製備(3r,5s)－(e)－7－[2－環丙基－4－(4－氟苯基)－喹啉－3－基]－3,5－二羥基庚...的製作方法

2023-05-16 23:00:31 1

專利名稱：製備(3r,5s)－(e)－7－[2－環丙基－4－(4－氟苯基)－喹啉－3－基]－3,5－二羥基庚 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種製備(3R，5S)-(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯的新方法。這種化合物可用作在JP 1-279866 A中公開的「3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶抑制劑」的一種合成中間體，而這種抑制劑可用於降低血膽固醇。
此外，本發明還涉及一種製備β-二酮羧酸酯衍生物的新方法，上述(3R，5S)-(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯的合成需要這種衍生物。
背景技術：
作為化學製備(3R，5S)-(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯的方法來說，例子有公開於JP 1-279866 A和Journal of Chromatography A，832(1999)p55-65中的下面製備方法。
然而在這些方法中，反應產物為旋光異構體和旋光物的混合物，因此應在其各自的最終步驟通過層析分離和純化獲得所需的旋光化合物。而在工業規模的生產中在最終步驟進行異構體的分離要達到經濟和有效是相當困難的。
此外，JP 8-92271 A公開了使用一種旋光席夫鹼的另一種製備方法。
還有，JP 8-127585 A公開了一種在非常低溫度下使用(R)-3-叔丁基二甲基甲矽烷氧基-6-二甲氧基氧膦基-5-甲基氧代己酸甲酯的製備方法。
另一方面，作為一種使用微生物細胞和/或其細胞製品通過立體選擇性還原具有酮基的化合物製備旋光醇產物的方法來說，在Appl.Microbiol.Biotechnol.(1998)49p.709-717中描述了使用Microbacterium campoquemadoensis strain MB5614進行下面的化學反應。
此外，在Bioorg.Med.Chem.Lett.，8卷p1403-(1998)中描述了使用發麵酵母進行下面的反應。
但是，就在羰基的α位存在烯且分子中還持續存在羰基的化合物如(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧代庚-6-烯酸酯來說，在本領域還沒有為人們所知的使用微生物以立體選擇性方式還原這種化合物的例子。
發明的公開因此，需要開發一種能經濟地以工業規模製備(3R，5S)-(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯的方法。
為了解決上述問題，本發明人進行了一次次廣泛深入地研究，發現當以下面的式(I)到(III)和(II′)及(III′)表示的化合物作為原料時可獲得高光學純度的所需產物，該發現導致了本發明的完成。所以，本發明的要旨是製備下式(IV)表示的化合物的方法 (其中R表示氫原子、烷基或芳基)，該方法包括用能立體選擇性還原酮基的微生物細胞和/或其細胞製品反應還原選自下面的一種化合物由下面式(I)代表的化合物 (其中R與式(IV)中的定義相同)、由下面式(II)代表的化合物 (其中R與式(IV)中的定義相同)、由下面式(III)代表的化合物
(其中R與式(IV)中的定義相同)。
此外，本發明的另一要旨是一種製備化合物(I)的方法，包括使下面式(A)代表的2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-醛 與下面式(B)代表的化合物 (式中R代表氫原子、烷基、芳烷基或芳基)進行縮合反應。
實施本發明的最佳方式下文將詳細描述本發明。
本發明提供了一種製備(3R，5S)-(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯的方法，該方法包括用能立體選擇性還原酮基的微生物細胞和/或其細胞製品反應還原選自下面的一種化合物由下面式(I)代表的化合物
(其中R代表氫原子、烷基或芳基)；由下面式(II)代表的化合物 (其中R與式(I)中的定義相同)；和由下面式(III)代表的化合物 (其中R與式(I)中的定義相同)。
在上式(I)-(III)所代表的用作本發明製備方法原料的化合物中，R代表氫原子、烷基或芳基。
所述烷基可以是例如甲基、乙基、異丙基、環丙基、丁基、異丁基、叔丁基、環己基、苯甲基或苯乙基等烷基或可被芳基取代的直鏈、支鏈或環狀烷基。
所述芳基可以是可被一個烷基取代的苯基或萘基如苯基、2，4，6-三甲苯基或萘基。
上面的R優選為C1-C4烷基、苄基或苯基，更優選為C1-C4烷基，特別優選甲基或乙基。
按照本發明的製備方法，式(II)和(III)代表的化合物可分別是由下面式(II′) (式中R與前述定義相同)和下面的式(III′) (式中R與前述定義相同)表示的旋光物。
由式(I)-(III)和(II′)和(III′)代表的化合物可任選用在JP 1-279866A、JP 8-127585 A、JP 5-178841 A等中公開的方法和本領域人們熟悉的方法的組合來製備。
此外，作為製備式(I)化合物的一種優選方法，本發明人提供了下面的方法，其中所述化合物可通過使式(A)的2-環戊基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-醛 與式(B)的化合物
(其中R代表氫原子、烷基、芳烷基或芳基)縮合反應獲得。通過使用這種方法，可容易和有效地製備上面式(I)的化合物。
化合物(A)和化合物(B)間的縮合反應可通過與所謂的醛醇縮合反應相同的操作來進行。一般來說，優選實施在含化合物(B)的溶液中加入鹼然後在氮氣或惰性氣氛下滴入含化合物(A)的溶液的方法。
用於上述縮合反應的鹼包括鹼金屬或鹼土金屬的氫化物如氫化鈉、氫化鉀和氫化鈣；烷基鋰試劑諸如正丁基鋰和叔丁基鋰；格利雅試劑諸如叔丁基氯化鎂；鹼金屬烷氧化物諸如乙氧鈉；和NaNH2。此外，可包括鹼土金屬氧化物如氧化鎂等的固體鹼。其中，優選鹼金屬或鹼土金屬的氫化物和NaNH2，更優選鹼金屬氫化物，特別優選氫化鈉。
一般相對於化合物(B)來說，鹼的用量為1.5當量或以上，優選2當量或以上。如果過量使用，就可能發生副反應而導致收率的下降。所以，一般的用量為10當量或以下的範圍。在上述範圍內，優選在2到3當量的範圍，特別優選2到2.7當量的範圍。
所述反應通常使用溶劑來進行。所用的溶劑包括芳烴溶劑如甲苯、苯和二甲苯；醚溶劑諸如甲基叔丁基醚、二甲氧基乙烷和四氫呋喃；滷代烴溶劑諸如二氯甲烷；和非質子性溶劑諸如N，N-二甲基甲醯胺。其中優選的溶劑是在20℃具有2.5或以上介電常數、更優選具有5或以上介電常數的溶劑。上述優選溶劑的具體例子包括四氫呋喃、二甲氧基乙烷、N，N-二甲基甲醯胺和N，N-二甲基咪唑啉酮，特別優選四氫呋喃。
溶劑的用量通常約為反應物料體積的0.5到100倍。從工業觀點來看，優選採用20倍體積或以下的範圍。
作為反應操作來說，化合物(A)可在鹼和化合物(B)混合後加入，可將鹼和化合物(B)的混合物加入到化合物(A)中，可將化合物(A)和(B)的混合物可加入到鹼中，或者可將鹼加入到化合物(A)和(B)的混合物中。在任何一種操作中，均可進行所述反應。但是，優選的方法是先混合鹼和化合物(B)，然後將化合物(A)加入到混合物中。
所述反應可在-50℃到100℃下進行，優選在-20℃到40℃下進行，通常進行30分鐘或以上，優選1小時或以上。如果需要，也可升高溫度。
在反應結束後，可向反應體系中加入水、乙酸、氯化銨等使反應停止，可通過常規分離和純化操作諸如用水洗和分液萃取獲得化合物(I)。
在化合物(A)和化合物(B)間的縮合反應中，通過選擇所用的鹼和溶劑，化合物(I)也可在形成作為中間體的下面通式(C)的化合物[下文稱為化合物(C)]或其鹽 (式中R如前述定義，R2為羥基、滷基、甲矽烷氧基、磺醯氧基、酸基、烷氧基羰氧基、烷硫羰氧基、烷氧硫基羰氧基或烷硫硫基羰氧基)後形成。
在上述化合物(C)中，R可使用與前面所述相同的基團。此外，R2是指羥基；滷素原子如氯原子和溴原子；甲矽烷氧基諸如三甲基甲矽烷氧基和叔丁基二甲基甲矽烷氧基；磺酸基諸如甲烷磺酸基和對甲苯磺酸基；酸基諸如乙酸基和丙酸基；烷氧基羰氧基諸如甲氧基羰氧基和乙烯氧基羰氧基；烷硫基羰氧基諸如甲硫基羰氧基；烷氧基硫代羰氧基諸如甲氧基硫代羰氧基；或烷硫基硫代羰氧基諸如甲硫基硫代羰氧基。在這些基團中，優選羥基、磺酸基或酸基，更優選酸基並特別優選乙酸基。
