分級，切下適當大小的片段。使用Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)純化DNA片段。分級的DNA的等分量在瓊脂糖凝膠上跑動，使用Turboblotter(Schleicher&Schuell，Keene,NH)根據廠家的方案印跡在尼龍膜(Roche,Mannheim,Germany)上。目標片段通過利用Co/we〃&探針的Southern雜交來鑑定。選擇Sg/II級分5和屍WI級分4來產生pSP72中的部分庫(Promega,Madison，WI)。這些庫轉化到」&c/^n'c/H'aco/ZDH5a中，克隆的庫等分到96孔平板的反應孔中過夜生長。培養等分量進行旋轉沉澱，丟棄上清液，細胞顆粒重懸浮在lOjil10。/qSDS溶液中。細胞顆粒加熱l分鐘到100°C,點樣在尼龍膜(Roche)上。根據廠家方案，通過在含有1.5MNaCl的0.5MNaOH中孵育5分鐘，通過在含有1.5MNaCl的0.5MTris/HCl、pH7.6中孵育5分鐘來中和，在2xSSC中洗滌5分鐘，在StratageneUV-Stratalinker2400(Stratagene,LaJolla,CA)中通過1分鐘UV孵育來固定，使DNA變性。使用Co/we〃/ap內探針探測所述印跡。陽性信號跟蹤回來源反應孔，來自該反應孔的等分量平鋪來獲得單個菌落。這些單個的菌落接種到含有100mg/1carbampicillin的250i!lLB中。生長細胞，重複如上所述的雜交操作來鑑定含有單個陽性克隆的反應孔。生長陽性克隆，分離質粒DNA,並用Sg/H、屍vwll、屍WI或Sa/I消化。這些消化物用於Southern雜交來確認陽性克隆。此時，所有剩餘的克隆被發現是陽性的。挑選最終的克隆中的三個(兩個^g/n克隆和一個屍Wl克隆)用於DNA測序分析。完整序列的生物信息學分析揭示了，屍WI克隆僅含有部分Mw-p/"而Sg/II克隆含有完整的開放閱讀框。所有三個克隆的完整DNA序列被組裝到一個重疊群(contig)中。選擇一個5g/II克隆用於進一步的克隆實驗(pMON96400)。Mm卞W的推定的胺基酸序列在SEQIDNO:5中顯示，如果起始密碼子是TTG(稱為長Mm-/;/)。使用Met的可選擇起始密碼子在SEQIDNO:5的胺基酸43發現(產生稱為短Mm-;;^的多肽，SEQIDNO:7)。長Mm卞W的核酸序列是SEQIDNO:6。短Mm-p;^的核酸序列在SEQIDNO:8中示出。本發明的Ppt的胺基酸相關性的比較在表1中示出。表l:磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的胺基酸序列同一性tableseeoriginaldocumentpage33實施例2磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶序列在￡^c/^n'c/H'aco/《'中的表達為了展現實施例1中描述的的功能，將Mon'te〃aman'wfl聚酮化合物合酶(PKS)基因克隆到NovagenpDUET載體(EMD，Biosciences,Darmstadt,Germany)中，一種4個相容的co//表達載體的組。這種PKS由核酸(SEQIDNO:20)、or/6(SEQIDNO:22)、or/7(SEQIDNO:24)和o^/8(SEQIDNO:26)編碼的4個多肽組成，在6，140,486中分別被稱為or/6、or/7、or/S和or/9。使用pDUET載體的3中構建了表達載體pMON94547(Orf5和Orf6)(附圖3)、pMON94544(Orf7)(附圖4)和pMON94534(Orf8)(附圖5)。第四種pDUET載體被用於pW表達。為了獲得酶活性的PKS,Orf5表達產物需要泛醯巰基乙胺基化，其由Ppt催化。將每種細菌/7W克隆到pACYC-DUET-l中。在實施例1中描述了pMON68081和pMON68080的構建。類似地，兩種不同的4偉定的M.man'wa/Ws,短Mm畫//Z或長Mm-/;尋皮克隆到相同的基礎載體中，Co/we肌a和幼ewfl"e〃a分別產生pMON68084(附圖6)和pMON68085(附圖7)。longMm-j^fPCR引物(SEQIDNO:27)將推定的TTG起始改變為ATG。然後每種；/^在五.co/Z中與M.man'"aPKS基因一起表達，孵育24小時，凍幹的五.co"細胞直接用硫磺酸/甲醇來曱基化，通過氣相色譜法分析脂肪酸曱基酯的EPA和DHA含量。