提供作為上述化合物(C)的取代基的優選組合可以是優選的R和R2的組合，其已在上面取代基的說明中述及。
下面描述將上述化合物(C)用作中間體時的一個具體反應步驟。例如在化合物(A)和化合物(B)間的縮合反應中通過使用NaH和正丁基鋰的組合作為鹼，獲得了在化合物(C)中R2為羥基的中間體。然後，通過進行該中間體的脫水反應來獲得化合物(I)。或者，化合物(I)可通過將中間體的羥基轉變成另一官能團如滷素等消去官能團來獲得。這裡，上面NaH的用量約為與化合物(A)等摩爾，正丁基鋰的用量約為1.5-2.5當量。此外，上述的脫水反應和官能基的消去反應可使用常規人們熟悉的方法適當地進行。
在分離通過上述方法製備的化合物(I)的時候，當上述化合物(I)以鹽的形式提供時，分離可更容易地進行。因此，所述化合物可以鹽的形式獲得。化合物(I)的鹽可通過加酸於有機相中以酸加成鹽形式獲得，該有機相在製備反應終止後用水洗滌並分離萃取，同時根據需要濃縮和/或冷卻並接著攪拌而獲得。使用氨和胺替代酸，可獲得銨鹽和胺加成鹽。當化合物(I)以鹽的形式獲得時，優選在將化合物(I)進行還原反應時使用下述的微生物細胞和/或其細胞製品消去鹽而獲得化合物(I)。
本發明的特徵在於在上式(I)-(III)的化合物中，酮基通過使用微生物細胞和/或其細胞製品被立體選擇性還原。
只要能立體選擇性還原酮基，用於本發明的微生物可以是任選微生物。
更具體地說，可使用下列微生物梅奇酵母屬微生物如美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、二尖梅奇酵母(Metschnikowiabicuspidate)、魯考弗梅奇酵母(Metschnikowia reukaufii)和Metschnikowia lunata；隱球菌屬微生物如Cryptococcus curvatus、黃隱球菌(Cryptococcus flavus)、Cryptococcus humicolus和羅倫隱球菌(Cryptococcus laurentii)；假絲酵母屬微生物如白假絲酵母(Candidaalbicans)、Candida azyma、間型假絲酵母(Candida intermedia)、馬鈴薯假絲酵母(Candida solani)、法氏假絲酵母(Candida famata)、季也蒙假絲酵母(Candida guilliermondii)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、皺落假絲酵母(Candida rugosa)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)和Candida molischiana；網孢菌屬(Filobasidium)微生物如Filobasidium capsuligenum；Ogataea屬微生物如Ogataea glucozyma和Ogataea minuta；固囊酵母屬的微生物如固囊酵母(Citeromycesmatritensis)；西洋蓍黴屬(Yarrowia)微生物如Yarrowia lipolytica；紅酵母屬微生物如紅酵母(Rhodotorula glutinis)；橙黃紅酵母(Rhodotorulaaurantiaca)和膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)；外瓶黴屬微生物如皮炎外瓶黴(Exophiala dermatitidis)；三角酵母屬微生物如三角酵母(Trigonopsis variabilis)；Shizosaccharomyces屬微生物如Shizosaccharomyces pombe；擬威克酵母屬微生物如擬威克酵母(Wickerhamiella domercqii)；畢赤酵母屬如Pichia petersonii和Pichiaanomala；復膜孢酵母屬如Saccharomycopsis fibuligera和Saccharomycopsis crataegensis；Saitoella屬微生物如Saitoellacomplicata；酵母屬微生物如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；紅冬孢酵母屬微生物如紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)；不動桿菌屬微生物如乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)；短桿菌屬微生物如擴展短桿菌(Brevibacterium linens)和解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)；纖維單胞菌屬微生物如凝膠纖維單胞菌(Cellulomonas gelida)、產黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)和潮溼纖維單胞菌(Cellulomonas uda)；棒狀桿菌屬微生物如產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、穀氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、嗜乙醯乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、Corynebacterium vitaeruminis和變異棒桿菌(Corynebacteriumvariabile)；和短小桿菌屬微生物如萎蔫短小桿菌(Curtobacteruimflaccumfaciens)。
作為上述微生物的具體例子來說，優選美極梅奇酵母IFO0863菌株、美極梅奇酵母IAM12196菌株、美極梅奇酵母IAM12197菌株、美極梅奇酵母IFO1407菌株、美極梅奇酵母IFO10796菌株、二尖梅奇酵母IFO1408菌株、魯考弗梅奇酵母IFO10798菌株和Metschnikowia lunata IFO1605菌株；Cryptococcus curvatus IFO1159菌株、Cryptococcus humicolus IFO10250菌株、黃隱球菌IFO0407菌株、和羅倫隱球菌IFO0609菌株、羅倫隱球菌IFO1376菌株、羅倫隱球菌羅倫變種(Cryptococcus laurentii var laurentii)CBS5539菌株、羅倫隱球菌羅倫變種CBS2174菌株、羅倫隱球菌羅倫變種CBS5746菌株、羅倫隱球菌羅倫變種CBS7140菌株和羅倫隱球菌羅倫變種CBS7235菌株；白假絲酵母IFO1594菌株、Candida azyma JCM1691菌株、間型假絲酵母IFO0761菌株、馬鈴薯假絲酵母IFO0762菌株、法氏假絲酵母RIFY7455菌株(也可以是IFO0856菌株)、季也蒙假絲酵母IFO0566菌株、近平滑假絲酵母CBS0604菌株、皺落假絲酵母IFO0591菌株、熱帶假絲酵母IFO0618菌株、熱帶假絲酵母IFO1404菌株、熱帶假絲酵母IFO1647菌株和Candida molischiana IFO10296菌株；Filobasidium capsuligenum IFO1119菌株和Filobasidiumcapsuligenum IFO1185菌株；Ogataea glucozyma IFO1472菌株和Ogataea munuta var nonfermentans IFO1473菌株；固囊酵母IFO0651菌株和固囊酵母IFO0954菌株；Yarrowia lipolytica IFO1209菌株；紅酵母dairenensis變種(Rhodotorula glutinis var dairenensis)IFO0415菌株、紅酵母glutinis變種(Rhodotorula glutinis var glutinis)IFO0395菌株；橙黃紅酵母IFO0754菌株、Rhodoforula mucilaginosa IFO0003菌株；膠紅酵母IFO0003菌株；皮炎外瓶黴IFO6421菌株和皮炎外瓶黴IFO8193菌株；三角酵母CBS1040菌株和三角酵母IFO0671菌株；Shizosaccharomyces pombe IFO0344菌株和Shizosaccharomycespombe IFO1628菌株；擬威克酵母IFO1857菌株；Pichia petersoniiIFO1372菌株和Pichia anomala IFO0118菌株；Saccharomycopsisfibuligera IFO0105菌株和Saccharomycopsis crataegensis IFO1708菌株；Saitoella complicata IAM12963菌株；釀酒酵母JCM1818菌株、釀酒酵母IFO0565菌株和釀酒酵母IFO0305菌株；紅冬孢酵母IFO0559菌株；乙酸鈣不動桿菌IFO12552菌株；擴展短桿菌JCM1328菌株和解糖短桿菌ATCC14066菌株；凝膠纖維單胞菌JCM1489菌株、產黃纖維單胞菌JCM1490菌株和潮溼纖維單胞菌JCM1492菌株；產氨棒桿菌JCM1305菌株、穀氨酸棒桿菌JCM1307菌株、穀氨酸棒桿菌ATCC12813菌株、穀氨酸棒桿菌ATCC13032菌株、穀氨酸棒桿菌ATCC13826菌株、穀氨酸棒桿菌ATCC14067菌株、嗜乙醯乙酸棒桿菌ATCC13870菌株、Corynebacteruim vitaeruminis JCM1323菌株和變異棒桿菌JCM2154菌株；和萎蔫短小桿菌ATCC12813菌株。
上述微生物優選屬於梅奇酵母屬、隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬、固囊酵母屬、紅酵母屬、外瓶黴屬、Shizosaccharomyces屬、擬威克酵母屬、畢赤酵母屬、復膜孢酵母屬、Saitoella屬、酵母屬、紅冬孢酵母屬、短桿菌屬或產氨桿菌屬。
此外，對於梅奇酵母屬微生物來說，優選美極梅奇酵母和魯考弗梅奇酵母。
對於隱球菌屬微生物來說，優選黃隱球菌、Cryptococcus humicolus和羅倫隱球菌。
對於假絲酵母屬微生物來說，優選間型假絲酵母、馬鈴薯假絲酵母、法氏假絲酵母和Candida molischiana。
對於網孢菌屬微生物來說，優選Filobasidium capsuligenum。
對於屬於Ogataea屬的微生物來說，優選Ogataea glucozyma和Ogataea minuta。
對於固囊酵母屬的微生物來說，優選固囊酵母。
對於紅酵母屬微生物來說，優選紅酵母、橙黃紅酵母和膠紅酵母。
對於外瓶黴屬微生物來說，優選皮炎外瓶黴。
對於Shizosaccharomyces屬微生物來說，優選Shizosaccharomycespombe。
對於擬威克酵母屬微生物來說，優選擬威克酵母。
對於畢赤酵母屬微生物來說，優選Pichia petersonii和Pichiaanomala。
對於復膜孢酵母屬微生物來說，優選Saccharomycopsisfibuligera。
對於Saitoella屬微生物來說，優選Saitoella complicata。
對於酵母屬微生物來說，優選釀酒酵母。
對於紅冬孢酵母屬微生物來說，優選紅冬孢酵母。
對於短桿菌屬微生物來說，優選解糖短桿菌。
對於棒狀桿菌屬微生物來說，優選產氨棒桿菌、穀氨酸棒桿菌、嗜乙醯乙酸棒桿菌和Corynebacteruim vitaeruminis。
此外，當使用式(I)化合物作為原料生產式(IV)化合物時，可通過式(II』)化合物或式(III』)化合物製備中間體。
在這種情況下，式(II』)化合物和式(III』)化合物預先由式(I)化合物製備。然後它們被分離和導入到式(IV)化合物中。或者，可在沒有分離式(II』)化合物和式(III』)化合物條件下直接製備式(IV)化合物。
還有，在使用式(I)化合物作為原料的情況下，式(IV)化合物可使用一種微生物生產，或者可一起使用兩種或多種微生物生產。
當使用式(I)化合物時，特別優選的作為原料的微生物是屬於隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬、西洋蓍黴屬、紅酵母屬、外瓶黴屬、三角酵母屬的微生物，更優選屬於隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬和紅酵母屬的微生物，最優選屬於Ogataea屬的微生物。
當使用式(II)化合物時，特別優選的作為原料的微生物是屬於梅奇酵母屬、隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬、固囊酵母屬、西洋蓍黴屬、紅酵母屬、外瓶黴屬、三角酵母屬、Shizosaccharomyces屬、擬威克酵母屬、復膜孢酵母屬、Saitoella屬、畢赤酵母屬、酵母屬、紅冬孢酵母屬、不動桿菌屬、短桿菌屬、纖維單胞菌屬、棒狀桿菌屬和短小桿菌屬。
更優選上述微生物屬於梅奇酵母屬、隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬、固囊酵母屬、紅酵母屬、Shizosaccharomyces屬、擬威克酵母屬、復膜孢酵母屬、Saitoella屬、畢赤酵母屬、酵母屬、紅冬孢酵母屬、短桿菌屬和棒狀桿菌屬；再更優選屬於梅奇酵母屬、假絲酵母屬、Ogataea屬、紅酵母屬、Shizosaccharomyces屬、擬威克酵母屬、復膜孢酵母屬、Saitoella屬、紅冬孢酵母屬、短桿菌屬和棒狀桿菌屬；最優選上述微生物屬於梅奇酵母屬、假絲酵母屬、Ogataea屬、Shizosaccharomyces屬、Saitoella屬、紅冬孢酵母屬、短桿菌屬和棒狀桿菌屬。
當使用式(III)化合物時，特別優選的作為原料的微生物是屬於隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、紅酵母屬和畢赤酵母屬的微生物；更優選屬於隱球菌屬、假絲酵母屬和紅酵母屬的微生物。
注意在上述的微生物中，IFO編號的微生物描述於Institute forFermentation，Osaka(IFO)發布的網際網路目錄表(http//www.ifo.or.jp)中，它們可從IFO獲得。
CBS編號的微生物描述於The Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)的網際網路目錄表(http//www.cbs.knaw.nl)中，它們可從CBS獲得。
ATCC編號的微生物描述於The American Type Culture Collection(ATCC)中的網際網路目錄(http//www.atcc.org)中，它們可從ATCC獲得。
IAM編號的微生物描述於IAMCulture Collection(IAM)的網際網路目錄(http//www.iam.u-tokyo.ac.jp/misyst/ColleBox/IAMcollection.html)中，它們可從IAM獲得。
JCM編號的微生物描述於the Japan Collection ofMicroorganism(JCM)的網際網路目錄(http//www.jcm.riken.go.jp)中，它們可從JCM獲得。
各RIFY編號微生物描述於the Research Institute of Fermentation，Yamanashi Univ.Kofu Japan(RIFY)的目錄中並且可從RIFY獲得。
作為上述的微生物來說，可使用野生株和通過常規的誘變處理如紫外線輻照或NTG處理獲得的突變株。或者，也可以使用任何株諸如通過基因技術如細胞融合或基因重組誘導的重組株。
此外，作為重組株的表達株，可使用細菌諸如非原始株的大腸桿菌或酵母，其重組株也包括在上述微生物的概念中。
在本發明的製備過程中，可將一種或兩種或多種上述微生物作為微生物細胞和/或其細胞製品供應到反應物中。
具體而言，可不經任何處理使用通過培養上述微生物獲得的微生物細胞。或者可使用人們熟悉的技術諸如丙酮處理、冷凍乾燥處理、微生物細胞或其處理產物的機械或酶碎裂等處理經培養獲得的微生物細胞而得到的細胞製品。此外，也可從這些微生物細胞或其細胞製品提取粗產物形式或純化產物形式的具有還原能力的酶成分。還有，也可能使用用常規固定技術固定在載體如聚丙烯醯胺或角叉菜膠上的如上述獲得的微生物細胞、微生物細胞加工產物、酶成分等。因此，在本專利說明書中，術語「微生物細胞和/或其細胞製品」作為包括所有上述的微生物細胞、微生物細胞處理產物、酶成分和其固定產物的概念使用。
接著，將具體描述本發明的製備方法。
在本發明的製備方法中，微生物通常在培養後使用。這種培養可通過常規技術進行。用於培養本發明微生物的培養基包括可被微生物同化的碳源、氮源、無機離子等。就碳源而言，適合使用碳水化合物諸如葡萄糖、果糖和蔗糖，多元醇諸如二甘醇、甘露糖醇和木糖醇，有機酸等。就氮源而言，適合使用有機氮源如NZ胺、triptose、酵母提取物、聚腖、肉提取物和大豆提取物，或使用無機氮源諸如硫酸銨和硝酸銨。就無機離子而言，如果需要，則適合使用磷酸根離子、鎂離子、鐵離子、錳離子、鉬離子等。此外，按需要加入肌醇、泛酸、煙醯胺和其它維生素。
只要碳源、氮源、無機離子和維生素在培養基中的含量在各自常用於菌株培養的範圍內，則對其無特別限制。碳源和氮源通常分別以0.001-50％(重量)、優選0.1-5％(重量)的量加入。無機離子通常以0.0001-5％(重量)、優選0.001-1％(重量)的量加入。維生素通常以0.00001-10％(重量)、更優選0.001-1％(重量)的量加入。