結果在以下的表2中顯示。表2tableseeoriginaldocumentpage34在五.co//中完整的Mon7e//aman'""PKS與任何測試的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶的共表達，引起了DHA的積累，而沒有Ppt共表達的M.man'""PKS的表達沒有引起DHA積累。Cp-ppf與不完整的PKS(缺少Orf8)的共表達也不引起DHA積累。這些結果表明，所有測試的PPT泛醯巰基乙氨基化M.man'""PKS，引起活性的多酶複合物的形成。已經展現了Orf7(美國專利6,140,486中的Orf8)控制PUFA生產PKS的最終產物中的鏈長度。57^Twme〃a/w^e/a"'e"s的PKS產生EPA。在含有;w^e/acZe^PKS簇的五.co/z'中的實驗中，當用Mon'化〃aman>zflor/7補足時，or/7缺失突變體產生了DHA。用於活化PKS的Ppt不改變產物，因而本發明的Ppt被用於在與EPA生產PKS組合時產生EPA,在與DHA生產PKS組合時產生DHA。實施例3磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶序列在植物中的表達為了展現M.wan7mPKS，包括M.;/^在植物中合成DHA的能力，產生了幾個植物表達盒。修飾o;/5-8的基因用於在雙子葉植物中表達。已知的是，非內源蛋白編碼序列可能不在植物中良好表達(美國專利5,880,275,通過引用合併在此)。因而，使用Orfs5-8的天然PKS多肽序列(SEQIDNO:19、21、23和25)，通過(1)使用與高度表達的大豆蛋白類似的密碼子利用率偏愛性，和2)消除早先表徵的和已知影響植物中mRNA穩定性的RNA不穩定化元件(美國專利5,880,275)和通過在ATG起始密碼子之前引入Kozak序列(Joshi"a/.,1997),設計和構建了人工蛋白質編碼多核苷酸序列。產生的修飾的多核苷酸序列編碼在序列上與天然多肽相同的多肽。二元載體pMON97063(附圖8)含有的表達盒(密碼子修飾的，SEQIDNO:28)(在具有L-Ph.DnaK前導區的FMV.35S-enh啟動子的控制下)和短Mm-(SEQIDNO:8)(在CaMV35S-enh啟動子和L-CaMV35S前導區的控制下)。這個載體攜帶Bar基因作為可選擇標記。二元載體pMON94563(附圖9)通過克隆or/6的表達盒(密碼子修飾的，SEQIDNO:29)(在具有L-CaMV35S前導區的CaMV35S-enh啟動子的控制下)、or/7(密碼子修飾的，SEQIDNO:30)(在具有L-Ph.DnaK前導區的FMV35S-enh啟動子的控制下)和or/S(密碼子修飾的，SEQIDNO:31)(在具有L-CaMV35S前導區的CaMV35S-enh啟動子的控制下)的表達盒來產生。pMON94563帶有提供草甘膦抗性的CP4標記物。二元載體pMON97066(附圖10)含有與pMON94563相同的表達盒，但是or/7盒在or/6盒之前而不是之後。所有構建體通過DNA測序來序列一驗證。二元載體配對pMON97063和pMON94563、或pMON97063和pMON97066<吏用土i裡桿菌介導的轉化共轉染到爿ra&t/o/wz^Aa/zVma中。再生植物，分析轉化的Rl爿ra:^植物的葉材料和這些^:物的R2種子的脂肪酸含量和組成。為了產生攜帶所有4種PKS基因和的單個多基因二元載體，用HindIII和Notl消化低拷貝數的二元載體pMON83934，與由寡聚體MCS-3(SEQIDNO:32)和MCS畫4(SEQIDNO:33)構成的多聚接頭連接。產生的載體稱為pMON68091。or/6、or/7、or/5和CP4可選擇標記的表達盒通過Hindm/^sAVI消化從pMON94563上切除，並連接到HindIIIASw'WI消化的pMON68091中。產生的二元載體用Aycl和5w'WI消化，並與含有通過^s/WI/^scI消化切除的、來自pMON97063的w/5和的表達盒連接。產生的二元載體pMON96401(附圖11)經由土壤桿菌介導的轉化來轉化到爿ra^Wo戸^Afl/Zfl加和大豆中。植物進行再生，分析來自這些植物的葉和種子材料的脂肪酸含量和組成。含有pMON96401的48個Rl事件在Jra&Wo/w/s中產生。通過氣相色譜法分析來自這項研究的成熟的R2種子。所分析的48個事件中的9個產生了DHA(表3)。