所述培養在需氧條件下進行1到100小時，同時將pH調節到約3到11的合適範圍內，將溫度調節到4℃到50℃的合適範圍內。
作為反應方法來說，可適當地使用下面方法培養本發明的微生物，將式(I)-(III)的各種化合物或其混合物加入到含有所得到的微生物細胞和/或其細胞製品的含水培養基中而獲得式(IV)的目標化合物的方法；將式(I)-(III)的各種化合物或其混合物加入到正在培養微生物的培養基中進行反應的方法；停止培養後將式(I)-(III)的各種化合物或其混合物加入到未處理的培養基中並使反應持續進行的方法；將式(I)化合物進行上述任何一種方法處理，反應進行到一定程度後，根據式(I)-(III)化合物的含量，將另外培養的微生物加入到體系中的方法等。
對於上述的含水培養基來說，提供了使用磷酸鈉、磷酸鉀等的緩衝液，並且在這種緩衝液中，適當地加入了有機溶劑、表面活性劑等。
所述有機溶劑包括水溶性溶劑諸如二甲基亞碸(DMSO)和四氫呋喃(THF)和水不溶性有機溶劑諸如乙酸丁酯和己烷。所述表面活性劑包括吐溫80、糖酯等。
緩衝劑的使用濃度可以為1M或更低濃度，優選0.2M或更低濃度。
所述反應可在4-70℃、優選15-50℃的溫度和2-9並優選4-8的pH下進行。
式(I)-(III)所示化合物或其混合物的濃度相對於反應溶液來說在0.0001-10％(重量)、優選在0.001-5％(重量)的範圍。如果需要，式(I)-(III)的化合物或其混合物可在反應期間補充加入。
此外，為了加速反應，可適當地加入輔酶、輔酶和其再生系統兩者或碳源。
所述輔酶一般包括還原形式的β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(下文縮寫為NADH)或還原形式的β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文縮寫為NADPH)。其加入量可以為反應物料的1000000分之一當量到10當量，優選10000分之一當量到10當量。
輔酶的再生系統可以是甲酸脫氫酶等能將β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(下文縮寫為NAD)還原成NADH的酶和酶底物(甲酸)的組合，葡萄糖脫氫酶等能將β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文縮寫成NADP)還原成NADPH的酶和酶底物(葡萄糖等)的組合。再生輔酶的這些酶可以是市場購置的產品，或者可以是具有輔酶再生能力的微生物細胞和/或其細胞製品。這些系統的加入量適合於根據反應物的量確定。
用於加速上述反應的碳源可以是任何可用於反應中所用的微生物細胞和/或其細胞製品進行輔酶再生的碳源。例如，所述碳源包括碳水化合物諸如葡萄糖、果糖和蔗糖，以及多元醇如二甘醇、甘露糖醇和木糖醇及有機酸等，其加入量為0.0001-50％(重量)，優選0.01-10％(重量)。
正如上面所述，所述反應使用水介質來進行。然而，式(I)-(III)的化合物具有低的水溶性，因此優選在將化合物加入前事先將化合物通過溶解或懸浮於有機溶劑、表面活性劑等中而均勻分散於反應系統中。
對於通過上述製備方法獲得的式(IV)化合物來說，其雜質通常通過常規的純化方法即在用有機溶劑從反應溶液萃取後用層析和結晶技術去除而獲得純化的式(IV)化合物。具體而言，將式(IV)化合物用有機溶劑溶解後，通過用於離心、壓濾、超濾等的常規分離器去除包括微生物在內的固體成分而獲得含式(IV)化合物的液體。雜質則使用常規的方法如層析法或結晶技術從得到的液體中去除。這樣可獲得純的式(IV)化合物。
下文中將參照實施例更詳細地說明本發明的情況。但是，在沒有背離本發明的要旨情況下可在本發明的技術領域內進行常規的修改。
同時，除了目標的(3R，5S)異構體外，所述(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯(下文簡寫為「DOLE」)具有異構體(3S，5R)-異構體、(3R，5R)-異構體和(3S，5S)-異構體。其結構式如下。
3S，5R-DOLE和3R，5S-DOLE是DOLE的順式異構體，3S，5S-DOLE和3R，5R-DOLE是DOLE的反式異構體。
在實施例中，目標產物(3R，5S)-異構體的純度由非對映體過剩率和對映體過剩率來表示。在本專利說明書中，非對映體過剩率由(順-DOLE-反-DOLE)/(順-DOLE+反-DOLE)表示，對映體過剩率由(3R，5S異構體-3S，5R異構體)/(3R，5S異構體+3S，5R異構體)表示。
順-DOLE 反-DOLE
製備實施例1(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(下文簡稱為DOXE)的合成在一個配有攪拌器、滴液漏鬥和溫度計的500ml四頸燒瓶中加入5.02g(11.22mmol)(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羥基-3-氧庚-6-烯酸乙酯(下文簡稱為5-MOLE)和420mL丙酮並攪拌。然後在0℃用20分鐘滴加10.5mL製備的Jones氧化劑(即混合3mL濃硫酸和3.35g氧化鉻並用水稀釋到25mL獲得的試劑)，然後在冰冷卻下攪拌2小時，接著小心加入10mL甲醇終止反應。隨後減壓蒸餾反應混合溶液以除去丙酮，接著加入250mL乙酸乙酯。得到的溶液用60mL飽和碳酸氫鈉水溶液萃取和分離兩次，然後用60mL飽和鹽水溶液萃取和分離兩次，接著用無水硫酸鎂脫除乙酸乙酯溶液的水分。隨後蒸餾掉溶劑，用矽膠柱層析(洗脫溶劑2∶1己烷∶乙酸乙酯)純化而得到3.03g標題化合物(收率60.6％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm)7.79-7.19(8H，m)，7.71(1H，d)，6.03(1H，d)，5.51(1H，s)，4.21(2H，q)，3.40(2H，s)，2.35-2.40(1H，m)，1.39-1.41(2H，m)，1.28(3H，t)，1.07-1.09(2H，m).
製備實施例25S-(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羥基-3-氧庚-6-烯酸乙酯(下文簡稱為5S-MOLE)的合成向減壓下加熱乾燥後導入氮氣的Schlenk試管中加入0.87g(3.3mmol)(S)-2-[N-(3，5-二叔丁基亞水楊基)氨基]-3-甲基-1-丁醇、5mL二氯甲烷和0.63mL(6.0mmol)四乙氧鈦並在室溫下攪拌混合1小時。將Schlenk試管冷卻到-50℃後，將0.95g(3.0mmol)(E)-3-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-丙-2-烯-1-醛溶解於2mL二氯甲烷後滴加。攪拌5分鐘後，再加入0.51g(6mmol)雙烯酮，在將溫度保持在-50℃的同時攪拌22小時進行反應。將得到的反應混合溶液加入到25mL二氯甲烷和25mL 0.24M碳酸氫鈉水溶液的混合物中，在室溫下劇烈攪拌2小時獲得兩層溶液。將兩層溶液分離。水層用10mL二氯甲烷萃取兩次。合併二氯甲烷層和萃取液得到二氯甲烷溶液。將合併的二氯甲烷溶液用無水硫酸鎂乾燥並將溶劑蒸除，用矽膠柱層析(洗脫溶劑為3∶2己烷∶乙酸乙酯)純化得到0.75g 5S-(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羥基-3-氧庚-6-烯酸乙酯(光學純度73％ee，對(E)-3-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-丙-2-烯-1-醛的收率56％)。
製備實施例37-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羥基-3，5-二氧庚酸乙酯的合成 在2.40g油狀60％氫化鈉和200mL四氫呋喃的混合溶液中，在將內部溫度保持在2℃或以下的情況下用20分鐘滴加10.3g 3，5-二氧己酸乙酯和40mL四氫呋喃的混合溶液。在-10℃下反應50分鐘後，在內部溫度保持在-20℃到-15℃間的情況下，用40分鐘滴加75mL1.6M正丁基鋰的己烷溶液，讓反應在2℃或以下內部溫度下進行40分鐘。這時，再將內部溫度保持在-15℃或以下，用40分鐘滴加11.7g2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-醛和80mL四氫呋喃的混合物，然後在10℃或以下的溫度下反應1小時。再將內部溫度保持在5℃或以下，將14.4mL乙酸和40mL甲苯加入到反應體系中，接著用100mL水和100mL飽和鹽水順序洗滌。蒸發掉溶劑後，向殘渣加入100mL己烷和5mL乙酸乙酯進行結晶，經過濾和乾燥獲得16.6g(收率89％)7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羥基-3，5-二氧庚酸乙酯。
該化合物的NMR如下1H-NMR(CDCl3)1.11(2H，m)，1.13(1H，m)，1.27(3H，t，J＝10)，1.76(1H，m)，2.40(1H，m)，2.48(2H，ABq，J＝66,14)，2.69(2H，ABq，J＝52,16)，2.78(1H，m)，3.30(1H，m)，4.18(2H，m)，5.25(1H，d，J＝3)，5.58(1H，dd，J＝12,4)，7.16-7.26(5H，m)，7.33(1H，dd，J＝7,7)，7.61(1H，dd，J＝7,7)，7.93(1H，d，J＝7)製備實施例4DOXE的合成 將20.0g製備實施例3獲得的7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羥基-3，5-二氧庚酸乙酯溶解於120mL甲苯中。此外加入10g矽膠和8g無水硫酸鎂在95℃反應16小時。從反應體系除去矽膠和無機鹽後，將溶劑蒸除，得到的殘渣通過柱層析(展開劑2∶1己烷∶乙酸乙酯)得到8.4g(收率44％)(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。
該化合物的NMR如下1H-NMR(CDCl3)1.09(2H，m)，1.28(3H，t，J＝7)，1.40(2H，m)，2.38(1H，m)，3.40(2H，s)，4.20(2H，q，J＝7)，5.51(1H，s)，6.02(1H，d，J＝16)，7.16-7.26(4H，m)，7.30-7.40(2H，m)，7.70(1H，d，J＝16)，7.63(1H，m)，7.97(1H，m)
製備實施例5DOXE的合成將5.0g製備實施例3獲得的7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羥基-3，5-二氧庚酸乙酯、10mL甲苯和0.37g對甲苯磺酸酐的混合溶液在110℃反應3小時。用碳酸氫鈉水溶液洗滌反應體系，接著將得到的有機層濃縮。然後，將得到的殘渣通過柱層析(展開劑己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)純化而得到3.0g(收率63％)(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。
製備實施例6DOXE的合成將0.50g製備實施例3獲得的7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羥基-3，5-二氧庚酸乙酯、20mL甲苯和0.037g對甲苯磺酸酐的混合溶液在105℃的內部溫度下減壓反應1小時，同時通過與甲苯共沸移除反應產生的水。恢復到常壓後，將0.097g水加入到反應體系中，讓反應在90℃進行10分鐘，接著讓反應在減壓、105℃的內部溫度下進行1小時並同時蒸除水。使用高效液相色譜分析反應體系。證實產生了0.37g(收率78％)的(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。
製備實施例7DOXE的合成將0.01g硫酸加入到0.2g製備實施例3獲得的7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉3-基]-7-羥基-3，5-二氧庚酸乙酯和2mL乙酸乙烯酯的混合溶液中，讓反應在加熱回流下進行5小時。用乙酸乙酯稀釋反應體系，然後用碳酸氫鈉水溶液洗滌。將得到的有機層濃縮，殘渣通過柱層析(展開劑己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)純化而得到0.14g(收率73％)(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。
製備實施例8DOXE的合成讓2.0g製備實施例3獲得的7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羥基-3，5-二氧庚酸乙酯、10mL乙酸、0.66g乙酸酐和0.01g N，N-二甲基-4-氨基吡啶的混合溶液在90℃反應4小時。用乙酸乙酯稀釋該反應體系，然後依次用水和碳酸氫鈉水溶液洗滌。然後，濃縮得到的有機層，殘渣用己烷結晶而獲得1.55g(收率80％)(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。
製備實施例9DOXE的合成將0.250g製備實施例3獲得的7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羥基-3，5-二氧庚酸乙酯溶解於5mL 4mol/L鹽酸/乙酸乙酯溶液中，在20℃持續攪拌12小時。使用高效液相色譜分析反應體系。證實產生了0.198g(收率82％)(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。
製備實施例10DOXE鹽酸鹽的合成在1.37g油狀60％氫化鈉和10mL四氫呋喃的混合溶液中，在保持20℃的內部溫度下用5分鐘滴加2.36g 3，5-二氧己酸乙酯和10mL四氫呋喃的混合溶液。在該溫度攪拌混合物1小時後，用20分鐘滴加2.01g 2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-醛和20mL四氫呋喃的混合物。攪拌混合物4小時後，向反應溶液加入3.09g乙酸和20mL水終止反應。有機相用40mL乙酸乙酯萃取，然後用20mL飽和鹽水溶液洗滌，接著用2g無水硫酸鈉乾燥。有機相分析結果表明獲得了2.52g目標產物(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)(收率82％)。
蒸餾掉溶劑後，在室溫下將1.7mL 4mol/L鹽酸/乙酸乙酯溶液加入到殘渣中。形成結晶後，將溫度降低到5℃。然後通過過濾和乾燥獲得結晶，得到2.49g(E)-7-[2-環丙基4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯鹽酸鹽(收率75％)。
實施例1由DOXE製備DOLE將表1所列的各種菌株在液體培養基(2.5mL)中接種，所述液體培養基包含5g/L的酵母提取物(由Difco Co.，Ltd.生產)、5g/L聚腖(由Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.生產)、3g/L麥芽汁(由Difco Co.，Ltd.生產)和20g/L葡萄糖(由Nihon Shokuhinkako Co.，Ltd.生產)，然後在需氧條件下在30℃培養21小時。將得到的培養基以一次1 mL的量離心而收集微生物細胞。然後將0.25mL含化合物(I)(其中R為乙基的式I化合物DOXE)的反應溶液加入到該微生物細胞中，在30℃和需氧條件下反應20小時。
上述反應溶液的組成包括0.3g/L DOXE、20g/L葡萄糖(由NihonShokuhinkako Co.，Ltd.生產)、20mL/L二甲基亞碸(DMSO)(由KishidaChemical Co.，Ltd.生產)和100mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0)。
終止反應後，將0.5mL乙酸乙酯加入到反應溶液中並與其劇烈混合，接著通過離心分離成有機層和水層。將有機層轉移到另一容器中。用濃縮離心機蒸除溶劑。然後將乾燥的固體產物溶解於0.01mL乙酸乙酯中，然後進行薄層層析(TLC)。所述TLC使用矽膠板(由MerckCo.生產的矽膠60 F254)，所用的展開劑為1/1的己烷/乙酸乙酯。
展開停止後，用紫外燈驗證產物。對於化合物(I)來說，Rf＝0.76到0.86。對於化合物(II)和(III)來說，Rf＝0.54到0.61。對於化合物(IV)(其中R為乙基的式IV化合物DOLE)來說，Rf＝0.33。刮下TLC上DOLE斑點並用0.25mL異丙醇洗脫。離心後，取上清液進行高效液相色譜(HPLC)分析其光學純度和TLC-刮除樣品的濃度。
下面是HPCL的條件。
柱CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生產)洗脫液9/1己烷/乙醇流速0.5mL/min檢測UV 254nm溫度室溫其結果列於表1。