表3含有pl事件tableseeoriginaldocumentpage36用pMON96401轉化的R2^ra&Wo戸^種子的4個含DHA事件的分子特徵在表4中表示。數據表明，通過TaqMan敏AppliedBiosystems，FosterCity，CA)終點分析所測定的，產生DHA的事件對於5個轉基因的存在是陽性的。表4^m^Wo戸^pMON96401基因存在tableseeoriginaldocumentpage36在pMON96401Jra^Wo/w^種子的R3世代中，通過氣相色譜法，表型保持了0.025-0.1%範圍的DHA。通過使用魚油作為標準的氣相色譜法/飛行時間質譜法，確認了氣相色譜峰是DHA。對於Mon'te〃aman7zaPKS的種子特異性表達，使用種子特異性啟動子例如p7Sa、p7Sa,、Arcelin-5、USP88、pNapin、pFAE或pOleosin將天然的或密碼子修飾的基因克隆為單個基因表達盒。隨後，使用低拷貝數的二元載體例如pMON83934作為基礎載體，組裝這些表達盒來將所有五種基因組合到單個二元載體中。產生的五基因載體(它們的每一種攜帶所有四個PKS基因加上p內表達盒)可以含有相互之間順序或取向可變的表達盒。這些載體轉化到大豆中，分析產生的大豆種子的脂肪酸含量和組成。用於M.man'waPKS和M.man7za/p/的種子特異性表達的多基因載體的實例如下。雙子葉植物密碼子強化的PKS和；內基因的種子特異性表達的表達盒如表5所描述的來組裝。表達盒按照頭接尾的取向組裝，引起pMON78528(附圖12)的形成。這種二元載體使用土壤桿菌介導的轉化來轉化到大豆和^ra^Wo;w、中，分析產生的種子的脂肪酸含量和組成。表5:M.man'加PKS的種子特異性表達盒。啟動子_^_3'UTR_napin(SEQIDNO:35)短Mm-ppKSEQIDNO:34)napin3'(SEQIDNO:36)Arcelin5Oy7(SEQIDNO:30)Arcelin53'7Sa，(SEQIDNO:29)7Sa,3'7Sa/8(SEQIDNO:31)nos3'USP88O》(SEQIDNO:28)Adrl2為了展現M.wan'waPKS與M.manVza—起來在玉米中合成DHA的能力，產生了幾種植物表達盒。修飾0^5-8和戶j^的基因用於在單子葉植物中表達。已知的是，非內源蛋白編碼序列可能不在植物中良好表達(美國專利5,880,275,通過引用合併在此)。因而，使用早先描述的天然Orf和Ppt多肽序列，通過1)使用類似於高度表達的玉米蛋白質的密碼子利用率偏愛，和通過2)消除早先表徵的和已知影響植物中的mRNA穩定性的RNA不穩定化元件(美國專利5,880,275),來設計和構建了人工蛋白質編碼多核苷酸序列。產生的修飾的多核苷酸序列編碼在序列上與天然多肽相同的多肽。用含有修飾的多核苷酸序列的載體通過根癌土壤桿菌介導的轉化來獲得轉化的外植體。從轉化的組織再生植物。然後對溫室生長的植物分析目標基因表達水平以及油的組成，包括DHA或EPA。實施例4聚酮化合物合酶序列的克隆從2個物種中克隆出八個候選的聚酮化合物合酶基因。M.mtm'"flPKS基因的推斷的胺基酸序列(SEQIDNO:19、21、23和25)用於檢索可用的資料庫中的W麵"eZ/ao腦We腦;(ATCC#—700550)和Co/we〃i";wc/^eo;//^we(ATCC#—BAA-681)中的新的聚酮化合物合酶基因。&owaWe"w、積累EPA,而C.;w;;c/^eo^/^eae積累DHA。才艮據這一點，相信的是，這些細菌中的PUFA生產將來自PKS機制。檢索從每種細菌產生了一組4個候選PKS基因。利用PCR克隆技術，將這些基因克隆到TOPO克隆載體中，證實序列，在Duet表達載體中亞克隆(參見表6)。》S.owd(ie腦S與M.man7zao//<5、o//7、和/^一起在五.co"中的表達，如通過氣相色譜法測定的，發現引起多達0.2。/。DHA的形成，i正實了6".o"ezV/e"w、or/5的預測的功能。類似地，通過在中與M.waWwa基因一起表達，或通過在五.co/z'中表達來自Wewawe〃a或Co/we肌a的完整PKS基因或這兩個物種的組合，確認了表6中所列的每個基因的功能。做為選擇，功能在植物中展現。表6:用於67^wfl"e〃"和Co/we肌"PKS基因的五.co/z'表達載體。tableseeoriginaldocumentpage39參考文獻以下列出的參考文獻通過應用合併在此，達到它們補充、說明、提供背景、教導方法、技術和/或在此採用的組合物的程度。