表1

實施例2用DOXE製備DOLE將Ogataea minuta var nonfermentans IFO 1473在2.5mL與實施例1培養基組成相同的液體培養基中接種，然後在需氧條件下、27℃分別培養24小時和48小時。以一次1mL的量將獲得的培養溶液離心來收集微生物細胞。然後將0.2mL 100mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0)加入到微生物細胞中將其完全懸浮，接著向懸浮液加入20μl 50％(w/v)葡萄糖溶液和50μl 5g/L DOXE(DMSO溶液)，然後充分攪拌混合物，在27℃反應20小時。
停止反應後，如實施例1那樣用乙酸乙酯萃取和進行TLC，刮下TLC上的DOLE斑點並用200μl異丙醇洗脫。離心後，將上清液進行高效液相色譜(HPLC)分析其光學純度和產生的DOLE的量。
下面是HPCL的條件。
柱CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生產)洗脫液95/5己烷/乙醇流速1mL/min檢測UV 254nm溫度室溫其結果列於表2。

表2

此外，在進行上述的TLC時，具有相應於5-MOLE或3-MOLE的Rf斑點。這裡，只刮除了24小時培養的斑點並使用高效液相色譜(HPLC)分析了其產生量。
下面是其HPLC條件。
柱MCIGEL CHP2MGM(4.6×150mm)(由Mitsubishi ChemicalCorporation生產)洗脫液甲醇/乙腈/水/磷酸＝800/100/100/0.5流速0.6mL/min檢測UV 254nm溫度60℃。
在上述HPLC條件下，當5-MOLE具有4.73的保留時間，3-MOLE具有5.47的保留時間時，5-MOLE的TLC刮取樣品濃度為25.2mg/L，3-MOLE濃度為2.2mg/L。
順便提及，在上述分析條件下DOLE具有4.02的保留時間，DOXE具有8.02的保留時間。
實施例3用DOXE製備MOLE將橙黃紅酵母IFO0754和紅酵母dairenensis變種IFO0415分別在2.5mL組成與實施例1培養基相同的液體培養基中接種。在27℃需氧條件下，分別將橙黃紅酵母培養24小時，將紅酵母dairenensis變種培養48小時。以一次1mL的量將獲得的培養溶液離心來收集微生物細胞。然後，將0.2mL 100mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0)加入到微生物細胞中將其完全懸浮，接著向懸浮液加入20μl 50％(w/v)葡萄糖溶液、20μl 2g/L NADP和NAD的混合溶液和30μl 10g/L DOXE(DMSO溶液)，然後充分攪拌混合物，使反應在需氧條件下、27℃進行12小時。
停止反應後，與實施例1中一樣用乙酸乙酯萃取和進行TLC。分別刮除相應於5-MOLE或3-MOLE的Rf斑點部分和相應於DOLE的Rf斑點部分。
然後，在下麵條件下使用高效液相色譜(HPLC)分析DOLE和MOLE。
下面是分析DOLE的條件柱CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生產)洗脫液95/5己烷/乙醇流速1mL/min檢測UV 254nm溫度室溫；另外，下面是分析MOLE的條件柱MCIGEL CHP2MGM(4.6×150mm)(由Mitsubishi ChemicalCorporation生產)洗脫溶液甲醇/乙腈/水/磷酸＝800/100/100/0.5流速0.6mL/min檢測UV 254nm溫度60℃其結果列於表3。
表3所用微生物TLC刮取樣品的濃度(各為mg/L)5-MOLE 3-MOLEDOLE紅酵母 44.92.2 2.9dairenensis變 (100％de，100％ee)種IFO0415橙黃紅酵母 118.9 N.D. 15.3IFO0754 (98.7％de，100％ee)
實施例4用DOXE製備3-MOLE將間型假絲酵母IFO0761在2.5mL組成與實施例1培養基相同的液體培養基中接種。在27℃培養24小時後，通過與實施例2相同的操作讓其與DOXE反應。同樣，反應後，用乙酸乙酯萃取和進行TLC。斑點樣品的HPLC分析揭示3-MOLE的TLC刮取樣品濃度為156.9mg/L。
實施例5用DOXE製備3-MOLE將Filobasidium capsuligenum IFO1185菌株在2L組成與實施例1培養基相同的液體培養基中接種，在30℃、需氧條件下培養21小時。離心獲得培養溶液並收集微生物細胞。使用10mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0)製備10％(w/v)微生物細胞懸浮液。採集各12mL等份的懸浮液分別到六個具有30φ的試管中。然後向各個試管加入0.1mL10％(w/v)DOXE(DMSO溶液)和0.15mL 50％(w/v)葡萄糖溶液，在30℃需氧條件下進行反應20小時。
停止反應後，使用乙酸乙酯萃取反應混合物。在與實施例1相同的條件下將萃取物進行TLC。刮取含化合物(III)的部分。用乙酸乙酯提萃刮取的矽膠部分，樣品用1H-NMR分析。
1H-NMR(400MHz，CDCl3，δppm)1.02(dt，J＝6.4，3.2Hz，2H)，1.21(t，J＝7.2Hz，3H)，1.33(dt，J＝6.4，3.2Hz，2H)，2.26(m，1H)，2.43(d，J＝6.4Hz，2H)，2.60-2.66(dd，J＝6.4，6.4Hz，2H)，3.37(m，1H)，4.11(q，J＝6.8Hz，2H)，4.34-4.41(m，1H)，6.27(d，J＝16.8Hz，1H)，7.06-7.36(m，6H)，7.52-7.62(m，1H)，7.60(d，J＝16.8Hz，1H)，7.90(d，J＝8.4Hz，1H)上述結果證實了3-MOLE的產生。
還有，在下麵條件下使用高效液相色譜(HPLC)分析光學純度。結果，發現化合物(III′)的光學純度為87.3％ee。
下面是本實施例中所用的HPLC條件。
柱CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生產)洗脫液己烷/乙醇/三氟乙酸＝900/100/1流速1mL/min檢測UV 254nm溫度室溫實施例6用DOXE製備DOLE和3R-MOLE分別將各個裝有50mL與實施例1培養基組成相同的培養基的500mL燒瓶在120℃滅菌20分鐘。取8個燒瓶接種Ogataea minuta varnonfermentans IFO1473，在需氧條件下在28℃培養24小時。將8個燒瓶所得培養液在兩個裝有20L液體培養基的30L小型發酵罐中接種，每個發酵罐4個燒瓶，罐中所裝液體培養基包含10g/L酵母提取物(由Difco Co.，Ltd.生產)、10g/L聚腖(由Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.生產)、6g/L麥芽汁(由Difco Co.，Ltd.生產)和20g/L葡萄糖(由Nihon shokuhinkako Co.，Ltd.生產)，接著在28℃培養24小時。培養後，離心培養溶液收集微生物細胞。
將該微生物細胞加入9L 100mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0)中完全懸浮並分成三等份。然後，將各等份分別裝入5L小型發酵罐中。在每個發酵罐中，加入53g葡萄糖(由Nihon Shokuninkako Co.，Ltd.生產)、2g NADPH(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)和1.66g DOXE溶解於130mL DMSO而形成的溶液並在需氧條件下在40℃反應6小時。然後在反應1小時後分別再加入2g NADPH。反應後，取一部分各發酵罐的反應液，用高效液相色譜(HPLC)分析產生量。結果，總共產生3.43g DOLE(收率71％)。
離心各反應溶液並收集沉澱物。在各沉澱物中加入600mL乙腈。充分攪拌混合物後，進行離心將混合物分離成上清液和沉澱物。向沉澱物中加入200mL乙腈再懸浮和離心。合併所有的上清液並用蒸發器濃縮。濃縮後，加入600mL乙酸乙酯，溶解後接著用50mL水洗滌兩次。
將乙酸乙酯層濃縮並用矽膠柱層析純化。將400mL矽膠置於柱中並預先用2∶1己烷∶乙酸乙酯溶液平衡。然後，加入濃縮樣品和2L 2∶1己烷∶乙酸乙酯展開劑。隨後，再變換成3∶2己烷∶乙酸乙酯展開劑，加入2L進行洗脫。
將洗脫溶液分成每份200mL的部分(總共20部分)。每個部分用TLC驗證。收集檢測到存在DOLE的部分並濃縮，得到3.4g油性DOLE。純度換算其相當於2.5g DOLE。
在上面實施例2中所述的條件下進行HPLC分析來探查化合物的光學純度。就峰面積比來說，3S，5R異構體∶3R，5R異構體∶3R，5S異構體∶3S，5S異構體＝0.3∶0.2∶98.9∶0.6(98.4％de，99.4％ee)。
另一方面，收集檢測到作為主成分的3-MOLE部分的柱純化部分，獲得1.5g油性產物，將其再進行矽膠柱層析和純化獲得0.7g3R-MOLE。
進行與實施例2相同的分析，證實其光學純度為98％ee。
實施例7用5-MOLE製備DOLE除了使用表4所示的各種菌株和含1∶1 R-5MOLE和S-5MOLE的5-MOLE替代DOXE作為反應底物外，使用與實施例1相同的操作進行反應。
在產物DOLE中，從5R-MOLE產生了3S，5R異構體和3R，5R異構體，從5S-MOLE產生了3R，5S異構體和3S，5S異構體。
停止反應後，如實施例1那樣用乙酸乙酯萃取和進行TLC。隨後，使用高效液相色譜(HPLC)分析產物光學純度和產生量。
結果列於表4中。