美國專利4,518,584、美國專利4，737，462、美國專利4,810,648、美國專利4,957,748、美國專利4,965,188、美國專利5,094,945、美國專利5，100，679、美國專利5,176，995、美國專利5，196,525、美國專利5,219,596、美國專利5,290,924、美國專利5,322,783、美國專利5,359,142、美國專利5,424,398、美國專利5，424，412、美國專利5,500,365、美國專利5，538，880、美國專利5，550，318、美國專利5,563,055、美國專利5,610,042、美國專利5,627,061、美國專利5，633，435、美國專利5,641,876、美國專利5,880,275、美國專利5，936，069、美國專利6,005,076、美國專利6,040,497、美國專利6,140,486、美國專利6,140，486、美國專利6,140,486、美國專利6,140,486、美國專利6,146,669、美國專利6,156,227、美國專利6,265,638、美國專利6,319,698、美國專利6,433,252、美國專利6,451，567、美國申請10/235,618、美國申請10/429,516、美國公開20040039058、美國/>開20040235127AllenandBartlett,Aif/c廠o&》/ogK，148(Pt6):1903-I913,2002.Baersona/.，/V""fAfoZ.及'o/.,22(2):255-267,1993.Barany"/nf./'iVo紐i"30:705-739,1987.Bauer"at/.,Gewe,37:73,1985.BelangerandKriz,Cen".,129:863-872，1991,BevaneZaUwc/e/"c/血/as.,ll(2):369-385,1983.Bodanszky,In:屍nf"ci》/escj/"jPe/7"'ife^v^Aaiy,Springer-Verlag，Heidelberg,1984,Buatos'。/.，P!a/rtCeW,1(外839-853'1989.Callise"/.,Ge"幼力ev.,1:1183-1200,1987,Chandler"a/.,屍/fl"rCW/'1:1175-1183,1989.ChenJVoc.Afe/.Jcarf.5fcz'.Lffi4，83:8560-8564,1986.ChuSc/eK"a及":'ca，18:659-668,1975.DeDeckerer,五w.J!C7/汰油frv，52:749，1998.DeBlocke/fl/.，SWSOJ!,6:2513-2519,1987.Eberte,/"iVoc.Ato/.5tf.84:5745-5749,1987-FreitagandSelker，Cwr.Opiw_C幼et￡>ev.，15(2):191-199,2005.Galliea/.,Ce//,1:301，1999.Hong"a/,'Afo/.及'o/"34(3):549-555,1997.HudspethandGrula，屍toWAfo/.及W.，12:579-589,1989,Ingelbredhta。/.,W加rCe//，1:671-680,1989.Jamesa/.，5femf".^wArf加28:85，2000.Joshi"o/.,屍/ararAfo/.5!'o/.,35(6>:993-10011997.Joshi^wcW"c他及es.,15:6643-6653,1987,KridlWa/,，&ed&(.1:209:219,1991.Kridl"a/,,iiej.,1:209-219,1991.LawtonefaZ.,PtewfAfo/.說。/.9:315-324,1987.Lopes"o/.,Afo/.G飢(e朋"247:603-613,1995.Maniatis,efj.胸n,59:1304,1994.Maundrell，義及oZ.C力e加.，265(19):10857-I0864，1990.McElroyefa/.,Afo/.G^m.2M(1):15(M60,1991.Menifield,7.^m.CVie限85:2149-2154,1963.Metzef敘e"ce,293(5528):290-293,2001.Misawaa/,戶/a"",4:833-840，1993.Misawa"a/,屍/。n",6:481-489,1994.MurashigeandSkoog^P/yw》Z.'P/加，15:473497,1962.Naylorefo/,,iV。ftw，405:1017,2000.PCT申請WO04071467A2PCT申請WO05103253A1PCT申請WO2002/50295PCT申請WO95/06128PCT申請WO96/33155PederenCe//,29:1015-1026,1982.RecombinantDNAPartD，MethodsinEnzymology,Vol.153,WuandGrossman,eds.,AcademicPress,1987.Richinsa/.,ATwcfeic^c!Vfe及a.，20:8451,1987.Ri銘s,""/.'P/a^Ce//,1(6):609-621，1989.Russelle"/.,7>"。7wgem'cias.,6(2):157國168,1997.Sambrookc/.,M/ecw/arcfow'g:aZai。rotf。/y柳a/wo/,2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHaibor，NY,l卿.Saihasiivana/.,M/ecw/arS!'她cA"3:225，1995.Vasil"a/.,P/。w屍Ajw'。iT.,91:1575-1579,1989.Waldcr^Gewe，42:133,1986.Walkere"/.,/Voc.油".Jcorf.iW,84:6624，1訴7.Wanga"Mofec.C"/.說o/,,12(8):3399-3406,1992,WohIIcbendGewe,70:25-37,1988.Yang"a/.，iV。cJVa比JCtxd>SW,t/SA87:9568-95741990.權利要求1.一種分離的多核苷酸，包含選自以下構成的組的序列(a)在5×SSC、50％甲醯胺和42℃的條件下與SEQIDNO6或SEQIDNO8或其互補物雜交的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的多肽；(b)編碼SEQIDNO5或SEQIDNO7的多肽序列的多核苷酸；和(c)編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的、具有與SEQIDNO5或SEQIDNO7的多肽序列至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸。2.權利要求1的分離的多核苷酸，進一步定義為與異源啟動子可操作連接。3.—種DNA構建體，其包含與權利要求1的分離的多核苷酸可操作連接的異源啟動子。4.權利要求3的DNA構建體，其中所述啟動子是在原核細胞中有功能的。5.權利要求3的DNA構建體，其中所述啟動子是在真核細胞中有功能的。6.權利要求5的DNA構建體，其中所述啟動子是在植物細胞中有功能的。7，權利要求6的DNA構建體，其中所述啟動子是種子增強的啟動子。8.—種宿主細胞，用與在所述宿主細胞中有功能的啟動子可操作連接的、編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的多肽的DNA分子(a、)權利要求i的分離的多核苷:序列:'(b)編碼與SEQIDNO:1的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸；和(c)編碼與SEQIDNO:3的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核普酸。9.權利要求8的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包括編碼包含磷酸泛醯巰基乙胺附著位點的聚酮化合物合酶多肽的DNA分子，其中所述編碼聚酮化合物合酶多肽的DNA分子與異源啟動子可#:作連接。10.權利要求9的宿主細胞，其中所述聚酮化合物合酶多肽包含來自Mon化〃a的磷酸泛醯巰基乙胺附著位點。11.權利要求9的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包含編碼與SEQIDNO:19的多肽序列具有至少75%的序列同一性的聚酮化合物合酶多肽的DNA分子。12.權利要求8的宿主細胞，其中所述宿主細胞是植物細胞。13.權利要求8的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真菌或細菌細胞。14.權利要求8的宿主細胞，定義為相對於與所述宿主細胞相同基因型、但缺少所述DNA分子的細胞展現了改變的脂肪酸生物合成。15.