表4


實施例8用5-MOLE製備DOLE將表5所列的各種菌株在2.5mL液體培養基中接種，所述液體培養基包含10g/L酵母提取物(由Difco Co.，Ltd.生產)、8g/L聚腖(由Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.生產)、7g/L大豆提取物HINUTE SMS(由Fuji Oil Co.，Ltd.生產)、5g/L葡萄糖(由Nihon Shokuninkako Co.，Ltd.生產)、10g/L甘油(由Kishida Chemical Co.，Ltd.生產)、1g/L磷酸鉀(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)、3g/L磷酸氫二鉀(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)、0.5g/L硫酸鎂(由KishidaChemical Co.，Ltd.生產)和10mg/L氯化錳(由Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.生產)，然後在需氧條件下於30℃培養24小時。得到的培養溶液以一次1mL的量離心並收集微生物細胞。然後，加入0.2mL 100mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)完全懸浮微生物細胞，接著與10μl50％(w/v)葡萄糖溶液、10μl 2g/L-NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)和NAD(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)的混合物以及10μl 5-MOLE的5g/L-DMSO溶液(所含的R-5MOLE和S-5MOLE的比率為1∶1)混合。充分攪拌後，在需氧條件下於30℃反應20小時。
停止反應後，如實施例1那樣用乙酸乙酯萃取和進行TLC，刮除TLC上的DOLE斑點並用200μl異丙醇洗脫。離心後，將上清液進行高效液相色譜(HPLC)分析DOLE的光學純度和產生量。
下面是HPLC的條件。
柱CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生產)洗脫液己烷/乙醇＝95/5流速1mL/min檢測UV 254nm溫度室溫結果列於表5。

表5


實施例9用5-MOLE製備DOLE將表6所列的各種菌株在2.5mL組成與實施例1所用的液體培養基相同的液體培養基中接種並在需氧條件下於27℃培養48小時。得到的培養溶液以每次1mL的量離心並收集微生物細胞。然後，加入0.2mL 100mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0)將微生物細胞完全懸浮。隨後，加入20μl 50％(w/v)葡萄糖溶液和50μl 5-MOLE的5g/L DMSO溶液(包含1∶1的R-5MOLE和S-5MOLE)並充分攪拌，接著在27℃反應20小時。
停止反應後，如實施例8那樣用乙酸乙酯萃取並進行TLC。然後，使用高效液相色譜(HPLC)分析光學純度和產生量。
結果列於表6。

表6


實施例10用5-MOLE製備DOLE將表7中所列的菌株在2mL液體培養基中接種，所述液體培養基包含10g/L酵母提取物(由Difco Co.，Ltd.生產)、5g/L營養肉湯(由Difco Co.，Ltd.生產)、3g/L大豆提取物HINUTE SMS(由Fuji Oil Co.，Ltd.生產)和15g/L葡萄糖(由Nihon Shokuhinkako Co.，Ltd.生產)，然後在需氧條件下於30℃培養24小時。將得到的培養液以一次1mL的量離心並收集微生物細胞。除了使用含1∶1R-5MOLE和S-5MOLE的5-MOLE替代DOXE作為微生物細胞的反應底物外，進行與實施例1相同的操作。
停止反應後，如實施例1那樣，用乙酸乙酯萃取和進行TLC，接著進行高效液相氣譜(HPLC)分析光學純度和產生量。結果列於表7。

表7

實施例11用5S-MOLE製備DOLE將表8中所列的各種菌株用與實施例1中相同的方式培養。以一次1mL的量離心得到的培養溶液並收集微生物細胞。然後，加入0.25mL 100mM磷酸鈉緩衝液(pH6.5)，其含5g/L葡萄糖(NihonShokuhinkako Co.，Ltd.)、60μg/L NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)和20μg/L葡萄糖脫氫酶(由Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.生產73單位/mg)，將微生物細胞充分懸浮。
在該懸浮液中，加入10μL含10g/L光學純度為73.0％ee的按照製備實施例2獲得的5S-MOLE的DMSO，接著在需氧條件下於30℃反應20小時。
停止反應後，如實施例1那樣用乙酸乙酯萃取並進行TLC。然後，使用高效液相色譜(HPLC)分析光學純度和產生量。
結果列於表8。

表8



實施例12用3R-MOLE製備DOLE將表9中所列的各種菌株在2.5mL組成與實施例1中所用液體培養基相同的液體培養基中接種並在需氧條件下於27℃下培養48小時。以一次1mL的量離心得到的培養液並收集微生物細胞。然後加入0.2mL 100mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)完全懸浮微生物細胞。隨後，加入10μL 2g/L NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)和NAD(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)、10μL 25單位/mL葡萄糖脫氫酶(由Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.生產)、10μL 50％(w/v)葡萄糖溶液和20μL實施例6製備的3R-MOLE的5g/L-DMSO溶液並充分攪拌，接著在27℃反應20小時。
停止反應後，如實施例8那樣用乙酸乙酯萃取和進行TLC。然後，使用高效液相色譜(HPLC)分析光學純度和產生量。
結果列於表9。