—種轉基因植物，包含與在所述植物有功能的啟動子可操作連接的、編碼具有磷酸泛醯琉基乙胺基轉移酶活性的多肽的DNA分子，其中所述DNA分子包含選自以下構成的組的序列(a)權利要求1的分離的多核苷酸序列；(b)編碼與SEQIDNO:1的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸；和(c)編碼與SEQIDNO:3的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核普酸。16.權利要求15的植物，其中所述植物選自由油菜、5mw/cacampes^〃.51、含'油種子、油菜(oilseedrape)、；由菜泮予(rapeseed)、大豆、crambe、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕、亞麻、葵花、玉米、稻米、大麥、粟、黑麥、小麥、燕麥、苜蓿和高粱構成的組。17.權利要求15的植物，進一步定義為包含編碼聚酮化合物合酶的DNA分子。18.權利要求15的轉基因植物的種子，其中所述種子包含所包含的DNA分子。19.一種生產食物或飼料的方法，包括步驟(a)獲得權利要求15的轉基因植物或其部分；和(b)從中生產所述食物或飼料。20.權利要求19的方法，其中所述食物或飼料是油、青貯料、粗粉、糧食、澱粉、粉末或蛋白質。21.—種通過權利要求19的方法生產的、包含可一全測的核酸分子的食物或飼料組合物，所述可檢測的核酸分子包含權利要求1的分離的多核苷酸。22.通過權利要求的方法生產的食物或祠料組合物，其中權利要求15的植物包含編碼聚酮化合物合酶的DNA分子，其中所述食物或飼料組合物包含二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。23.權利要求21的食物或飼料組合物，其中所述植物是在所述植物缺乏所述編碼聚酮化合物合酶的DNA分子和編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性的多肽的DNA分子時不生產二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸的物種。24.—種生產二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸的方法，包括步驟(a)在包含編碼聚酮化合物合酶的DNA分子的植物的種子中表達選自以下構成的組的多核苦酸(i)權利要求1的分離的多核普酸序列，(ii)編碼與SEQIDNO:1的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核香酸，和(iii)編碼與SEQIDNO:3的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸，來產生二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸；和(b)從所述種子獲得二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。25.—種從根據權利要求24製備的植物產生的食物或祠料組合物，包含二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。全文摘要本發明一般地涉及磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶，其是聚酮化合物合酶複合物的活化所需的，以合成長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，例如，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。特別是，本發明涉及細菌磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶、用於它們在宿主細胞中的表達的DNA構建體，以及當所述宿主細胞包含於植物中時涉及種子、油和粗粉。還提供的是生產含有二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸的植物油的方法。文檔編號C12N9/12GK101415822SQ200780012056公開日2009年4月22日申請日期2007年1月30日優先權日2006年1月31日發明者H·瓦倫丁,J·彭,S·斯克林申請人:孟山都技術有限公司