表9

實施例13用3R-MOLE製備DOLE將表10中所列的各種菌株在2.5mL組成與實施例1中所用的液體培養基相同的液體培養基中接種並在需氧條件下在27℃培養48小時。以每次1mL的量離心得到的培養液並收集微生物細胞。然後，加入0.2mL 100mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)完全懸浮微生物細胞。隨後，加入10μL 2g/L NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)和NAD(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)的混合溶液、20μL異丙醇和20μL實施例6中所得3R-MOLE的5g/L-DMSO溶液，充分攪拌，接著在27℃反應20小時。
停止反應後，如實施例8那樣用乙酸乙酯萃取和進行TLC。然後，使用高效液相色譜(HPLC)分析光學純度和產生量。
結果列於表10。

表10

實施例14用DOXE製備DOLE在2.5Mlxeg成與實施例1所用的液體培養基相同的液體培養基中接種紅酵母dairenensis變種IFO0415，在需氧條件下在27℃培養48小時。以1mL的量離心得到的培養液，收集微生物細胞。
此外，在2.5mL組成與實施例8所用的液體培養基相同的液體培養基中接種穀氨酸棒桿菌ATCC13826，在需氧條件下在30℃培養24小時。以1mL的量離心獲得的培養液，收集細胞。
將兩者合併，加入0.2mL 100mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0)將其完全懸浮，混合10μL 2g/L NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)和NAD(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)的混合溶液、10μL 50％(w/v)葡萄糖溶液和30μL 20g/L DOXE(DMSO溶液)並充分攪拌，接著在27℃反應18小時。
停止反應後，如實施例1那樣用乙酸乙酯萃取並進行TLC。然後，在與實施例8相同的條件下，使用高效液相色譜(HPLC)分析光學純度和產生量。結果，在該反應中只獲得3R，5S-DOLE。這裡，TLC-刮取樣品的濃度為9.5mg/L。
實施例15用DOXE製備DCOOH以與實施例1相同的方式培養表11中所列的各種菌株和進行反應。刮除TLC上相應於化合物(IV)(其為R為氫的化合物，下文簡稱為DCOOH)的斑點(展開劑己烷∶乙酸乙酯＝1∶1，Rf＝0)，然後用0.25mL異丙醇洗脫。離心後，使用高效液相色譜(HPLC)分析上清液。
下面是HPLC的條件。
柱CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生產)洗脫液己烷/乙醇/三氟乙酸＝900/100/1流速1ml/min檢測UV 254nm溫度室溫結果列於表11。

表11

實施例16用5-MOLE製備DCOOH除了使用5-MOLE替代DOXE外，以與實施例1相同的方式培養表12中所示的各種菌株。刮除TLC上相應於化合物(IV)(其為R為氫的化合物，下文簡稱為DCOOH)的斑點(展開劑己烷∶乙酸乙酯＝1∶1，Rf＝0)，然後用0.25mL異丙醇洗脫。離心後，在與實施例15相同的條件下使用高效液相色譜(HPLC)分析上清液，分析光學純度。
結果列於表12。

表12

工業適用性按照本發明，可以高光學純度有效生產3R，5S-(E)-7-[2-環丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯。
權利要求
1.一種製備下面式(IV)的化合物的方法； (其中R表示氫原子、烷基或芳基)，該方法包括用能立體選擇性還原酮基的微生物細胞和/或其細胞製品還原選自下列的化合物由下面式(I)代表的化合物 (其中R與式(IV)中的定義相同)；由下面式(II)代表的化合物 (其中R與式(IV)中的定義相同)；由下面式(III)代表的化合物 (其中R與式(IV)中的定義相同)。
2.權利要求1的化合物的製備方法，其中式(II)和(III)的化合物分別為下面式(II′)(其中R與式(IV)中的定義相同) 和下面式(III′) (其中R與式(IV)中的定義相同)代表的旋光物。
3.權利要求2的化合物的製備方法，其中由式(II′)和式(III′)表示的化合物分別由式(I)表示的化合物獲得。
4.權利要求1-3中任一項的化合物的製備方法，其中所述微生物選自梅奇酵母屬、隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬、固囊酵母屬、西洋蓍黴屬、紅酵母屬、外瓶黴屬、三角酵母屬、Shizosaccharomyces屬、擬威克酵母屬、畢赤酵母屬、復膜孢酵母屬、Saitoella屬、酵母屬、紅冬孢酵母屬、不動桿菌屬、短桿菌屬、纖維單胞菌屬、棒狀桿菌屬和短小桿菌屬。
5.權利要求4的化合物的製備方法，其中所述微生物選自梅奇酵母屬、隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬、固囊酵母屬、紅酵母屬、外瓶黴屬、Shizosaccharomyces屬、擬威克酵母屬、畢赤酵母屬、復膜孢酵母屬、Saitoella屬、酵母屬、紅冬孢酵母屬、短桿菌屬和棒狀桿菌屬。
6.權利要求1的化合物的製備方法，其中使由下面式(I)表示的化合物 (其中R與式(IV)中的定義相同)與選自隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬、西洋蓍黴屬、紅酵母屬、外瓶黴屬和三角酵母屬的微生物反應。
7.權利要求6的化合物的製備方法，其中所述微生物選自隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬和紅酵母屬。
8.權利要求1-3任一項的化合物的製備方法，其中使下面式(II)的化合物 (式中R與上面式中的定義相同)與選自梅奇酵母屬、隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬、固囊酵母屬、西洋蓍黴屬、紅酵母屬、外瓶黴屬、三角酵母屬、Shizosaccharomyces屬、擬威克酵母屬、復膜孢酵母屬、Saitoella屬、畢赤酵母屬、酵母屬、紅冬孢酵母屬、不動桿菌屬、短桿菌屬、纖維單胞菌屬、棒狀桿菌屬和短小桿菌屬的微生物反應。
9.權利要求8的化合物的製備方法，其中所述微生物選自梅奇酵母屬、隱球菌屬、假絲酵母屬、網孢菌屬、Ogataea屬、固囊酵母屬、紅酵母屬、Shizosaccharomyces屬、擬威克酵母屬、復膜孢酵母屬、Saitoella屬、畢赤酵母屬、酵母屬、紅冬孢酵母屬、短桿菌屬和棒狀桿菌屬。
10.權利要求1-3任一項的化合物的製備方法，其中使下面式(III)的化合物 (式中R與上面式中的定義相同)與選自隱球菌屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、網孢菌屬和畢赤酵母屬的微生物反應。
11.權利要求1和4-7任一項的化合物的製備方法，其中式(I)的化合物通過使下面式(A)的2-環丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-醛 與下面式(B)的化合物 (其中R代表氫原子、烷基、芳烷基或芳基)進行縮合反應而獲得。
12.權利要求11的化合物的製備方法，其中當式(I)的化合物通過式(A)化合物與式(B)化合物的縮合反應進行製備時，提供作為反應中間體的下面通式(C)的化合物或其鹽 式中R與上式中的定義相同，並且R2代表羥基、滷原子、甲矽烷氧基、磺醯氧基、醯氧基、烷氧基羰氧基、烷硫基羰氧基、烷氧基硫代羰氧基或烷硫基硫代羰氧基。
13.權利要求12的化合物的製備方法，其中通過從式(C)所示製備中間體去除R2的消去反應獲得式(I)的化合物。
14.下面通式(C)的化合物 其中R1和R2與上式中的定義相同。
全文摘要
一種製備式(IV)的化合物的方法，式(IV)中R表示氫原子、烷基或芳基，該方法的特徵在於用能立體選擇性還原酮基的微生物細胞和/或其細胞製品還原選自下列的化合物其中R與式(IV)中定義相同的式(I)所示化合物、其中R與式(IV)中定義相同的式(II)所示化合物、其中R與式(IV)中定義相同的式(III)所示化合物。
文檔編號C12P17/12GK1633502SQ0280785
公開日2005年6月29日 申請日期2002年2月1日 優先權日2001年2月2日
發明者原磨理, 詫摩勇樹, 桂田學, 細川明美, 松本陽一, 春日優三, 渡邊尚之 申請人:三菱化學株式會社, 日產化學工業株式會社